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문제 정의
- 본 논문은 장알균이 흔히 분리되는 하천이나 하수에서 장알균 특이적인 새로운 박테리오파지를 분리하고 파지의 형상, 숙주특이성과 유전학적 특성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 4개의 파지가 서로 유사한 것으로 판단됨에 따라, 그 중 가장 사멸능이 좋은 것으로 나타난ECP3 파지를 선택하여 장알균, 포도알균 등의 그람 양성균과 녹농균, 아시네토박터, 장내세균 등의 그람 음성균들을 대상으로 spot test를 실시하여 숙주범위를 재확인하였다. 43주의 E.
- Enterococcus faecalis는 그람 양성의 조건 혐기성 세균으로 원내감염의 주요 원인균 중의 하나이다. E. faecalis에 특이적인 신규 박테리오파지 ECP3를 환경에서 분리하여 형태와 유전적 특성을 규명하였다. ECP3 파지는 형태적으로 수축성 꼬리를 갖는 미오비리대 과에 속하며 E.
- PCR 산물은 1% 한천 겔을 준비하여 전기영동하고 ethidium bromide 수용액으로 염색한 후, 겔도큐멘트 시스템(Gel Doc, Bio-Rad)을 사용하여 관찰하고 이미지를 저장하여 DNA 밴드 양상을 서로 비교하였다(Gutiérrez et al., 2011).
- Phage DNA Isolation Kit (Norgen)를 사용하여 박테리오파지의 genomic DNA를 분리한 후, 추출한 DNA를 주형으로 하고 OPL5 (5'-ACGCAGGCAC-3'),RAPD5 (5'-AACGCGCAAC-3'), P1 (5'-CCGCAGCCAA-3'), P2 (5'-AACGGGCAGA-3') 등 네 종의 단일 primer를 이용하여 다음의 조건으로 PCR을 실시하였다[94℃ 45초, 30℃ 120초, 72℃ 60초(4회 반복), 94℃ 5초, 36℃ 30초, 72℃ 30초(26회 반복), 75℃ 10분(1회)].
- 이러한 결과를 조합하니 10개의 파지를 4그룹으로 나눌 수 있었다(a1b1c1d1, a2b2c2d1, a1b3c3d2, a1b4c3d2). RAPD PCR 결과에 의해 분류된 4종류의 파지 그룹별로 한 개씩 선택된 4종(ECP3, ECP4, ECP6, ECP8)의 파지를 대상으로 파지의 숙주범위와 형태를 확인하였다. 4종의 파지 모두 E.
- Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) typing result. RAPD typing reactions were performed by using four single primers,OPL5 (A), RAPD (B), P1 (C), and P2 (D), respectively. Each indistinguishable band pattern was assigned for the differentiation of ten isolated bacteriophages (ECP1∼ECP10).
- 각 박테리오파지 lysate내의 용혈성 박테리오파지의 존재유무를 확인하기 위하여, 기질 숙주로 사용한 균액을 고형배지에 도말한 후, 각각의 박테리오파지 lysate로 spot test를 실시하여 장알균에 대한 사멸능을 판정하였다.
- 간단히 기술하면, 숙주 부착능 결정은 Luria Bertani broth (LB)에 배양한 지수기의 숙주 세균(5 × 109CFU/ml)에0.0001 MOI의 파지를 감염시킨 후, 5분 간격으로 샘플을 회수하여 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 상층액으로 plaque assay를 수행하였다.
- 박테리오파지의 유전적 동일성 또는 유전형의 비교를 위하여 분리된 파지를 대상으로 randomly amplified of polymorphic DNA-PCR을 시행하였다. Phage DNA Isolation Kit (Norgen)를 사용하여 박테리오파지의 genomic DNA를 분리한 후, 추출한 DNA를 주형으로 하고 OPL5 (5'-ACGCAGGCAC-3'),RAPD5 (5'-AACGCGCAAC-3'), P1 (5'-CCGCAGCCAA-3'), P2 (5'-AACGGGCAGA-3') 등 네 종의 단일 primer를 이용하여 다음의 조건으로 PCR을 실시하였다[94℃ 45초, 30℃ 120초, 72℃ 60초(4회 반복), 94℃ 5초, 36℃ 30초, 72℃ 30초(26회 반복), 75℃ 10분(1회)].
- 광주천 샘플, 금호강 샘플 및 계분장 침출수를 대상으로 여러 차례의 파지 증폭을 시도한 결과, 장알균을 기질 숙주로 하는 박테리오파지는 계분장의 침출수에서만 분리되었으며, 이중 10개의 순수 파지 lysate를 확보하였다. 순수 분리된 파지의 동일성 여부를 확인하기 위하여 파지의 숙주 범위 확인과 게놈DNA의 RAPD-PCR을 시행하였다. OPL5 primer로는 a1과 a2, RAPD primer로는 b1∼b4, P1 primer로는 c1∼c3, 그리고 P2 primer로는 d1과 d2 밴드 패턴으로 구별되었다(Fig.
- 위 단계를 3–4번 반복하여 순수 박테리오파지를 분리하였다. 순수 분리된 파지의 숙주범위를 확인하기 위하여 장알균, 포도알균 등의 그람양성균과 녹농균, 아시네토박터, 장내세균 등의 그람음성균들을 대상으로 spot test를 실시하였다.
- 약 1012pfu/ml의 순수 분리된 파지를 탄소로 코팅된 구리판에 바른 후, 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하고 주사전자현미경(Hitachi-7000)을 사용하여 관찰하였다.
- 증폭된 파지 lysate를 회수하여 Phage DNA Isolation Kit(Norgen)를 사용하여 파지의 게놈 DNA를 확보하였다. 파지의 전체 게놈 염기서열은 (주)천랩에 의뢰하여 실시하였다.
- 증폭된 파지 lysate를 회수하여 Phage DNA Isolation Kit(Norgen)를 사용하여 파지의 게놈 DNA를 확보하였다. 파지의 전체 게놈 염기서열은 (주)천랩에 의뢰하여 실시하였다. 전체 염기서열 분석방법은 454 (GS Assembler 2.
- 파지의 증식능 5 × 109CFU/ml 농도의 숙주 세균에 0.0001 MOI의 파지를 감염시킨 후, 4℃에서 30분간 두어 파지가 세균에 흡착되도록 한 후, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리를 시행하고, 침전물을 10 ml의 LB에 부유시킨 후 37℃에 넣어 두고, 5분 간격으로 샘플을 취하여 plaque assay 를 실시하였다(Rahman et al., 2011).
- 하룻동안 정체배양 후 배양액에 chloroform을 10%(vol/vol)되도록 첨가하여 세균을 사멸시키고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm syringe filter을 이용하여 순수 박테리오파지 lysate를 확보하였다.
- 혼합 배양액에 chloroform을 10% (v/v)되게 첨가하여 세균을 사멸시키고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm syringe filter에 통과시켜 박테리오파지 lysate를 확보하였다.
대상 데이터
- 광주천과 금호강에서 각각 5건씩 총 10건의 액상 환경샘플과 계분장의 침출수 24건 등을 포함하여 총 34건의 환경 샘플을 수집하였다. 환경 샘플은 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 부유물을 제거한 후, 상층액을 사용하였다.
- 9%이었다. 다섯 개의 tRNA 유전자를 포함하여 220개의 open reading frame (ORF)으로 구성되어 있었다(Fig. 4). 220개의 ORF 중 36개가 유전자 산물의 기능을 유추할 수 있었으나 나머지는 기능을 알 수 없는 hypothetical protein이었다.
- 박테리오파지의 숙주 부착능과 증식능의 결정을 위하여 Rahman 등(2011)의 방법을 사용하였다. 숙주 균주로는 E.faecalis 10K28 균주를 사용하였으며, 숙주세균과 박테리오파지 농도는 0.0001 MOI (multiplicity of infection)가 되도록 하였다. 간단히 기술하면, 숙주 부착능 결정은 Luria Bertani broth (LB)에 배양한 지수기의 숙주 세균(5 × 109CFU/ml)에0.
- 장알균에 특이적인 박테리오파지 분리를 위한 기질숙주로 경북대학교 병원 임상에서 분리된 E. faecalis 5주와 E. faecium 5주를 사용하였다. Tryptic soy broth (TSB)에 균주를 접종하고 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 일정 균액을 취하여 새로운 TSB에 접종 후, 대수증식기에 도달할 때까지 배양한 균주를 기질 숙주로 사용하였다.
이론/모형
- RAPD-PCR 결과에서 서로 다른 밴드 양상을 나타낸 박테리오파지를 대상으로 파지의 장알균 사멸능을 확인하기 위하여 plaque assay를 실시하였다(Rahman et al., 2011). 먼저 3 ml의 0.
- 박테리오파지의 숙주 부착능과 증식능의 결정을 위하여 Rahman 등(2011)의 방법을 사용하였다. 숙주 균주로는 E.
- 파지의 전체 게놈 염기서열은 (주)천랩에 의뢰하여 실시하였다. 전체 염기서열 분석방법은 454 (GS Assembler 2.6)와 Illumina sequencing platforms (CLC genomics workbench 5.5)의 혼합방법을 이용하였으며, CodonCode Aligner 3.7.1.을 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- 4개의 파지가 서로 유사한 것으로 판단됨에 따라, 그 중 가장 사멸능이 좋은 것으로 나타난ECP3 파지를 선택하여 장알균, 포도알균 등의 그람 양성균과 녹농균, 아시네토박터, 장내세균 등의 그람 음성균들을 대상으로 spot test를 실시하여 숙주범위를 재확인하였다. 43주의 E. faecalis 중 40주에 대해서 사멸능을 나타내었으며, E. faecium을 포함한 다른 모든 균종에 대해서는 사멸능을 나타내지 않았다(Table 1). 앞선 보고에서도 E.
- RAPD PCR 결과에 의해 분류된 4종류의 파지 그룹별로 한 개씩 선택된 4종(ECP3, ECP4, ECP6, ECP8)의 파지를 대상으로 파지의 숙주범위와 형태를 확인하였다. 4종의 파지 모두 E. faecalis에만 사멸능을 보였으며, E. faecium (14주), 포도알균(11주), 및 그람 음성 세균(녹농균, 아시네토박터, 대장균, 크렙시엘라, 엔테로박터, 시트로박터, 세라티아, 살모넬라 등 총 15주)은 사멸시키지 못하는 것으로 확인되었다. 전자현미경을 이용하여 파지 모양을 관찰한 결과, 4개의 파지 모두가 각이 진 머리와 수축성을 가진꼬리를 가지고 있어서 미오비리대 과에 속하는 것으로 나타났다(Fig.
- 9%이었으며 크기가 145,518 bp이며 220개의 구조유전자로 구성되어 있었다. ECP3 게놈과 가장 유사한 염기서열은 미오비리대 PhiEF24C 파지이었으며 전체 게놈 90%의 영역에서 97%의 유사도를 보였다. ECP3 파지는 한국에서 처음 분리된 E.
- ECP3 파지의 E. faecalis 10K28 숙주에 대한 흡착속도 측정 결과, 약 90% 이상의 ECP3 파지가 3분 내에 흡착되었다(Fig.3A). 파지의 증식능을 측정한 결과는 잠복기(latent period, L)가 약 30분이었고 하나의 세균으로부터 약 103개의 파지가 터져 나오는 것(burst size, B)으로 나타났다(Fig.
- faecalis를 특이적으로 사멸하지만 Enterococcus faecium를 포함한 다른 세균은 사멸시키지 않았다. ECP3 파지의 게놈은 이중 선형 DNA로 GC 함량이 35.9%이었으며 크기가 145,518 bp이며 220개의 구조유전자로 구성되어 있었다. ECP3 게놈과 가장 유사한 염기서열은 미오비리대 PhiEF24C 파지이었으며 전체 게놈 90%의 영역에서 97%의 유사도를 보였다.
- ECP3 파지의 전장 유전자 염기서열 분석 결과, 파지 유전체는 크기가 145,518 bp의 이중가닥 DNA로 GC 함량이 35.9%이었다. 다섯 개의 tRNA 유전자를 포함하여 220개의 open reading frame (ORF)으로 구성되어 있었다(Fig.
- 광주천 샘플, 금호강 샘플 및 계분장 침출수를 대상으로 여러 차례의 파지 증폭을 시도한 결과, 장알균을 기질 숙주로 하는 박테리오파지는 계분장의 침출수에서만 분리되었으며, 이중 10개의 순수 파지 lysate를 확보하였다. 순수 분리된 파지의 동일성 여부를 확인하기 위하여 파지의 숙주 범위 확인과 게놈DNA의 RAPD-PCR을 시행하였다.
- , 2008).따라서, ECP3 파지는 국내에서 분리된 첫번째 미오비리대 과에 속하는 E. faecalis 특이 파지라고 할 수 있겠다.
- 1). 이러한 결과를 조합하니 10개의 파지를 4그룹으로 나눌 수 있었다(a1b1c1d1, a2b2c2d1, a1b3c3d2, a1b4c3d2). RAPD PCR 결과에 의해 분류된 4종류의 파지 그룹별로 한 개씩 선택된 4종(ECP3, ECP4, ECP6, ECP8)의 파지를 대상으로 파지의 숙주범위와 형태를 확인하였다.
- faecium (14주), 포도알균(11주), 및 그람 음성 세균(녹농균, 아시네토박터, 대장균, 크렙시엘라, 엔테로박터, 시트로박터, 세라티아, 살모넬라 등 총 15주)은 사멸시키지 못하는 것으로 확인되었다. 전자현미경을 이용하여 파지 모양을 관찰한 결과, 4개의 파지 모두가 각이 진 머리와 수축성을 가진꼬리를 가지고 있어서 미오비리대 과에 속하는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 기능이 추정되는 단백질로는 전사 조절자, sigma factor, DNA 중합효소, RNA 중합효소, primase, exonuclease, ribonucleotide reductase,recombinase, helicase, dUTPase, thymidylate synthase, phophoesterase, serine/threonine protein phosphatase 등 유전자합성 및 전사에 관여하는 단백질이며 파지의 구조단백질인 tail protein, tail fiber, tail lysin, tail sheath protein, portal protein과 숙주의 세포벽을 뚫고 파쇄하는 holin과 endolysin이 있었다. 전체 염기서열을 미국 NCBI의 BLAST 검색을 한 결과, ECP3 파지는 현재까지 국내에서 보고된 Enterococcusphages와는 다르고, 일본에서 보고된 E. faecalis 특이 파지인 미오비리대 과의 PhiEF24C 파지와 염기서열이 상당히 유사하였다(query cover 90%, identity 97%)(Uchiyama et al., 2008).따라서, ECP3 파지는 국내에서 분리된 첫번째 미오비리대 과에 속하는 E.
- 3A). 파지의 증식능을 측정한 결과는 잠복기(latent period, L)가 약 30분이었고 하나의 세균으로부터 약 103개의 파지가 터져 나오는 것(burst size, B)으로 나타났다(Fig. 3B). 이 결과는 같은 미오비리대 과에 속하는 PhiEF24C와 상당히 유사한 수치를 보여준다(L ≈ 30분, B ≈ 110∼120)(Uchiyama et al.
후속연구
- faecalis의 파지는 매우 좁은 숙주특이성을 갖고 있다고 생각된다. 그러나, 이들 파지의 세포벽 파쇄 효소인 endolysin은 E.faecium을 포함한 광범위 기질을 가지기 때문에 향후 ECP3의 endolysin에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다(Uchiyama et al., 2008; Zhang et al., 2013).
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