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문제 정의
- 또한, anthocyanin-rich fraction과 기존 물 추출물간의 항산화능을 in vitro 상에서 비교함과 동시에 HPLC-ABTS•+ 실시간 항산화 활성시스템을 접목하여 활성 피크를 선별하고 LC-MS/MS을 통한 활성물질 동정을 시도하고자 한다.
- 과당소비의 증가는 내당능 장애, 고인슐린혈증, 고혈압, 인슐린내성과 관련된 대사성 장해에 중요한 기여인자로서 인식되고 있다(9,10). 이에 본 연구에서는 복분자 딸기의 polyphenol성분 특히, anthocyanin을 유효성분으로 보고 다공성 합성 흡착제를 사용하여 복분자 물 추출물 내 상당 부분을 차지하고 있는 과당 및 고분자성 다당체를 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 제안하고자 한다. 또한, anthocyanin-rich fraction과 기존 물 추출물간의 항산화능을 in vitro 상에서 비교함과 동시에 HPLC-ABTS•+ 실시간 항산화 활성시스템을 접목하여 활성 피크를 선별하고 LC-MS/MS을 통한 활성물질 동정을 시도하고자 한다.
가설 설정
- 1)Positive peak are detected polyphenol at 254 nm.
- 2)Positive peaks are detected anthocyanin at 520 nm.
- 3)All values are expressed as mean±SD of triplicate determinations.
- 3)Negative peaks are ABTS•+ signal at 735 nm.
제안 방법
- LC-MS분석은 LCQ Advantage Max system(ThermoQuest, San Jose, CA, USA)을 사용하였으며 HPLC 분석 조건은 실시간 HPLC-ABTS•+ 항산화 활성 분석과 동일하였다.
- 과일 및 야채에는 비타민, 무기질, 섬유소 및 polyphenol성 항산화물질이 풍부한 반면 상당량의 과당을 포함한 당분, 색소 등이 함유되어 있다(17). 따라서, 경제적이면서 효과적으로 과당을 포함한 기타 고분자성 수용성 물질을 제거하기 위한 시도로 합성흡착제를 이용하였다. 합성흡착제는 교환기 없는 고분자 중합체로서 다공성이 뛰어나고 세공 비표면적이 크므로 vitamin류, 항생물질, steroid계, enzyme 등 각종 생리활성물질의 흡착, 분리, 정제에 주로 사용되고 있다(18).
- 또한, 실시간 HPLC ABTS•+ 활성 분석 시스템을 활용하여 6개의 항산화 능력을 갖는 활성피크를 확인할 수 있었으며 이들 대상으로 LC-MS/MS분석을 실시하여 5개의 anthocyanin인 cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-xylosylrutinoside, cyanidin-3-rutinoside, pelargonidin-3-rutinoside를 mass pattern 및 분자량 확인 과정을 통해 잠정적 화학구조 동정을 하였다.
- 물 추출물과 4종의 합성흡착제 ARF에 대한 라디칼 소거능을 통해 HP-20과 SP-850이 우수한 것으로 나타나 이들 분획물 내 물질 패턴과 항산화능을 갖는 peak를 빠른 시간에 확인하기 위해 실시간 HPLC 활성분석 시스템을 적용하였다. Fig.
- 복분자 물 추출물 분말시료를 2 g/10 mL이 되도록 용해한 다음 여과하여 준비한 후, 4종류의 합성흡착제(HP 20, SP 850, SP 700, SP 207)를 각각 3×30 cm의 컬럼에 충진하고 methanol로 충분히 세척한 다음 증류수로 안정화시켰다.
- 복분자 물 추출물과 SP 850-ARF의 anthocyanin 성분을 확인하기 위하여 LC-MS 분석을 실시하였으며 그 결과는 Fig. 3에 나타내었다. Ion source로 electrospray ionization을 사용하고 positive ion mode로 full scan 분석하여 5개의 주요 peak에 대한 [M+H]+ parent ion에 대한 분자량을 확인한 바, 각각 m/z 581, 449, 287, 595, 579로 나타났다.
- 본 실험에서는 물 추출물과 4종의 ARF에 존재하는 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량을 측정하여 비교하였다. 총 폴리페놀에 대한 표준물질로는 gallate/tannic acid/catechin 3종을, 총 플라보노이드에 대한 표준물질로는 catechin을 사용하였다.
- 분석컬럼은 Agilent ZORBAX SB-C18(3.5 µm, 4.6×150 mm i.d.) flow rate 0.8 mL/min, 컬럼 오븐온도 30℃, 이동상 5% formic acid(A)와 MeOH(B)를 사용하여 40분간 gradient(5% B→100% B)로 분석하였고 UV 520 nm에서 검출하여 분리된 크로마토그램을 얻었다.
- 용출물들은 감압농축(Büchi Rotavapor R-144, Donau, Switzerland) 및 동결건조과정을 거쳐 anthocyanin-rich fraction(ARF) 즉, HP20-ARF, SP-207-ARF, SP-700-ARF, SP-850-ARF을 얻었으며 각각의 수율(%)을 계산하였다.
- 따라서 작은 분자 즉 분자량 <1,500 Da의 흡착을 선택적으로 할 수 있으며 흡착 능력이 우수하다. 우리는 물 추출물을 대상으로 4개의 합성흡착제를 이용한 컬럼을 실시하였고, 그 수율 결과를 Table 1에 나타내었다.
- 실험에 사용되는 luminol은 photosensitizer 및 oxygen radical detection reagent로서 작용하였다. 적당한 농도로 희석한 시료와 sample solvent, reaction buffer, luminol solution을 순서대로 첨가하고 vortex로 잘 혼합한 다음 3분간 반응을 모니터링 한 결과를 나타내었다. 즉, lag time(lag-lag(0))을 표준검량 비교물질로 사용되는 ascorbate의 lag time과 비교하여 시료의 superoxide 라디칼 소거능을 ascorbate에 상응하는 소거농도로 자동 산출되어 표시하였다.
- 전자공여능 측정은 DPPH에 대한 수소공여 효과를 측정하여 전자공여능을 나타내었다. 일정 농도로 희석된 시료에 DPPH 용액(dissolved in 99% ethanol)을 가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다.
- 적당한 농도로 희석한 시료와 sample solvent, reaction buffer, luminol solution을 순서대로 첨가하고 vortex로 잘 혼합한 다음 3분간 반응을 모니터링 한 결과를 나타내었다. 즉, lag time(lag-lag(0))을 표준검량 비교물질로 사용되는 ascorbate의 lag time과 비교하여 시료의 superoxide 라디칼 소거능을 ascorbate에 상응하는 소거농도로 자동 산출되어 표시하였다.
- 4 mL를 가하여 완전히 혼합하여 반응시킨 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로 (+)-catechin을 사용했으며, 표준시약의 농도를 달리하여 조제한 후 표준검량 곡선을 작성하였다.
- 0 mL 첨가하고 증류수 7 mL을 첨가해 최종 volume 10 mL을 맞춘 다음 암실에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 ELISA reader(EL 800 Universal Microplate Reader, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)기를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로 gallate, tannic acid, (+)-catechin을 사용했으며, 각 표준시약의 농도를 달리하여 조제한 후 표준검량곡선을 작성하였다.
대상 데이터
- 당 및 고분자성 다당체 제거를 위한 합성흡착제 HP-20, SP-850, SP-700, SP-207은 Yiryoong Chemical®(Bucheon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 복분자는 2008년 강원도 횡성에서 직접 채취한 후 냉동 보관하여 시료로 사용하였다. 실험에 사용된 FolinCiocalteu reagent, Na2CO3, gallate, tannic acid, (+)-catechin, sodium nitrite, sodium hydroxide, 1,1-diphenyl-2-picrylhdyrazyl(DPPH), ascorbate, 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)는 Sigma(St.
- 이는 photosensitizer의 optical excitation에 의해 생성된 superoxide anion radical의 소거효과를 측정하는 법으로서 Photochem(Analytik Jena AG, Jena, Germany)장비를 이용하였다. 실험에 사용되는 luminol은 photosensitizer 및 oxygen radical detection reagent로서 작용하였다. 적당한 농도로 희석한 시료와 sample solvent, reaction buffer, luminol solution을 순서대로 첨가하고 vortex로 잘 혼합한 다음 3분간 반응을 모니터링 한 결과를 나타내었다.
- 실험에 사용된 FolinCiocalteu reagent, Na2CO3, gallate, tannic acid, (+)-catechin, sodium nitrite, sodium hydroxide, 1,1-diphenyl-2-picrylhdyrazyl(DPPH), ascorbate, 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서는 물 추출물과 4종의 ARF에 존재하는 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량을 측정하여 비교하였다. 총 폴리페놀에 대한 표준물질로는 gallate/tannic acid/catechin 3종을, 총 플라보노이드에 대한 표준물질로는 catechin을 사용하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 3종의 표준물질에 따라 페놀 함량 차이가 뚜렷하게 나타났으며 가장 많이 이용되고 있는 catechin을 기준으로 했을 때 가장 높은 폴리페놀 함량이 산출되었으며 다음으로 tannic acid, gallate 순서의 경향을 보였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 및 분석에 사용되는 methanol, ethanol은 HPLC용으로 Fisher Scientific(Fair Lawn, NJ, USA), formic acid는 Applichem GmbH(Darmstadt, Germany)으로부터 HPLC급으로 구입하여 사용하였다. 당 및 고분자성 다당체 제거를 위한 합성흡착제 HP-20, SP-850, SP-700, SP-207은 Yiryoong Chemical®(Bucheon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 복분자 물 추출물과 4종의 ARF 시료에 대한 항산화능을 photochemiluminescence(PCL)법으로 비교 측정하였다(15). 이는 photosensitizer의 optical excitation에 의해 생성된 superoxide anion radical의 소거효과를 측정하는 법으로서 Photochem(Analytik Jena AG, Jena, Germany)장비를 이용하였다.
- 실시간 활성 측정법은 Koleva의 방법(16)을 참조하여 Thermo Electron Spectra HPLC system과 pinnacle pump(Pickering Lab, LCTech, Dorpen, Germany)를 사용하였다. 분석컬럼은 Agilent ZORBAX SB-C18(3.
- 복분자 물 추출물과 4종의 ARF 시료에 대한 항산화능을 photochemiluminescence(PCL)법으로 비교 측정하였다(15). 이는 photosensitizer의 optical excitation에 의해 생성된 superoxide anion radical의 소거효과를 측정하는 법으로서 Photochem(Analytik Jena AG, Jena, Germany)장비를 이용하였다. 실험에 사용되는 luminol은 photosensitizer 및 oxygen radical detection reagent로서 작용하였다.
- 총 폴리페놀의 함량은 Folin-Ciocalteu법을 사용해 측정하였다(11,12). 건조 시료 10 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 일정농도로 희석하여 측정에 이용하였다.
- 총 플라보노이드의 함량은 colorimetric법(13)을 사용해 측정하였다. 일정 농도의 시료 1 mL에 증류수 4 mL를 첨가하여 희석하고 5% NaNO2 0.
성능/효과
- Fig. 3. HPLC-ESI-MS chromatograms of anthocyanins recorded at 520 nm (A), total ion chromatography (B), molecular ion selected ion plots of the five major anthocyanins detected 1-5 (C) and full scan mass spectra (D) in Rubus coreanus sample. peaks: 1.
- 4종류의 다공성 합성흡착제(Sepabeads 207, 700, 850, Diaion HP 20)를 사용하여 Rubus coreanus 과실의 물 추출물로부터 과당 및 비polyphenol성분을 효과적으로 제거하여 DPPH라디칼 소거능 및 화학 발광법을 이용한 superoxide 라디칼 소거능이 증가된 농축물을 효율적으로 얻을 수 있었다. 또한, 실시간 HPLC ABTS•+ 활성 분석 시스템을 활용하여 6개의 항산화 능력을 갖는 활성피크를 확인할 수 있었으며 이들 대상으로 LC-MS/MS분석을 실시하여 5개의 anthocyanin인 cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-xylosylrutinoside, cyanidin-3-rutinoside, pelargonidin-3-rutinoside를 mass pattern 및 분자량 확인 과정을 통해 잠정적 화학구조 동정을 하였다.
- 총 폴리페놀에 대한 표준물질로는 gallate/tannic acid/catechin 3종을, 총 플라보노이드에 대한 표준물질로는 catechin을 사용하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 3종의 표준물질에 따라 페놀 함량 차이가 뚜렷하게 나타났으며 가장 많이 이용되고 있는 catechin을 기준으로 했을 때 가장 높은 폴리페놀 함량이 산출되었으며 다음으로 tannic acid, gallate 순서의 경향을 보였다. 하지만, 3종의 표준물질 모두에서 4종의 ARF는 물 추출물에 비해 10-20배 가량의 농축효과가 나타났으며, 그 중 SP 850-ARF에서 가장 효과적으로 농축되었음을 확인하였다.
- UV 520 nm에서 5개의 뚜렷한 anthocyanin peak가 관찰되었으며 peak 1+2의 negative peak 면적값이 ARC가 0.36×106인 반면에 HP 20-ARF(1.50×106), SP 850-ARF(2.00×106)와 비교하여 HP 20 흡착제에 의한 농축물은 약 4.17배, SP 850 흡착제에 의한 농축물은 5.56배 항산화효능이 증가하였으며, peak 3, 4, 5에 대해서는 HP 20-ARF에서는 각각 4.93, 14.15, 3.64배 증가하였으며, SP 850-ARF은 각각 4.91, 13.91, 8.00배 가량 농축됨을 알 수 있었다.
- 그 다음 총 플라보노이드 함량은 Table 2에서 보는 바와 같이 ARC의 플라보노이드 함량이 30±10 mg/g으로 가장 낮았으며, SP 850-ARF가 370±20으로 가장 높음을 알 수 있었다.
- 물 추출물 2 g당 SP 850는 48.13 mg(2.41%), SP 207은 79.39 mg(3.97%), SP 700은 100.36 mg(5.02%), HP 20은 110.80 mg(5.54%)로 나타나 복분자의 경우는 HP 20-ARF가 가장 수율이 높은 흡착제임을 알 수 있었다.
- Peak 2-5에서도 각각의 분자량에 대한 UV-vis pattern와 fragment ion을 비교하여 cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-xylosylrutininoside, cyanidin-3-rutinoside, pelargonidin-3-rutinoside로 확인되었으며(Table 5) peak 1-4는 cyanidin(m/z 287)을 전구체로 하는 anthocyanin임을 알 수 있었다. 본 연구에서 관찰된 anthocyanin들은 복분자 딸기로부터 보고된 기존 문헌과 일치하는 것으로 확인되었다(21).
- 또한, 실시간 HPLC ABTS•+ 활성 분석 시스템을 활용하여 6개의 항산화 능력을 갖는 활성피크를 확인할 수 있었으며 이들 대상으로 LC-MS/MS분석을 실시하여 5개의 anthocyanin인 cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-xylosylrutinoside, cyanidin-3-rutinoside, pelargonidin-3-rutinoside를 mass pattern 및 분자량 확인 과정을 통해 잠정적 화학구조 동정을 하였다. 수율과 항산화 효능을 고려해 볼 때, 4종의 합성흡착제 중에서 Diaion HP 20이 가장 우수한 결과를 나타내었다. 이처럼 적절한 합성흡착제의 선택으로 표적물질에 대한 polyphenol성 물질의 농축뿐만 아니라 생리학적 활성증대효과를 가져올 수 있어 적절한 합성흡착제의 선택은 식품 및 의약품의 정제 및 분리에 유용하게 활용될 수 있음이 확인되었다.
- 36배(HP 20) 높은 라디칼 소거효과를 나타내었다. 이 중에서 HP 20이 가장 우수한 라디칼 소거능을 갖는 흡착제임을 알 수 있었다.
- 특히, HP 20-ARF에서 가장 우수한 superoxide 라디칼 소거능을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 당 및 기타 고분자성 성분 제거에 따라 복분자 내 유효성분의 농축에 기인한 활성 증가를 확인할 수 있었다.
- 33배 농축되었음을 알 수 있었다. 이처럼 SP 850-ARF에서 폴리페놀과 플라보노이드가 가장 효과적으로 농축되었음을 알 수 있었다.
- 수율과 항산화 효능을 고려해 볼 때, 4종의 합성흡착제 중에서 Diaion HP 20이 가장 우수한 결과를 나타내었다. 이처럼 적절한 합성흡착제의 선택으로 표적물질에 대한 polyphenol성 물질의 농축뿐만 아니라 생리학적 활성증대효과를 가져올 수 있어 적절한 합성흡착제의 선택은 식품 및 의약품의 정제 및 분리에 유용하게 활용될 수 있음이 확인되었다.
- 13 µg/mL에 상응하는 라디칼 소거능을 나타내었다. 특히, HP 20-ARF에서 가장 우수한 superoxide 라디칼 소거능을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 당 및 기타 고분자성 성분 제거에 따라 복분자 내 유효성분의 농축에 기인한 활성 증가를 확인할 수 있었다.
- Table 2에서 보는 바와 같이 3종의 표준물질에 따라 페놀 함량 차이가 뚜렷하게 나타났으며 가장 많이 이용되고 있는 catechin을 기준으로 했을 때 가장 높은 폴리페놀 함량이 산출되었으며 다음으로 tannic acid, gallate 순서의 경향을 보였다. 하지만, 3종의 표준물질 모두에서 4종의 ARF는 물 추출물에 비해 10-20배 가량의 농축효과가 나타났으며, 그 중 SP 850-ARF에서 가장 효과적으로 농축되었음을 확인하였다.
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