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문제 정의
- 본 실험에서는 복분자를 30% 에탄올로 초음파를 이용하여 추출한 복분자 추출물이 면역증진의 효과를 보이는지 확인하기 위하여 RAW264.7 mouse macrophage cells에서 실험을 진행하였다. 복분자 추출물이 세포의 활성변화에 크게 영향을 주지 않는 범위내에서 실험하기 위하여 WST assay를 통하여 50～200μg/ml의 농도를 설정하여 실험을 진행하였다.
- 이에 본 실험에서는 수율을 높이기 위하여 복분자를 30% 에탄올로 추출하여 RAW264.7 mouse macrophage cells에 처리하여 면역반응시 일어나는 지표들의 변화를 확인함으로서 복분자의 면역증진효과를 확인하였다.
제안 방법
- 복분자 추출물을 처리 후 얻은 세포를 PBS로 세척하고 RIPA buffer로 용해한 후 원심분리하여 단백질을 얻었다. 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 분리한 다음, 단백질을 nitrocellulose membrane에 전이시키고 특정 항체를 처리한 뒤 필름에 현상하여 특정 단백질 띠를 찾았다.
- 100π dish에 1×106으로 분주한 세포에 복분자 추출물을 50, 100, 200μg/ml의 농도로 처리한 후 1시간 뒤에 LPS를 1μg/ml의 농도로 처리하여 주었다.
- 본 실험에서 사용한 약재인 복분자는 옴니허브 (Korea)에서 구입하여 100g 정량 후 1L의 30%에탄올에 30분 동안 초음파분해 하였다. 3 mm 여과지((Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압하여 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물을 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결건조(Freezedryer, Matsushita, Japan)하였다. 얻은 분말은 -80℃에서 보관하고 실험시 3차 증류수에 200mg/ml 농도로 녹인 후 사용하였다.
- IL-1β와 IL-6를 ELISA kit를 이용하여 450nm 에서의 흡광도를 측정하여 각 cytokine의 배양액 내 농도를 확인하였다.
- 분리해낸 RNA의 1μg을 cDNA synthesis를 이용하여 cDNA를 합성한다. cDNA 합성 후 각 프라이머와 합성한 cDNA로 denature 94℃ 45초, annealing 58℃ 35초, extention 72℃ 45초로 26주기로 RT-PCR을 수행하였다. 이때 사용한 각 프라이머는 table 1과 같다.
- 그 후 WST 시약을 10μl 첨가하고 2시간 후에 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 의 세포를 각 well 당 분주하였다. 복분자 추출물과 LPS 처리 후 24시간 뒤에 배양액만 회수하여 분석에 사용하였다. IL-1β와 IL-6를 ELISA kit를 이용하여 450nm 에서의 흡광도를 측정하여 각 cytokine의 배양액 내 농도를 확인하였다.
- 복분자 추출물에 의한 면역기능증진효과를 알아보기 위하여 우선 NO와 ROS의 변화를 측정하였다. 외부 침입물에 대한 식세포의 식작용이 일어나면서 ROS와 NO가 증가되고 면역세포들이 활성화되고,16) ROS는 NO와 함께 작용을 하는 경향이 있다.
- 복분자 추출물의 농도가 높으면 세포활성을 줄여주게 되므로 앞으로의 실험에서 200μg/ml 이하의 농도로 실험을 수행하였다.
- 복분자 추출물이 RAW264.7 cell line에 대한 세포독성과 세포활성에의 영향을 알아보기 위하여 WST assay로 그 변화를 관찰하였다. 이 결과(Fig 1)를 통해 복분자 추출물에 의해 세포의 활성이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인해볼 수 있었다.
- 복분자 추출물이 세포의 활성변화에 크게 영향을 주지 않는 범위내에서 실험하기 위하여 WST assay를 통하여 50～200μg/ml의 농도를 설정하여 실험을 진행하였다.
- 본 실험은 복분자의 30% 에탄올 추출물에 의한 면역증진효과를 확인하기 위하여 복분자 추출물을 RAW264.7 mouse 대식세포에 농도별로 24시간 동안 처리하여 변화양상을 관찰하였다.
- 추출물을 처리할 때 DCFH-DA를 1μg/ml의 농도로 같이 처리하여 주고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 걷은 뒤 PBS로 2회 씻어준 후 FACScalibur(BD bioscience, USA)로 세포내 ROS를 측정하였다.
- 세포를 배양한 배양액을 회수하여 griess rea gent를 이용하여 96well plate에 증류수 150μl와 시약 20μl, 샘플 150μl를 loading 하여 30분간 반응시킨 후 585nm에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.
- 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS와 1%의 Antibiotic-antimycotic이 포함된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배지를 사용하였으며 2일 1회 배지를 교환하였다.
- 앞에서 NO와 ROS, COX-2와 iNOS를 확인하였으므로 세포내 신호전달 단백질인 MAPKs를 확인해보았다. MAPKs는 3가지 주된 그룹으로 나눌 수 있는데 p38, ERK, JNK가 그것이다.
대상 데이터
- RAW264.7 cell은 한국 세포주 은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS와 1%의 Antibiotic-antimycotic이 포함된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배지를 사용하였으며 2일 1회 배지를 교환하였다.
- 세포활성을 측정하는 WST 시약으로 EZCyTox(DOGEN, Korea)를 구입하였고, 프라이머는 코스모진텍(Korea)에서 제작하였으며, cytokines을 측정하기 위하여 ELISA kit를 BD bioscience(USA)에서 구입하였다. western blot을 수행하기 위한 antibody는 santa cruz(USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 약재인 복분자는 옴니허브 (Korea)에서 구입하여 100g 정량 후 1L의 30%에탄올에 30분 동안 초음파분해 하였다. 3 mm 여과지((Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압하여 여과한 후, 여과된 에탄올 추출물을 감압농축기(Eyela, Japan)를 이용하여 농축한 후, 동결건조(Freezedryer, Matsushita, Japan)하였다.
- 세포의 활성을 유도하기 위한 lipopolysaccharide(LPS)와 ROS를 측정하는 DCFH-DA는 sigma(USA) 제품을 사용하였으며, NO 측정에 사용한 Griess reagent는 invitrogen(USA)의 제품을 사용하였고, RT-PCR을 수행하기 위하여 Intron(Korea)에서 RNA extraction kit를, Takara(Japan)에서 cDNA 합성 kit를 구매하여 사용하였다. 세포활성을 측정하는 WST 시약으로 EZCyTox(DOGEN, Korea)를 구입하였고, 프라이머는 코스모진텍(Korea)에서 제작하였으며, cytokines을 측정하기 위하여 ELISA kit를 BD bioscience(USA)에서 구입하였다.
- 세포의 활성을 유도하기 위한 lipopolysaccharide(LPS)와 ROS를 측정하는 DCFH-DA는 sigma(USA) 제품을 사용하였으며, NO 측정에 사용한 Griess reagent는 invitrogen(USA)의 제품을 사용하였고, RT-PCR을 수행하기 위하여 Intron(Korea)에서 RNA extraction kit를, Takara(Japan)에서 cDNA 합성 kit를 구매하여 사용하였다. 세포활성을 측정하는 WST 시약으로 EZCyTox(DOGEN, Korea)를 구입하였고, 프라이머는 코스모진텍(Korea)에서 제작하였으며, cytokines을 측정하기 위하여 ELISA kit를 BD bioscience(USA)에서 구입하였다. western blot을 수행하기 위한 antibody는 santa cruz(USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 Mean(평균) ± S.E(표준오차)로 요약하였으며, student t-test method로 분석하여 p-value가 0.05이하일 경우 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 20) MAPKs는 NO, cytokines, 병원체 등에 의해 활성화되어 COX-2, cytokines 등을 생성하고 세포 활성, 분화 등을 조절하는 역할을 한다.21) MAPKs의 활성을 확인하여 위하여 western blot 방법으로 각 단백질들을 확인하였다. Fig 4의 결과에 의하면 MAPKs의 인산화형이 증가되어 있는 것을 알 수 있다.
- Cells were treated with RC extract (10-500μg/mL) for 24 hours. Cell viability was determined using the WST assays. Results are expressed as a percentage viability relative to vehicle-treated controls.
성능/효과
- 17) 배양액에 분비되어 있는 NO의 농도를 측정한 결과 50μg/ml의 농도에서부터 세포를 LPS로 자극시켰을 때와 비슷한 농도로 NO가 발현되어 있음을 확인할 수 있다(Fig 2A).
- COX-2는 NO에 의해 활성화되며 면역반응을 위한 PGE2를 생성하며,18) NO는 iNOS에 의해 합성되고 iNOS는 면역반응을 위해 활성화된다.19) RT-PCR을 통하여 COX-2와 iNOS의 mRNA 발현이 복분자 추출물에 의해 증가되어있음을 확인할 수 있다. LPS로 자극하여 준 그룹에 비해 그 발현양이 작지만 발현이 되어 있음을 볼 수 있다.
- 23) RTPCR을 확인한 결과(Fig 5A) IL-1β는 50μg/ml 에서부터 mRNA가 많이 발현되어 있으며 cytokine 또한 control 그룹에 비하여 세포배양액에 분비되어 있는 농도가 높은 것을 관찰할 수 있다.
- COX-2와 iNOS를 확인한 실험에서도 mRNA는 많이 발현되지 않았지만 iNOS가 200μg에서 많이 생성되었음을 알 수 있었다.
- NO뿐만 아니라 ROS 또한 세포내 농도가 올라가 있는 것을 확인할 수 있는데(Fig 2B), ROS는 NO와 다르게 50μg/ml에서부터 높게 발현되지는 않고 50, 100, 200μg/ml일 때, 각각 13.05, 16.94, 38.70%로 농도의존적으로 차츰 증가하였음을 확인하였다.
- 70%로 복분자 추출물의 농도가 증가함에 따라 점차 증가하는 것을 확인하여 복분자 추출물이 면역반응을 활성화시킴을 추측할 수 있었다. NO에 의해 활성화되는 COX-2와 NO를 생성하는 iNOS의 변화를 RT-PCR과 western blot으로 확인해본 결과 농도의존적으로 COX-2와 iNOS mRNA의 발현양이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 그러나 COX-2의 단백질 발현의 변화는 확인할 수 없었으나, iNOS는 50과 100μg/ml에서 약하게 발현되다가 200μg/ml에서 많이 발현되어 있음을 볼 수 있었다.
- 또한 세포의 활성과 분화를 촉진시키는 신호전달단백질인 MAPKs 중 ERK와 p38의 인산화형이 복분자의 농도에 따라 점진적으로 증가되어 있음을 관찰할 수 있었고, 면역반응시에 증가되는 전염증성 cytokine인 IL-1β와 IL-6의 mRNA와 분비량이 control 그룹에 비해 증가되어 있음을 ELISA를 통하여 확인할 수 있다.
- 먼저 NO와 ROS의 생성을 확인한 결과 NO 가 낮은 농도에서부터 크게 증가하였고, 세포내의 ROS가 농도에 따라 변화하는 것을 확인하였다. COX-2와 iNOS를 확인한 실험에서도 mRNA는 많이 발현되지 않았지만 iNOS가 200μg에서 많이 생성되었음을 알 수 있었다.
- 면역반응시에 증가하는 NO와 ROS를 측정한결과 50μg/ml 농도에서부터 LPS로 자극한 경우와 비슷한 NO의 생성 수준을 보였으며, 세포내 ROS의 생성량을 FACScalibur를 통하여 분석하였을 때 세포내에 생성된 ROS가 13.05, 16.94, 38.70%로 복분자 추출물의 농도가 증가함에 따라 점차 증가하는 것을 확인하여 복분자 추출물이 면역반응을 활성화시킴을 추측할 수 있었다.
- COX-2와 iNOS를 확인한 실험에서도 mRNA는 많이 발현되지 않았지만 iNOS가 200μg에서 많이 생성되었음을 알 수 있었다. 면역반응시에 활성화되는 MAPKs 또한 추출물 처리시에 활성화되었음을 확인할 수 있었고, 전염증성 cytokines의 mRNA 발현과 분비량도 유의성있게 증가하였다.
- 7 cell line에 대한 세포독성과 세포활성에의 영향을 알아보기 위하여 WST assay로 그 변화를 관찰하였다. 이 결과(Fig 1)를 통해 복분자 추출물에 의해 세포의 활성이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인해볼 수 있었다. 복분자 추출물의 농도가 높으면 세포활성을 줄여주게 되므로 앞으로의 실험에서 200μg/ml 이하의 농도로 실험을 수행하였다.
- 또한 세포의 활성과 분화를 촉진시키는 신호전달단백질인 MAPKs 중 ERK와 p38의 인산화형이 복분자의 농도에 따라 점진적으로 증가되어 있음을 관찰할 수 있었고, 면역반응시에 증가되는 전염증성 cytokine인 IL-1β와 IL-6의 mRNA와 분비량이 control 그룹에 비해 증가되어 있음을 ELISA를 통하여 확인할 수 있다. 이 결과들을 종합하여 본 결과 복분자 추출물이 RAW264.7 cell에서 면역증진효과를 지닌다는 것으로 추측할 수 있고, 그 활성 정도가 추출물의 농도에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 본 실험에 의한 복분자 추출물의 면역증진 기대효과를 확인해 본 결과, 면역시 일어나는 일련의 반응들을 활성화시키는 것을 확인함으로써 30% 에탄올에 의한 복분자의 추출물의 면역증진효과로 면역결핍질환의 완화와 치료효과를 보일 수 있을 것으로 기대된다. 추후 동물실험을 통한 효과 검증과 면역세포를 활용한 면역증진효과를 확인과 분석을 앞으로 더 연구해야 할 것으로 생각된다.
- 이에 본 실험에서 사용한 복분자 추출물은 면역반응과 관련된 일련의 과정들을 활성화시키는 효과를 지니고 있으므로 면역결핍질환의 개선에 도움이 될 것으로 기대된다.
- 본 실험에 의한 복분자 추출물의 면역증진 기대효과를 확인해 본 결과, 면역시 일어나는 일련의 반응들을 활성화시키는 것을 확인함으로써 30% 에탄올에 의한 복분자의 추출물의 면역증진효과로 면역결핍질환의 완화와 치료효과를 보일 수 있을 것으로 기대된다. 추후 동물실험을 통한 효과 검증과 면역세포를 활용한 면역증진효과를 확인과 분석을 앞으로 더 연구해야 할 것으로 생각된다.
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