[논문]생맥산(生脈散)이 자외선에 의한 피부각질세포의 상해에 미치는 영향

김은섭; 유동열

doi:10.15204/jkobgy.2011.24.2.033

생맥산(生脈散)이 자외선에 의한 피부각질세포의 상해에 미치는 영향
Protective Effect of Processed Saengmaek-san(SM) on Cell Damage in UV-exposed HaCaT Cell 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.24 no.2, 2011년, pp.33 - 51

김은섭 (대전대학교 한의과대학 부인과 교실) , 유동열 (대전대학교 한의과대학 부인과 교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: This study was performed to assess the protective effect of Saengmaek-san (SM) on UVB-induced HaCaT cell damage. Methods: The protective effects of Saengmaek-san(SM) were determined by UVB-induced HaCaT assay. We assessed protective effects of Saengmaek-san (SM) on LDH release and nitrite release from HaCaT. And COX-2, Bcl-2, Bax, $TNF{\alpha}$, c-jun, c-fos, NF-kB, iNOS, Bcl-xL gene expression were determined in HaCaT using real-time PCR method. Results: 1. SM inhibited LDH-release, nitrite production in UVB-exposed HaCaT. 2. SM suppressed the gene expression of COX-2, $TNF{\alpha}$ in UVB-exposed HaCaT. 3. SM increased the gene expression of Bcl-2, Bax, Bcl-xL family protein in UVB-exposed HaCaT. 4. SM suppressed the gene expression of c-jun, c-fos, NF-kB in UVB-exposed HaCaT. Conclusions: The study showed SM inhibited the cell damage in UVB-exposed HaCaT.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이 melanin은 피부의 색소 침착을 유발 하지만 항산화 작용을 증강시켜 피부세포를 자외선으로 부터 보호하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 UVB 조사에 의해 HaCaT cell에서 COX-2 유전자 발현이 현저히 증가되는 것을 관찰하였다. 이것은 UVB에 의해 iNOS 발현이 증가하고, nitrite 생성이 증가하는 것과 함께 염증반응을 증폭시킬 것으로 판단된다.
본 연구에서는 UVB에 의한 각질세포의 세포사멸에 대한 SM의 영향을 평가 하고자 각질세포의 세포상해를 측정하였다. LDH(lactate dehydrogenase)는 세포내막에 존재하므로 세포가 파괴되어야 세포 밖으로 유출될 수 있어 세포의 상해여부를 측정하는 유력한 기준이 된다.
이에 저자는 生脈散이 UVB 조사에 의한 피부각질세포의 상해에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 사람의 각질세포인 HaCaT를 자외선 처리하여 LDH 유리와 nitrite 생성에 미치는 영향을 측정하였으며, COX-2, Bcl-2, Bax, TNFα, c-jun, c-fos, NF-kB, iNOS, Bcl-xL의 유전자 발현에 미치는 영향을 평가한 결과 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.

가설 설정

. 生脈散은 肺臟의 氣陰을 補하는 작용이 뛰어나며 淸熱生津하는 효능이 우수하여 피부의 상해와 병변에 효과가 있으리라 사료되어 이번 연구에 활용하였으며, 生脈散이 자외선으로 자극된 피부 각질세포를 보호하고 자외선 조사 시에 피부 광노화에 관여하는 인자들을 억제할 수 있을 것이라는 가설을 설정하였다.
. 生脈散은 肺臟의 氣陰을 補하는 작용이 뛰어나며 淸熱生津하는 효능이 우수하여 피부의 상해와 병변에 효과가 있으리라 사료되어 이번 연구에 활용하였으며, 生脈散이 자외선으로 자극된 피부 각질세포를 보호하고 자외선 조사 시에 피부 광노화에 관여하는 인자들을 억제할 수 있을 것이라는 가설을 설정하였다.

제안 방법

배양액을 제거한 다음 각 well에 50 ㎕의 PBS (phosphate buffered saline)를 넣은 다음, 세포에 UVB를 30 mJ/㎠ 를 조사한 후 PBS를 제거하고 well당 약물이 포함된 200 ㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다. 24시간이 경과한 다음 배양액을 취하여 세포 손상의 지표로 LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 측정하였다. LDH 활성은 Sigma사의 LDH kit(Sigma S 500)을 이용하여 정량하였으며, ELISA Reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA이었으며, antisense는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 를 사용하였다. 각각의 optical tube에 3배의 SyberGreen Mix 2.
Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA이었고, antisense는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC를 사용하였다.
24시간이 경과한 다음 배양액을 취하여 세포 손상의 지표로 LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 측정하였다. LDH 활성은 Sigma사의 LDH kit(Sigma S 500)을 이용하여 정량하였으며, ELISA Reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
Oligo (dT)16-18 (Promega, USA), reaction buffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 8.3), 1mM dNTP(Biotools, Spain)과 200 unit M-MLV-RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 25㎕에 10× PCR buffer, 0.
PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (30초), 59℃ (30초), 72℃ (45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동 하였다. 전기영동 결과 나온 band를 density 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.
PCR은 total volume 25㎕에 10× PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 pmole의 sense 및 antisense primer를 넣은 혼합액에 cDNA 와 1.25 unit의 Taq polymerase (Biotools, Spain)을 넣어 PCR을 시행하였다.
7 ㎕ H2O를 넣고, 95℃ 5 min 1 cycle, 95℃ 30sec, 45℃ 30sec, 72℃ 60sec 40 cycles, 95℃ 20min 1 cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ㎕를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity 를 측정했다. SDS 7,000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.
UVB에 의한 피부 각질 세포 상해를 측정하기 위하여, HaCaT 세포에 UVB 를 조사한 후 유리되는 LDH를 측정하였다. 측정 결과, UVB 조사 시에 세포로부터 LDH 의 유리가 증가하였다.
UVB에 의한 피부 각질 세포의 PGE2 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, PGE2 생성에 관여하는 COX-2의 유전자 발현을 UVB를 조사한 세포로부터 측정하였다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 COX-2의 mRNA의 생성이 증가하였다.
UVB에 의한 피부 각질 세포의 세포 사멸에 저항하는 유전자인 Bcl family 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, Bcl-2 유전자 발현을 측정하였다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 Bcl-2의 mRNA의 생성이 감소하였다.
日晒瘡은 腠理가 不密하여 衛表를 固密 하지 못하는 상황에서 무더운 여름철에 실외에서 일을 하여 陽熱毒邪가 體表에 침입하여 肌膚에 蘊鬱되어 氣血이 沸騰 하여 발생한다고 보았다. 淸熱祛暑, 解毒消腫하는 치법으로 치료하였는데 淸暑湯, 五味消毒飮, 凉血地黃湯合黃連解毒湯 등을 활용하였다2).
生脈散이 UVB 조사에 의한 피부각질 세포의 상해에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 사람의 각질세포인 HaCaT를 자외선 처리하여 LDH 유리와 nitrite 생성에 미치는 영향을 측정하였으며, COX-2, Bcl-2, Bax, TNFα, c-jun, c-fos, NF-kB, iNOS, Bcl-xL의 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
세포는 well당 1×105개씩 넣었다. 배양액을 제거한 다음 각 well에 50 ㎕의 PBS (phosphate buffered saline)를 넣은 다음, 세포에 UVB를 30 mJ/㎠ 를 조사한 후 PBS를 제거하고 well당 약물이 포함된 200 ㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다. 24시간이 경과한 다음 배양액을 취하여 세포 손상의 지표로 LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 측정하였다.
배양하고 있는 HaCaT 세포에 1 ㎖ TRIzol reagent(Invitrogen, USA)를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 그리고 분리한 RNA 용액에 200 ㎕의 chloroform : isoamylalcohol (24:1)을 넣고 강하게 섞은 후 14,000 rpm으로 원심 분리하여 상층액 500 ㎕를 분리하였다.
자외선 조사는 UVATEC(Sherman Oaks, CA, USA) 조사기를 이용하였으며, UVB lamp를 사용하여 290-320 ㎚ 파장을 가지는 자외선을 조사하였다. 광량은 IL1700 radiometer(International Light Inc.
자외선을 조사하기 전에 1시간 동안 약물을 농도별로 가하여 미리 배양하였다. 자외선을 조사하기 위하여 DMEM 배지를 제거한 다음, PBS로 2번 씻어낸 후 UVB 파장의 자외선을 30 mJ/㎠ 이 되도록 조사하였다. 자외선을 조사한 다음 PBS로 한번 씻어낸 후, 약물이 농도별로 함유된 새로운 DMEM 배지를 넣고 일정 시간동안 배양한 후 실험에 사용하였다.
자외선을 조사하기 위하여 DMEM 배지를 제거한 다음, PBS로 2번 씻어낸 후 UVB 파장의 자외선을 30 mJ/㎠ 이 되도록 조사하였다. 자외선을 조사한 다음 PBS로 한번 씻어낸 후, 약물이 농도별로 함유된 새로운 DMEM 배지를 넣고 일정 시간동안 배양한 후 실험에 사용하였다.
피부 각질 세포의 산화적 스트레스를 측정하기 위하여, HaCaT 세포에 UVB를 조사한 후 생성되는 nitrite를 측정하였다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 nitrite량이 증가하였다.
피부 각질 세포의 산화적 스트레스를 측정하기 위하여, HaCaT 세포에 UV를 조사한 후 생성되는 nitrite를 측정하였다. 실험결과, UV 조사시에 세포에서 생 성되는 nitrite 량이 증가하였다.

대상 데이터

COX-2의 sense primer는 TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT, antisense는 AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT를 사용하였으며, TNFα의 sense primer는 TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA, antisense는 GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG 를 사용하였다.
COX-2의 sense primer는 TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT이었으며, antisense는 AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT를 사용하였고, TNFα의 sense primer는 TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA이었으며, antisense 는 GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG를 사용하였다.
NF-κB2의 sense primer는 TCC ACC TTT AGG TTG CCC TG, antisense는 TCT GCT CTC GTC ATG TCA CC를 사용하였으며, iNOS의 sense primer는 CGG TGC TGT ATT TCC TTA CGA GGC GAA GAA GG, antisense는 GGT GCT GTC TGT TAG GAG GTC CAA GTA AAG GGC를 사용하였다.
COX-2의 sense primer는 TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT이었으며, antisense는 AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT를 사용하였고, TNFα의 sense primer는 TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA이었으며, antisense 는 GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG를 사용하였다. c-Jun의 sense primer 는 GGA TCA AGG CGG AGA GGA AG, antisense는 GCG TTA GCA TGA GTT GGC AC를 사용하였으며, c-Fos 의 sense primer는 GGA GAA TCC GAA GGA AAG G, antisense는 GCT TGG GCT CAG GGT CAT TG를 사용하였다. NF-κB2의 sense primer는 TCC ACC TTT AGG TTG CCC TG, antisense는 TCT GCT CTC GTC ATG TCA CC를 사용하였으며, iNOS의 sense primer는 CGG TGC TGT ATT TCC TTA CGA GGC GAA GAA GG, antisense는 GGT GCT GTC TGT TAG GAG GTC CAA GTA AAG GGC를 사용하였다.
자외선 조사는 UVATEC(Sherman Oaks, CA, USA) 조사기를 이용하였으며, UVB lamp를 사용하여 290-320 ㎚ 파장을 가지는 자외선을 조사하였다. 광량은 IL1700 radiometer(International Light Inc., MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 자외선을 조사하기 전에 1시간 동안 약물을 농도별로 가하여 미리 배양하였다.
세포 분주를 위해서는 0.25% trypsinEDTA를 사용하였으며, 96 well과 24 well 에서는 1×105개/well, 6 well에서는 1×106 개/well의 세포를 가하여 overnight 배양한 후 실험에 사용하였다.
세포는 DMEM에 10% FBS, 10% penicillin-streptomycin(100 unit/㎖, 100 ㎍/㎖)이 첨가된 배지로 CO2 incubator 로(37℃, 5% CO2, 95% air) 배양하였다. 세포 분주를 위해서는 0.
세포는 well당 1×105개씩 넣었다.
5%)을 얻었다(이하 SM이라 칭함). 실험시에 는 SM을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45 ㎛의 여과지를 통과시킨 후 사용하였다.
실험에 사용된 인간 피부 각질세포주인 HaCaT keratinocyte는 Dr. Fusenig (German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg, Germany)로부터 분양 받아 사용하였다.
실험에 사용한 生脈散의 구성 약물은 대전대학교 둔산한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다. 1첩의 내용과 분량은 다음과 같다(Table 1).

데이터처리

PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ㎕를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity 를 측정했다. SDS 7,000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.
각 결과에 대한 유의성 검증은 Student's t-test를 이용하였다.
PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (30초), 59℃ (30초), 72℃ (45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동 하였다. 전기영동 결과 나온 band를 density 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1(Media Cybernetics. USA)을 이용하여 구했다.

성능/효과

또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사 한 대조군에 비하여 Bcl-2 유전자 발현을 증가시켜, UVB에 의한 세포 사멸에 저항성을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 4)
1. 生脈散은 UVB로 자극된 피부각질세 포주인 HaCaT의 상해로 인한 LDH 유리와 nitrite의 생성을 억제하였다.
2. 生脈散은 UVB로 자극된 진피세포에서 MMP-1을 증가시킬 수 있는 COX-2, TNFα의 발현을 감소시켰다.
3. 生脈散은 UVB로 자극된 HaCaT 세포에서 anti-apoptosis 작용을 나타내 는 Bcl-2, Bax, Bcl-xL 단백질 유전자 발현을 증가시켰다.
4. 生脈散은 UVB로 자극된 HaCaT 세포에서 단백질 발현을 조절하는 전사인자인 c-jun, c-fos, NF-kB 발현 증가를 억제하였다.
5. 生脈散은 UVB에 의한 ROS 생성 관련인자인 iNOS 발현에 영향을 미치지 않았다.
2). 따라서, SM은 UVB에 의한 산화적 스트레스를 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
1). 따라서, SM은 UVB에 의한 세포 손상을 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 COX-2의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 200 ㎍/ ㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비해 COX-2 유전자 발현을 억제하여, UVB에 의한 PGE2 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 Bax의 mRNA의 생성이 감소하였다. 또한, SM을 200 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 Bax 유전자 발현을 증가시켜, UVB에 의한 세포 사멸에 저항성을 가 지는것으로 나타났다(Fig. 5).
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 Bcl-xL의 mRNA의 생성이 감소하였다. 또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 Bcl-xL 유전자 발현을 증가시켜, UVB 에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig. 11).
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 NF-kB의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 NF-kB 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig. 9).
또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 TNFα 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig. 6).
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 c-fos의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 c-fos 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig. 8).
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 c-jun의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 c-jun 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig. 7).
측정 결과, UVB 조사 시에 세포로부터 LDH 의 유리가 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비해 LDH의 유리를 억제하여, UVB에 의한 세포 상해를 억제하는 작용을 나타내었다(Fig. 1).
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 nitrite량이 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비해 nitrite 생성을 억제하였다(Fig. 2). 따라서, SM은 UVB에 의한 산화적 스트레스를 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
실험결과, UV 조사시에 세포에서 생 성되는 nitrite 량이 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에 비해 nitrite 생성을 억제하여, UV 에 의한 산화적 스트레스를 억제하는 작용을 나타내었다(Fig. 2).
선행 연구에서 NF-kB를 불활성화시키면 염증을 유발하는 iNOS와 COX-2의 발현이 억제된다고 알려져 있으며, UV를 조사한 keratinocyte에서 c-jun과 NF-kB의 발현이 증가된다고 보고하였다46). 본 연구 실험결과에서 UVB 를 조사한 keratinocyte에서 NF-kB의 발현이 증가하는 것을 확인했으며, SM은 이를 억제하였다(Fig. 9). 이와함께 UVB에 의해 발현이 증가된 c-jun, c-fos 의 발현도 SM이 억제하였다.
기존의 연구에서 UV의 조사는 세포내에서 Bcl-2 계열의 단백질인 Bcl-xL 및 Bax의 발현을 억제하는 것으로 보고되었다42). 본 연구에서 UVB를 조사한 HaCaT 세포에서 Bcl-xL과 Bax2의 발현이 억제되어 기존의 논문 및 선행 연구 결과들과의 상관성이 인정되었다. 즉, SM을 처리한 경우에 UVB에 의해 억제된 Bcl-xL 및 Bax 단백질 발현을 SM이 회복시키는 것으로 나타났다(Fig.
이는 UVB에 의한 ROS 생성이 증가되고, ROS 물질들이 단백질, 지방, 핵산 등 생체 구성물질의 변성을 유발한 결과 세포 막이 파괴되는 것을 의미한다. 본 연구에서 생맥산은 UVB에 의해 유리가 증가된 LDH 활성을 억제하였다(Fig. 1). 따라서, SM은 UVB에 의한 세포 손상을 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
이것은 UVB에 의해 iNOS 발현이 증가하고, nitrite 생성이 증가하는 것과 함께 염증반응을 증폭시킬 것으로 판단된다. 실험결과, SM은 UVB에 의해 증가하는 COX-2 발현을 억제하여 염증반응을 억제할 것으로 나타났다(Fig. 3).
피부 각질 세포의 산화적 스트레스를 측정하기 위하여, HaCaT 세포에 UV를 조사한 후 생성되는 nitrite를 측정하였다. 실험결과, UV 조사시에 세포에서 생 성되는 nitrite 량이 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에 비해 nitrite 생성을 억제하여, UV 에 의한 산화적 스트레스를 억제하는 작용을 나타내었다(Fig.
이 중 Bax 유전자는 UVB에 의해 정상에 비해 감소하는 것으로 보고되었다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 Bax의 mRNA의 생성이 감소하였다. 또한, SM을 200 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 Bax 유전자 발현을 증가시켜, UVB에 의한 세포 사멸에 저항성을 가 지는것으로 나타났다(Fig.
UVB에 의한 피부 각질 세포의 세포 사멸에 저항하는 유전자인 Bcl family 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, Bcl-2 유전자 발현을 측정하였다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 Bcl-2의 mRNA의 생성이 감소하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사 한 대조군에 비하여 Bcl-2 유전자 발현을 증가시켜, UVB에 의한 세포 사멸에 저항성을 가지는 것으로 나타났다(Fig.
BcL-xL 는 세포 괴사를 억제하는 단백질인 Bcl-2 계열의 단백질이다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 Bcl-xL의 mRNA의 생성이 감소하였다. 또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 Bcl-xL 유전자 발현을 증가시켜, UVB 에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig.
UVB에 의한 피부 각질 세포의 PGE2 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, PGE2 생성에 관여하는 COX-2의 유전자 발현을 UVB를 조사한 세포로부터 측정하였다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 COX-2의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 200 ㎍/ ㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비해 COX-2 유전자 발현을 억제하여, UVB에 의한 PGE2 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig.
NF-kB 는 MMP 등의 단백질 발현에 관여하는 신호전달 단백질 전사인자이다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 NF-kB의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 NF-kB 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig.
실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 TNFα의 mRNA의 생성 이 증가하였다.
c-fos는 MMP 등의 단백질 발현에 관여하는 신호전달 단백질 전사인자이다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 c-fos의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 200, 100 ㎍/㎕ 농도로 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 c-fos 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig.
c-jun은 MMP 등의 단백질 발현에 관여하는 신호전달 단백질 전사인자이다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 c-jun의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비하여 c-jun 유전자 발현을 감소시켜, UVB에 의한 fibroblast 작용을 간접적으로 억제할 수 있을 것으로 나타났다(Fig.
iNOS는 세포 상해를 유발하는 염증반응을 유발하는 유전자이다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 iNOS의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SM 을 처리한 경우 모든 농도에서, UVB로 조사한 대조군에 비하여 증가한 iNOS 유전자 발현을 감소시키지 못하였다(Fig.
피부 각질 세포의 산화적 스트레스를 측정하기 위하여, HaCaT 세포에 UVB를 조사한 후 생성되는 nitrite를 측정하였다. 실험결과, UVB 조사 시에 세포에서 생성되는 nitrite량이 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비해 nitrite 생성을 억제하였다(Fig.
실험결과, UVB는 HaCaT 세포의 iNOS 유전자 발현을 증가시켜 염증반응을 증가시키는 것으로 나타났으며, SM은 모든 농도에서 이를 억제하지 못하였다.
LDH(lactate dehydrogenase)는 세포내막에 존재하므로 세포가 파괴되어야 세포 밖으로 유출될 수 있어 세포의 상해여부를 측정하는 유력한 기준이 된다. 실험결과, UVB는 배양된 인간 각질세포인 HaCaT 세포의 상해를 증가시켜 LDH의 유리를 증가시켰다(Fig. 1). 이는 UVB에 의한 ROS 생성이 증가되고, ROS 물질들이 단백질, 지방, 핵산 등 생체 구성물질의 변성을 유발한 결과 세포 막이 파괴되는 것을 의미한다.
실험결과, UVB는 피부각질세포에서 TNFα 유전자 발현을 현저히 증가시켰으며, SM은 UVB에 의해 증가된 TNFα 유전자 발현을 현저히 억제하였다(Fig. 6).
실험결과, UVB는 HaCaT 세포의 iNOS 유전자 발현을 증가시켜 염증반응을 증가시키는 것으로 나타났으며, SM은 모든 농도에서 이를 억제하지 못하였다. 이로 보아 SM이 유도성 NO 로 유발되는 염증 반응을 억제하지 못하는 것으로 판단되었다(Fig. 10).
이상의 결과, 生脈散은 직접적으로 UVB로 자극된 피부 각질세포를 보호하는 작용이 있으며, UVB 조사 시에 피부 광노화에 관여하는 인자들을 억제할 수 있는 것으로 판단된다.
본 연구에서 UVB를 조사한 HaCaT 세포에서 Bcl-xL과 Bax2의 발현이 억제되어 기존의 논문 및 선행 연구 결과들과의 상관성이 인정되었다. 즉, SM을 처리한 경우에 UVB에 의해 억제된 Bcl-xL 및 Bax 단백질 발현을 SM이 회복시키는 것으로 나타났다(Fig. 5, Fig. 11). 이 작용은 SM이 UVB에 의해 증가하는 apoptosis를 억제하는 기능과 촉진하는 역할을 동시에 할 가능성을 시사한다.
UVB에 의한 피부 각질 세포 상해를 측정하기 위하여, HaCaT 세포에 UVB 를 조사한 후 유리되는 LDH를 측정하였다. 측정 결과, UVB 조사 시에 세포로부터 LDH 의 유리가 증가하였다. 또한, SM을 처리한 경우, UVB로 조사한 대조군에 비해 LDH의 유리를 억제하여, UVB에 의한 세포 상해를 억제하는 작용을 나타내었다(Fig.

후속연구

이상의 결과, SM은 UVB에 의한 피부 각질세포의 상해를 억제하였으며, 이는 UVB에 의해서 증가하는 apoptosis 관련 인자와 이들의 발현을 조절하는 단백질의 발현을 억제하여 나타난 결과로 판단되며, 향후 기능성 화장품의 재료로 응용될 수 있으리라고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	生脈散은 무엇인가?	生脈散은 元代李凍原12)의《內外傷辨感論》에 "夏月宣補者補天眞元氣非補熱火夏食寒者是也. 故以人蔘之甘補氣麥門冬苦寒瀉熱補水之源五味子之酸淸肅燥金, 名曰生脈散. 孫眞人云五月常服五味子以補五臟之氣亦此意也"라고 기재된 이래 暑熱로 인해 元氣와 津液이 손상되어 오는 氣短, 倦怠, 口渴, 汗出, 咳嗽 등을 치료하는데 활용되어 온 처방이다13,14). 최근 生脈散은 益氣生津하는 작용이 우수하여 임상에서 폐결핵, 만성기관지염 등의 폐질환에 활용되고 있다15). 生脈散에 관한 기존의 연구들로는 심혈관계에 미치는 영향16-18), 면역효과에 미치는 영향19), 항산화효능과 관련한 보고20-22) 등이 있다.
	본 연구에서 生脈散이 피부의 상해, 병변에 효과가 있으리라 생각한 이유는 무엇인가?	한의학적으로 피부는 肺臟에 歸屬하여 '肺主皮毛'하는데 肺氣가 허약해지면 皮毛가 溫養을 잃어 피부가 초췌해지고 마르게 되고 외사를 막는 능력이 저하되어 병변이 발생하게 된다. 生脈散은 肺臟의 氣陰을 補하는 작용이 뛰어나며 淸熱生津하는 효능이 우수하여 피부의 상해와 병변에 효과가 있으리라 사료되어 이번 연구에 활용하였으며, 生脈散이 자외선으로 자극된 피부 각질세포를 보호하고 자외선 조사 시에 피부 광노화에 관여하는 인자들을 억제할 수 있을 것이라는 가설을 설정하였다.
	한의학 임상에서 生脈散은 어떤 증상, 질환에 활용되는가?	方 중에 人蔘은 甘溫(歸經脾, 肺, 心)하여 補肺益氣하고 生津하며, 麥門冬은 甘寒(歸經-肺, 胃, 心)하여 養陰淸熱하고 止汗하며 潤肺滋水하고 淸心瀉熱하며, 五味子는 酸溫(歸經-肺, 心, 腎)하여 斂肺止汗하고 生津하는 효능이 있다. 임상에서는 일사병, 열사병, 심근염, 만성기관지염, 폐기종 등에 활용하고 있다35).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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