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문제 정의
- 본 연구에서는 전통발효식품인 김치로부터 식품 병원성 균 중의 하나인 Bacillus cereus에 대한 항균활성이 우수한 유산균을 분리 및 동정하였으며, 분리균주인 Lactococcus lactis ET45가 생산하는 박테리오신을 부분 정제하여 저해범위와 안정성 그리고 분자량을 조사하였다.
제안 방법
- 25 ml NB soft agar (0.8%, w/v)에 감수성 균주(B. cereus KCTC 3624, 1×106 CFU/ml)를 같이 혼합하여 고체배지 상에서 저해환 형성을 조사하였다.
- 혼합한 배지용액을 25 ml씩 분주하여 완전히 굳은 후, 살균된 tip을 이용하여 직경 5 mm의 구멍을 내고, 분리 균주의 상등액 100 μl를 접종하였다. 4℃에서 2-3시간 정도 방치하여 상등액이 확산되게 한 후 감수성 균주의 생육 최적 온도에서 18시간 이상 배양하여 저해환 생성여부를 확인하였다. 저해환을 생성하는 균주들의 박테리오신 생성 확인은 상등액을 proteinase K (20 mg/ml)로 처리하여 확인하였다.
- carnosum KCTC 3525, Leu. lactis KCTC 3528, L. plantarum KCTC 3099, L. plantarum KCTC 3104, L. confusus KCTC 3499, L. parabuchneri KCTC 3503, L. viridescens KCTC 3504, P. dextrinicus KCTC 3506, P. pentosaceus KCTC 3507, E. faecium KCTC 3095, L. monocytogenes KCTC 3444, B. cereus KCTC 1013, B. cereus KCTC 1014, B. cereus KCTC 3624, S. aureus 209 KCTC 1916, S. aureus R209 KCTC 1928, S. typhimurium KCTC 1926, E. coli KCTC 1924, E. coli KCTC 2191 및 C. albicans KCTC 1940 등에 대하여 항균력을 확인하였다. 각 지시균주의 최적 생육 온도에서 24시간 이상 배양하여 저해환의 생성 여부를 확인하였다.
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pH에 대한 안정성:
pH에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하기 위하여 pH 3.0 (0.1 M citrate buffer), pH 5.0 (0.1 M acetate buffer), pH 7.0 (0.1 M phosphate buffer), pH 9.0(0.1 M borate buffer) 및 pH 11.0 (0.1 M carbonate buffer)의 완충용액과 확보된 박테리오신 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 상온(25℃)에서 24시간 방치 한 후 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정하였다.
- albicans KCTC 1940 등에 대하여 항균력을 확인하였다. 각 지시균주의 최적 생육 온도에서 24시간 이상 배양하여 저해환의 생성 여부를 확인하였다.
- cereus KCTC 3624에 대한 저해환의 생성 유무로 확인하였다. 또한 동일한 조건에서 효소액만을 처리하지 않은 것을 대조구로 사용하였다.
- 그리고, proteinase K는 45℃에서 12시간 반응시켰다. 박테리오신 활성은 B. cereus KCTC 3624에 대한 저해환의 생성 유무로 확인하였다. 또한 동일한 조건에서 효소액만을 처리하지 않은 것을 대조구로 사용하였다.
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배양 온도의 영향:
분리균주 L. lactis ET45의 생육 및 박테리오신 생산에 대한 최적 배양온도를 결정하기 위하여, 배양 온도를 25℃, 30℃, 37℃로 하여 48시간 진탕 배양하였다. 그 결과를 Fig.
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배양 온도의 영향:
분리균주의 생육(growth)과 배양온도가 박테리오신의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 전 배양된 분리균주를 MRS 액체배지에 1.0% (v/v) 접종하고 25℃, 30℃, 및 37℃의 진탕 배양기에서 48시간 동안 배양하면서 일정한 시간 간격으로 배양 상등액을 회수하여 박테리오신 활성과 흡광도(OD 600)를 측정하여 균의 생육 곡선과 최대 항균활성을 나타내는 배양 온도를 결정하였다.
- 부분 정제된 박테리오신의 분자량을 추정하기 위하여 전기영동을 실시하였다. 지시균으로 B.
- 분리균주 L. lactis ET45가 생산하는 박테리오신을 부분정제하기 위하여 200 ml의 MRS 액체배지에서 30℃에서 12시간 전 배양한 후, MRS 배지 2 L에 1% (v/v)를 접종하여 30℃에서 24시간 본 배양을 수행하였다. 배양액을 원심분리(15,000 rpm, 30 min, 4℃) 및 0.
- 분리균주 L. lactis ET45가 생산하는 박테리오신의 특성을 확인하기 위하여 pH, 열, 유기용매, 가수분해 효소처리 조건하에서 안정성을 확인하였다.
- 분리균주 L. lactis ET45의 생육 및 박테리오신 생산에 대한 최적의 초기 pH를 결정하기 위하여, MRS를 기본배지로 하여 배지의 초기 pH를 각각 pH 3.5-9.5로 조절하고, 30℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 균체의 증식은 pH 9.
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열에 대한 안정성:
열에 대한 안정성의 조사는 제조된 박테리오신 용액을 40℃, 60℃, 80℃, 100℃ 및 121℃에서 각각 30분 또는 60분간 열처리 한 후 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정하였다.
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유기용매에 대한 안정성:
유기용매에 대한 안정성 실험은 chloroform, isopropanol, hexane, ethanol, acetone 및 acetonitrile 등을 제조된 박테리오신 용액과 같은 부피 비율로 혼합(1:1)하여 상온(25℃)에서 1시간 방치한 후, 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정함으로써 여러 유기용매에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하였다.
- 본 연구에 사용된 항균활성 물질 생산균주는 가정용 및 시판용 김치 등으로부터 분리하였으며, 항균활성의 측정에 사용된 감수성균주는 미생물자원 센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양 받은 표준균주를 사용하였다. 유산균 배양배지는 MRS Broth (Difco, USA)와 세균의 배양은 Nutrient Broth (NB, Difco)를 이용하여 배양하였다.
- 전기영동 이 끝난 gel은 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색을 하였고, 다른 gel은 50% methanol과 10% acetic acid에서 30분간 고정시키고, 멸균수로 4시간 동안 세척한 다음 이 gel을 plate 위에 무균적으로 건조시키고 그 후지시균(B. cereus, 1.0×106 CFU/ml)이 포함된 NB soft agar (0.8%) 10 ml을 중충한 다음 30℃에서 하룻밤 동안 배양한후, 지시균에 대해 억제환이 형성되는 band와 염색한 gel 상에서의 band를 상호비교하였다.
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초기 배양 pH의 영향:
배지의 초기 pH가 분리균주의 생육과 박테리오신 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 1 N HCl와 1 M NaOH로 pH 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 및 pH 9.5으로 맞춘 MRS 액체배지에 전 배양한 분리균주를 1.0% (v/v) 접종하고 접종하고 30℃에서 24시간 배양 한 후 배양액으로부터 상등액을 회수하여 박테리오신 활성과 흡광도(OD 600)를 측정하여 균의 생육곡선과 최대 항균활성을 나타내는 배지의 pH를 결정하였다.
- 박테리오신 생산 균주의 동정은 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다(12). 최적 생육 온도, 그람 염색, 운동성, catalase test, CO2 생성 유무를 확인하였다. 최종적으로 16S rRNA gene을 증폭하여 분리 균주를 동정하였다.
대상 데이터
- B. cereus KCTC 3624 was used as an indicator.
- cereus KCTC 3624에 대한 항균활성을 측정하였다. B. cereus의 생육 저해활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선택하여 ET45로 명명하고 본 실험에 사용하였다. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법에 따라 L.
- 본 연구에 사용된 항균활성 물질 생산균주는 가정용 및 시판용 김치 등으로부터 분리하였으며, 항균활성의 측정에 사용된 감수성균주는 미생물자원 센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양 받은 표준균주를 사용하였다. 유산균 배양배지는 MRS Broth (Difco, USA)와 세균의 배양은 Nutrient Broth (NB, Difco)를 이용하여 배양하였다.
- cereus KCTC 3624, 1×106 CFU/ml)를 같이 혼합하여 고체배지 상에서 저해환 형성을 조사하였다. 저해환을 형성하는 분리 균주를 선별하여 박테리오신 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 최종적으로 16S rRNA gene을 증폭하여 분리 균주를 동정하였다. Genomic DNA는 Walter 등의 방법(33)에 따라 분리하였으며, primers로는 27F primer (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R primer (TACGGYTACCTTGTT ACGACTT)를 사용하였고, PCR 조건은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension의 cycle을 35회 하였다. 16S rRNA 염기서열 확인은 솔젠트(주)사에 의뢰하여 확인하였다(11).
- 김치 시료로부터 형태학적인 특성에 따라 상이한 200균주의 유산균을 분리 하였으며, well diffusion method를 이용하여 B. cereus KCTC 3624에 대한 항균활성을 측정하였다. B.
- 박테리오신 생산 균주의 동정은 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다(12).
- 분리균주들의 박테리오신 생산 여부는 well diffusion assay 방법을 사용하여 판별하였다(15, 31). 선별된 유산균을 18시간이상 MRS 배지에서 배양한 다음 원심분리(15,000 rpm, 25 min, 4℃) 및 membrane filter (0.
- 항균물질의 분자량을 측정하기 위하여 아세톤 침전법으로 부분 정제한 박테리오신 시료를 사용하여 tricine-SDS-PAGE를 실시하였다(28). Gel 농도는 16.
성능/효과
- Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법에 따라 L. lactis 표준균주와 생화학적 특성을 비교․ 분석한 결과, mannitol과 raffinose 이용 여부 및 arginine hydrolysis 제외한 대부분은 표준균주와 동일한 특성을 나타냄을 확인하였다(Table 1).
- pH에 대한 안정성 여부를 조사하기 위하여 부분 정제된 항균물질 용액에 완충용액을 가하여 pH를 조절한 뒤 잔존활성을 측정한 결과, 분리 균주가 생산하는 박테리오신은 pH 3.0-5.0에서 어떠한 활성의 소실 없이 안정하였고 그 밖의 범위에서는 점차 활성이 감소하는 경향을 나타내었으나 그 활성이 완전하게 소실되지는 않았다(Table 3).
- 2). 따라서 L. lactis ET45의 박테리오신의 최대 활성은 MRS 액체배지 초기 pH 7.5으로 조정하여 30℃에서 18-24시간 배양하는 동안 나타나는 것으로 확인하였다.
- 0에서는 박테리오신 활성이 불안정하고 보고된 바 있다(26). 따라서, 본 연구에서 선발된 박테리오신은 다른 연구자들에 의해 보고된 박테리오신들에 비해 비교적 pH 안정성이 우수한 것으로 나타났다.
- 5순으로 나타났다. 박테리오신의 활성은 pH 7.5에서 가장 높은 활성을 나타내었다(Fig. 2). 따라서 L.
- Lactis YH-10가 생산하는 박테리오신의 경우 100℃, 60분간 열 처리시 약 50%의 항균활성을 나타낸다고 보고하였다(5). 본 연구에서 분리한 L. lactis ET45가 생산하는 박테리오신은 40℃-121℃에서 열 처리시에도 매우 안정하였다(Table 3). 그러나 박테리오신의 구조를 포함한 분자 생물학적 특성을 알기 위해서는 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다.
- 분리균주 L. lactis ET45가 생산하는 박테리오신의 항균범위를 알아보기 위해 식품유래 병원성균 및 다양한 표준균주 L. mesenteroides KCTC 3100, L. carnosum KCTC 3525, L. lactis KCTC 3528, L. plantarum KCTC 3099, L. plantarum KCTC 3104, L. confusus KCTC 3499, L. parabuchneri KCTC 3503, L. viridescens KCTC 3504, P. dextrinicus KCTC 3506, P. pentosaceus KCTC 3507, E. faecium KCTC 3095, L. monocytogenes KCTC 3444, B. cereus KCTC 1013, B. cereus KCTC 1014, B. cereus KCTC 3624, S. aureus 209 KCTC 1916, S. aureus R209 KCTC 1928, S. typhimurium KCTC 1926, E. coli KCTC 1924, E. coli KCTC 2191 및 C. albicans KCTC 1940 등 총 21개의 표준 균주를 이용하여 항균 활성을 확인한 결과, Table 4와 같이 L. monocytogenes KCTC 3444, S. aureus 209 KCTC 1916, S. aureus R209 KCTC 1928, S. typhimurium KCTC 1926, E. coli KCTC 1924, E. coli KCTC 2191 및 C. albicans KCTC 1940을 제외한 다양한 미생물에 대한 항균활성을 나타내었다. 특히 발효식품의 주요 식품유해균으로 알려진 B.
- 분리균주 L. lactis ET45가 생산하는 항균활성 물질의 단백질성 여부를 확인하기 위하여 용액에 각종 단백질분해효소를 2 mg/ml의 농도가 되도록 첨가하여 반응시킨 후 잔존활성을 측정한 결과, proteinase K, trypsin, chymotrypsin, 및 subtilisin A에 의해서는 항균활성이 소실되었으며, pepsin, protease, α-amylase에 의해서는 항균활성이 소실되지 않았다(Table 2).
- 유기용매에 대한 안정성의 경우 hexane, chloroform, acetone, acetonitrile, isopropanol, ethanol을 최종 농도 50%(v/v)로 처리할 경우 항균활성에 변화가 없는 것으로 보아 유기 용매에 매우 안정함을 확인 할 수 있었다(Table 3).
- 부분 정제된 박테리오신의 분자량을 추정하기 위하여 전기영동을 실시하였다. 지시균으로 B. cereus를 사용하여 항균효과를 비교한 결과, Fig. 3에서 보는 바와 같이, 대략 4.5 kDa에 위치하고 있는 band에서 항균활성을 나타내었다.
- lactis 표준균주와 생화학적 특성을 비교․ 분석한 결과, mannitol과 raffinose 이용 여부 및 arginine hydrolysis 제외한 대부분은 표준균주와 동일한 특성을 나타냄을 확인하였다(Table 1). 최종적으로, NCBI의 BLAST program을 이용하여 ET45의 16S rRNA 염기서열에 대한 상동성을 분석한 결과, 99%의 신뢰도로 Lactococcus lactis subsp. lactis로 동정되었다.
후속연구
- lactis ET45가 생산하는 박테리오신은 40℃-121℃에서 열 처리시에도 매우 안정하였다(Table 3). 그러나 박테리오신의 구조를 포함한 분자 생물학적 특성을 알기 위해서는 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다.
- 본 L. lactis ET45 균주가 생산하는 박테리오신은 유산균이 생산하는 박테리오신 중 열에 안정하며, 분자량이 5 kDa 이하의 박테리오신이 속하는 Class I 박테리오신으로 추정되며, 정확한 분류 및 분자량 등의 특징을 파악하기 위해서는 박테리오신의 순수분리 및 단백질 염기서열의 분석 작업 등이 필요하다.
- albicans KCTC 1940을 제외한 다양한 미생물에 대한 항균활성을 나타내었다. 특히 발효식품의 주요 식품유해균으로 알려진 B. cereus에 대해서는 강한 항균 활성을 나타냄으로써 향후 식품산업의 천연 식품보존제로서의 활용가능성도 기대할 수 있을 것이다.
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