[논문]도축장의 소와 돼지 분변에서 분리한 살모넬라속의 약제내성 및 약제내성 유전자의 보유율

하도윤; 지대해; 조상래; 박애라; 정은희; 박동엽; 이국천; 양정웅; 김종수; 김혜정; 정종화; 송익현; 김애란; 이지연; 김용환

doi:10.7853/kjvs.2011.34.1.045

도축장의 소와 돼지 분변에서 분리한 살모넬라속의 약제내성 및 약제내성 유전자의 보유율
Prevalence of the antimicrobial resistance and resistance associated gene in Salmonella spp. isolated from pigs and cattle in slaughterhouse 원문보기

韓國家畜衛生學會誌 = Korean journal of veterinary service, v.34 no.1, 2011년, pp.45 - 54

하도윤 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 지대해 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 조상래 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 박애라 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 정은희 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 박동엽 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 이국천 (경상남도 축산진흥연구소 중부지소) , 양정웅 (경상대학교 수의과대학) , 김종수 (경상대학교 수의과대학) , 김혜정 (경남 보건환경연구원 미생물 역학조사과) , 정종화 (경남 보건환경연구원 미생물 역학조사과) , 송익현 (삼성전자 메모리 사업부) , 김애란 (국립수의과학검역원 세균과) , 이지연 (국립수의과학검역원 세균과) , 김용환 (경상대학교 수의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate the distribution of Salmonella spp. from pigs and cattle in slaughterhouse, the antimicrobial resistance pattern and the prevalence of resistance genes of isolates. A total of 640 fecal samples from pigs and cattle in slaughterhouse were collected for isolation of Salmonella spp.. Isolation rate was revealed as 15% in pigs and 1.6% in cattle. As result of serotyping, group B (56.6%) were identified as most common in pigs and cattle isolates, in order of group C (24.5%) and group E (15.1%). S. Typhimurium (50.9%) was most common serotype. The major serotypes were in order of S. Rissen and S. London (11.3%) and S. Riggil (7.6%). In antimicrobial test, all isolates were demonstrates susceptibility to nitrofurantoin. But isolates were revealed resistance other antibiotics in order of tetracycline (64.6%), streptomycin (68.3%), ampicillin and amoxicillin (56.3%) and spectinomycin (47.9%). With polymerase chain reaction, antimicrobial resistance gene strA (75.0%) and aadA1 (3.1%) were detected in streptomycin resistance isolates and tetA (94.3%) and tetB (11.3%) gene were detected in tetracycline resistant isolates, but tetG was not detected. Class 1 integron gene was detected in all Salmonella isolates.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이번 실험에서는 경남 지역 도축장의 소와 돼지에서 살모넬라속 균의 분리율과 분리균의 혈청형별 분포도를 조사하고, 각종 항균제에 대한 내성 유형과 내성유전자의 관련성을 규명하여, 살모넬라속 균 감염에 대한 치료 및 예방대책을 확립하기 위한 기초자료를 제시하고자 하였다.

제안 방법

2010년 1월에서 8월 동안 경남 중부지역의 2개 도축장에서 출하된 소, 돼지의 분변에서 살모넬라속 균을 분리하여 serotype 및 항균제에 대한 내성 유형을 조사하고 내성유전자 유형을 분석해 본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
Agarose gel (Difco, U.S.A)을 0.5 μg/ml의 ethidium bromide (Sigma, Germany)용액으로 염색시킨 후 UVtransilluminator를 사용하여 증폭된 산물을 확인하였다.
DNA 추출：공시된 주로부터 genomic DNA 추출은 이 등(2009b)의 방법을 수정 보완하여 QIAamp DNA extraction kit (QIAamp DNA mini Qiagen, Germany)를사용하였다.
Disc는 gentamicin (GM 10 μg)등 20종을 사용하였으며(Table 1), 균주는 Mueller-Hinton broth(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 2∼6시간 동안 배양하여 균 농도를 McFarland No. 0.5 탁도로 조정한 후, 멸균면봉을 이용하여 Mueller-Hinton agar 평판배지를 60°로 회전하면서 3회 도포 하였다.
PCR에 의해 증폭된 산물은 1.5% agarose gel (Difco, U.S.A)상에 loading하고 TBE buffer (40 mMTris, 20 mM boric acid, 1mM EDTA; Difco, U.S.A)에서 100volt로 약 1시간 동안 전기영동을 실시하였다. Agarose gel (Difco, U.
PCR은 소와 및 돼지에서 분리된 살모넬라속 균 53주에 대해서 실시하였다.
PCR을 통한 약제 내성 관련 유전자 검출：약제 내성 관련 유전자 검출을 위한 PCR은 Randall (2004)과Madsen (2000) 및 Goldstein (2001)등의 방법을 수정보완하여 실시하였다. 모든 PCR 검출은 GoTag Green Master Mix, 2× (Promega, U.
모든 PCR 검출은 GoTag Green Master Mix, 2× (Promega, U.S.A) 12.5 μl, upstream 및 downstream primer (Genotec, Korea)를 각 1 μl, DNA template 2 μl를 포함하여 최종량이 25 μl이 되게 nuclease-free water를 첨가하였다.
선택배지에서 의심 집락 2∼3개를 취하여 triple sugar iron agar(TSI) 사면배지에 37℃에서 18∼24시간 배양하고 성상을 확인한 다음 API Kit (BioMerieux, France) 또는 Vitek system (BioMerieux, USA)을 이용하여 최종 확인하였다.
평판을 3∼5분간 말리고 15분 이내에 항균제 disc를 dispenser로 접종하였다.

대상 데이터

2010년 1월에서 8월 동안 경상남도 중부지역의 2개 도축장에 출하된 118농가의 소 320두, 16농가의 돼지 320두의 분변 내용물, 총 640건의 시료를 채취하여 균 분리에 사용하였으며, 각 시료는 무균적으로 채취한 후 4시간 이내에 냉장상태로 실험실로 운반하여 균 분리에 사용하였다.
Oligonucleotide primer의 합성：PCR에 사용된 oligonucleotide primer의 염기서열, 증폭산물의 크기 및 온도는 Table 2에서와 같다. aadA1, strA, tetA, tetB, tetG유전자 및 intI1, intI2 등의 oligonucleotide primer를Bioneer (Korea)및 Xenotech (Korea)에 합성을 의뢰하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 항균제는 aminoglycoside계와 β-lactam계 각 4종과 그 외 항균제 4종을 포함한 12종을 사용하였으며, 각 항균제의 종류와 disc의 농도는 Table 1과 같다.
37℃에서 16∼18시간 배양 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2002)의 기준에 따라 내성 여부를 판정하였다. 항균제 감수성 시험의 표준균주로는 E. coli ATCC 25922를 사용하였다.

이론/모형

37℃에서 16∼18시간 배양 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2002)의 기준에 따라 내성 여부를 판정하였다.
PCR은 94℃에서 5분간 denaturation시킨 후, 94℃에서 60초, 52∼60℃에서30∼60초간 annealing 시킨 후, 72℃에서 1분 조건으로 총 30cycle로 수행한 다음 72℃에서 10분간 extention시켰다. PCR 수행은 T-gradient (Biometra, Germany)를 이용하였다.
5% glycerol이 함유된 nutrient broth (Difco, USA)로 수확한 다음 −70℃에 보관하였으며, trytic soy agar에 계대하여 4℃에 보관하면서 사용하였다. 또한, Serotyping은 균체항원(O) 및 편모항원(H)에 대한 표준항혈청(Difco, USA)을 이용하여 Edward와 Ewing(1986)의 방법에 따라 형별하였다.
분리균에 대한 항균제 감수성 시험은 Bauer (1966)와 Bryant (1972)의 방법을 참고로 하여 Sensi disc (BBL, USA and Oxoid, UK)를 이용한 disc 확산법으로 실시하였다. Disc는 gentamicin (GM 10 μg)등 20종을 사용하였으며(Table 1), 균주는 Mueller-Hinton broth(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 2∼6시간 동안 배양하여 균 농도를 McFarland No.
살모넬라균의 분리방법은 Edwards 및 Ewing (1986)의 방법 및 축산물의 가공기준 및 성분규격(국립수의과학검역원, 2010)의 방법에 따라 수행하였다. 증균 배양은 buffered peptone water (Difco, USA) 25.

성능/효과

PCR기법을 이용하여 내성 관련 유전자를 검출해본 결과 약제 내성유전자별 균주 수는 streptomycin 내성 32주 중 5주(15.6%)에서 aadA1 유전자가 검출되었으며 strA는 24주(75%)에서 검출되었다. Tetracycline 내성 35주 중 33주(94.
Rissen 6주 중에서 streptomycin 내성 4주 중 strA 유전자는 모든 균주에서 검출되었으며, tetracycline 내성 6주 모두에서 tetA 유전자가 검출되었다. S. Riggil 3주 중에서 streptomycin 내성 3주 중 strA 유전자는 2주(66.7%)에서 검출되었으며, tetracycline 내성 3주 모두에서 tetA 유전자가 검출되었다.
7%) 순이었으며 cephazolin과 nitrofurantoin에 대해서는 모두 감수성을 나타내었다. S. Riggil의 내성률은 tetracycline 및 streptomycin에 75%, gentamicin, kanamycin, ampicillin, amoxicillin,cephazolin, spectinomycin 및 STX에 대해서는 25%로 나타났으며, neomycin, cephazolin 및 nitrofurantoin에 대해서는 모두 감수성 나타내었다.
Typhimurium (n=23) 균주 중에서 streptomycin 내성 20주 중 aadA 유전자는 4주(20%), strA 유전자는 17주(85%)에서 검출되었으며, tetracycline 내성 20주 중 ntetA 유전자는 19주(95%), tetB 유전자는 4주(20%)에서 검출되었다. S. Rissen 6주 중에서 streptomycin 내성 4주 중 strA 유전자는 모든 균주에서 검출되었으며, tetracycline 내성 6주 모두에서 tetA 유전자가 검출되었다. S.
S. Rissen 6주의 내성률은 tetracycline에 대하여 100%, 그 다음 gentamicin (88.3%), streptomycin, spectinomycin 및 STX (66.7%) 순이었으며 cephazolin과 nitrofurantoin에 대해서는 모두 감수성을 나타내었다. S.
Riggil 3주는 2종의 내성유전자 profile을 나타내었다. S. Typhimurium의 23주 중 streptomycin 및 tetracycline에 내성을 가지고, strA, tetA, intI1 profile 주가 9주(39.1%)로 가장 높게 분포하였다. 이러한 결과는 이 등(2009b)이 S.
살모넬라속 균 53주 중 분리율이 상대적으로 높은 4종의 serotype에 속하는 43주에 대한 항균제 내성률은 Table 6과 같다. Serotype별 내성률은 S. Typhimurium의 경우 ampicillin과 amoxicillin (81.5%), streptomycin (77.8%), cephalothin (66.7%), spectinomycin (59.3%),gentamicin과 STX (51.9%) 순으로 나타났으며 nitrofurantoin에 대해서는 모두 감수성을 나타내었다.
Serotype별 약제 내성 유전자를 검출한 결과 S.Typhimurium (n=23) 균주 중에서 streptomycin 내성 20주 중 aadA 유전자는 4주(20%), strA 유전자는 17주(85%)에서 검출되었으며, tetracycline 내성 20주 중 ntetA 유전자는 19주(95%), tetB 유전자는 4주(20%)에서 검출되었다. S.
Serotype：분리된 Salmonella 속 균 53주에 대한 serotype은 Table 4에서와 같이 모두 12종으로 분류되었고, type별 분포는 B group인 S. Typhimurium이50.9%(27주)으로 가장 높은 분리율을 보였으며, C와 E group인 S. Rissen과 S. London이 각각 11.3% (6주),C group인 S. Riggil이 7.6% (4주)의 순으로 나타났고,나머지는 1∼2주씩 분포를 나타내었다.
1%) 순이었다. Serotyping 결과 53주 중 13종류의 serotype이 분리되었고, S. Typhimurium이 50.9%(27주)으로 가장 분리율이 높았으며, S. Rissen과 S.London이 각각 11.3% (6주), S. Reggil이 7.6% (4주)의순으로 나타났으며 이들 4종의 serotype이 전체의 81.1%를 차지하였다. 돼지 유래군 48주는 11종으로 분류되었고 S.
Streptomycin과 tetracycline에 대해 내성을 가진 40주에 대하여 약제내성 관련 유전자를 검출한 결과aadA1, strA, tetA, tetB 및 intI1 유전자 등 5종의 내성 관련 유전자가 검출되었다(Table 7, Fig. 1∼5).
6%)에서 aadA1 유전자가 검출되었으며strA는 24주(75%)에서 검출되었다. Tetracycline 내성 35주 중 33주(94.3%)에서 tetA 유전자가 검출되었으며, tetB 유전자는 4주 (11.4%)에서 검출되었고, tetG는검출되지 않았다. intI1유전자는 모든 균주에서 검출되었으며, intI2 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았다.
6%)에서 aadA1 유전자가 검출되었으며 strA는 24주(75%)에서 검출되었다. Tetracycline 내성 35주 중 33주(94.3%)에서 tetA 유전자가 검출되었으며, tetB 유전자는 4주(11.4%)에서 검출되었다. 그리고 tetG 및 intI2 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았으며, intI1유전자는 모든 균주에서 검출되었다.
4%)에서 검출되었다. 그리고 tetG 및 intI2 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았으며, intI1유전자는 모든 균주에서 검출되었다.
1%를 차지하였다. 돼지 유래군 48주는 11종으로 분류되었고 S. Typhimurium 이 24주(50%)로 가장 높은 분포를 보였으며, 소 유래균은 5주는 3종으로 분류되었으며 S. Typhimurium이 3주(60%)로 가장 높은 분리율을 보였다.
6% (4주)의 순으로 나타났고,나머지는 1∼2주씩 분포를 나타내었다. 돼지 유래균 48주는 11종으로 분류되었고 S. Typhimurium이 24주(45.3%)로 가장 높은 분포를 보였으며, 소 유래균은 5주는 3종으로 분류되었으며 S. Typhimurium이 3주(5.7%)로 가장 높은 분리율을 보였다. 이는 김(2000)이 소, 돼지 및 닭에서 분리한 Salmonella속 균 264주에서 18종을, 이 등(2009a)이 돼지와 소에서 분리한 Salmonella속 균 457주에서 34종을 분류한 성적과는 차이를 보였으나 분리된 주요 serotype은 S.
분리된 살모넬라속 균 53주에 대한 항균제 감수성 시험결과는 Table 5에서와 같다. 돼지유래균주의 항균제 내성률은 tetracycline (64.6%), streptomycin (58.3%),ampicillin과 amoxicillin (56.3%) 및 spectinomycin (47.9%) 순이었으며 nitrofurantoin에 대해서는 내성을 나타낸 균주가 없었다. 소유래 균주의 항균제 내성률은 tetracycline, gentamicin 및 streptomycin에 대해 80%, spectinomycin에 대해 60%, ampicillin, amoxicillin, cephalothin 및 STX에 대해 40%, kanamycin,neomycin 및 cephazolin에 대해서는 20%로 나타났으며 nitrofurantoin에 대해서는 내성을 나타낸 균주가 없었다.
소와 돼지의 분변에서 분리한 살모넬라속 균의 분리율은 총 시료 640 건에서 8.3% (53건)가 분리되었으며 축종별로는 돼지에서 15% (48건), 소는 1.2% (5건)에서 분리되었다.
9%) 순이었으며 nitrofurantoin에 대해서는 내성을 나타낸 균주가 없었다. 소유래 균주의 항균제 내성률은 tetracycline, gentamicin 및 streptomycin에 대해 80%, spectinomycin에 대해 60%, ampicillin, amoxicillin, cephalothin 및 STX에 대해 40%, kanamycin,neomycin 및 cephazolin에 대해서는 20%로 나타났으며 nitrofurantoin에 대해서는 내성을 나타낸 균주가 없었다.
약제 내성유전자별 균주 수는 streptomycin 내성 32주 중 5주(15.6%)에서 aadA1 유전자가 검출되었으며strA는 24주(75%)에서 검출되었다. Tetracycline 내성 35주 중 33주(94.
약제감수성시험 결과 분리균의 내성율은 streptomycin (60.3%), tetracycline (56%), ampicillin 및 amoxicillin (54.7%) 순이었으며 nitrofurantoin에 대해서는 내성을 나타낸 균주가 없었다.
돼지에서 분리된 살모넬라속 균들의 integron 분포를 살펴보면, Gebreyes와 Thakur (2005)는 28주의 분리균주 중, 21주에서 class 1 integron이 검출되었다고 하였다. 이번 실험의 결과에서는 intI1 유전자가 100% 검출되어 외국의 성적 및 우리나라의 이 등(2009b)의 성적보다도 높게 나타났으며, intI2 유전자는 검출되지 않았다. 이는 균이 분리된 지역적 및 serotype에 의한 차이, 또는 각 연구자가 사용한 primer에 의해서도 차이가 발생한다고 추측된다.
4%)순으로 나타났다고 하였다. 이번 연구에서도 tetracycline과 streptomycin에 대해서는 이전 연구들의 성적과 유사한 결과로 나타났으며 ampicillin에 대해서는 비교적 높은 내성률을 보였다. 이들 항생제에 대한 다른 연구자들의 내성률과의 차이는 지역적인 차이, 시료의 종류 및 감수성 시험의 방법에 따른 결과로 생각된다
Pezzella 등(2004)은 동물유래 58주의 다제내성 살모넬라속 균에 대한 streptomycin 및 tetracycline 내성 관련 유전자를 검출한 결과 strA의 검출률은 84%였으며 tetA의 검출률은 68%였다고 하였다. 이번 연구의 결과는 이들의 결과에 비해 strA의 검출률은 다소 낮았으며, tetA의 검출률은 유사한 수준으로 나타났다.

후속연구

이는 이번 연구의 결과와 유사하게 나타났으나, β-lactams계의 ampicillin에는 높은 내성률을 나타내었다. 따라서 S.Typhimurium이 이들 항생제에 대한 내성도가 높게 나타나는 이유에 대해 연구가 계속되어야 할 것으로 생각한다.
이상의 도축장 소, 돼지 분변에서 분리한 Salmonella 속 균의 약제내성 및 약제내성 유전자에 관한 결론은 항생제의 신중한 사용 원칙 및 수의사의 처방에 의한 사용으로 귀결된다. 따라서 농장주 및 축주들의 올바른 항생제 사용 인식은 농장 HACCP 뿐만 아니라 도축장 HACCP로 순환되어 최종적으로 우리 국민 건강에 영향을 끼쳐 매우 중요하다 말할 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	항균제 내성 획득 기전은 무엇이 있는가?	항균제는 동물에서 세균성 감염증 치료에 유용하게 사용되었으나 이의 남용이나 발육촉진을 위해 사료에 첨가 투여함으로써 항균제 내성을 선택적으로 증가시켜 세균성 감염증의 치료 및 예방에 많은 문제점을 일으키고 있다(Sato와 Kodama, 1974). 약제내성 획득 기전으로는 plasmid, transposon, phage 및 integronmediated mechanism에 의하며(Baggesen 등, 2000),
	살모넬라속 균은 언제 처음으로 분리되었는가?	살모넬라속 균은 1885년 Smith와 Salmon이 돼지 콜레라로 폐사한 돼지의 장으로부터 S. Choleraesuis를 처음으로 분리 · 보고(Molorny 등, 2001) 이후, 균체 표면 항원성분 중 serogroup의 특성을 부여하는 주체 성분인 lipopolysaccharide (LPS;O-antigen)와 편모항원인flagellin protein (H-antigen)의 다형성에 근거하여 혈청형을 결정할 수 있음을 보고한(Tuchili LM 등, 1996;Kwang 등, 1996) 이래, O-antigen의 혈청형에 따라 A,B, C, D, E의 group으로 구분하며(Edwards와 Ewing,1986), 현재까지 밝혀진 serotype은 항원 구조에 따라 약 2,500여 종 이상이 보고되었으며 분리율이 비교적 높은 것은 200여 종의 혈청형으로 알려져 있다(Baggesen 등, 2000; Chiu 등, 2005).
	균체 표면 항원성분 중 serogroup의 특성을 부여하는 주체 성분은 무엇인가?	살모넬라속 균은 1885년 Smith와 Salmon이 돼지 콜레라로 폐사한 돼지의 장으로부터 S. Choleraesuis를 처음으로 분리 · 보고(Molorny 등, 2001) 이후, 균체 표면 항원성분 중 serogroup의 특성을 부여하는 주체 성분인 lipopolysaccharide (LPS;O-antigen)와 편모항원인flagellin protein (H-antigen)의 다형성에 근거하여 혈청형을 결정할 수 있음을 보고한(Tuchili LM 등, 1996;Kwang 등, 1996) 이래, O-antigen의 혈청형에 따라 A,B, C, D, E의 group으로 구분하며(Edwards와 Ewing,1986), 현재까지 밝혀진 serotype은 항원 구조에 따라 약 2,500여 종 이상이 보고되었으며 분리율이 비교적 높은 것은 200여 종의 혈청형으로 알려져 있다(Baggesen 등, 2000; Chiu 등, 2005).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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