선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 김치 내에서 미생물의 생육을 조절하고 김치의 저장성과 안전성을 향상시키고자 김치로부터 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리하고 황산암모늄 침전법, 이온교환 크로마토그래피, SDS-PAGE를 이용하여 정제한 후 박테리오신의 분자량 및 그 특성을 확인하고자 한다.
- 분리주의 생육온도가 세포성장과 박테리오신 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 온도별 세포생장의 경우 37℃에서 유도기가 없이 상대적으로 빨리 자라기 시작하였으나 30℃와 25℃에서는 6시간과 12시간의 유도기를 거친 후 자라기 시작하였다.
제안 방법
- 1% TFA)를 0~100% 농도구배를 걸어주고 그 다음 10분간은 100% buffer B로 세척하였다. 1.0 ml/min의 유속으로 흘러주었고 각 peak 별로 회수한 1 ml 분획의 박테리오신 활성을 조사하여 활성이 있는 분획을 합치고 농축한 후 1차 HPLC와 같은 조건으로 2차 HPLC를 실시하여 박테리오신을 정제하였다.
- sp. KD28을 100 ml MRS 액체배지에서 25℃, 30℃ 및 37℃, 200 rpm에서 48시간 배양하면서 6시간 마다 배양액을 회수하여 600 nm에서 흡광도를 재어 세포생장을 측정하였다. 나머지 배양액을 원심분리하여 얻은 배양 상등액의 M.
- pH가 박테리오신의 항균활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 시료를 pH 2.0에서 pH 12.0 범위에 해당되는 완충용액과 시료의 부피를 1:1로 혼합한 후 상온에서 24시간 배양한 후 잔존활성을 측정한 결과를 나타내었다(Fig. 5). pH 8.
- pH에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하기 위하여 pH 2.0 (0.1 M citrate buffer), pH 4.0 (0.1 M acetate buffer), pH 6.0 (0.1 M phosphate buffer), pH 8.0 (0.1 M tris buffer), pH 10.0 (0.1 M carbonate buffer) 및 pH 12.0 (0.1 M phosphate buffer) 의 완충용액과 배양 상등액을 부피비 1:1로 혼합하고 상온에서 24시간 반응시킨 후 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정하였다.
- 5% SDS 등의 반응액에서 각 효소의 최종 2 mg/ml 되게 첨가하고 37℃에서 4시간 그리고 proteinase K는 45℃에서 12시간 반응시켰다. 남아있는 박테리오신 활성은 M. luteus IAM 1056 에 대한 저해환의 크기를 측정하였다. 또한 음성대조구로는 동일한 조건하에서 시료대신 멸균수를 첨가한 것을 사용하였다[12, 20].
- 동결 건조한 분리주를 0.45 μm 여과지를 통해 여과한 후 buffer A (0.1% TFA in HPLC grade water) 용액으로 평형화시킨 C18 column (Agilent Eclipse XDB-C18)을 사용하여 분리하였다.
- luteus IAM 1056 에 대한 저해환의 크기를 측정하였다. 또한 음성대조구로는 동일한 조건하에서 시료대신 멸균수를 첨가한 것을 사용하였다[12, 20].
- 박테리오신의 열안정성을 조사하기 위하여 배양 상등액을 20℃, 40℃, 60℃, 80℃ 및 100℃에서 1시간 배양하면서 10분 간격으로 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정하였다[20].
- 분리주의 분자계통학적 동정을 위해 primer로 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)와 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)를 사용하였고, PCR 조건은 95℃에서 15분 처리 후, 95℃에서 20초, 50℃에서 40초, 72℃에서 90초로 구성된 PCR cycle을 30회 반복하고, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and clean-up system (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- KD 28의 배양 상등액과 부피 1:1의 비율로 혼합하여 용매의 최종 농도를 50%로 맞추었다. 상온에서 24시간 배양한 후, 유기용매에 대한 잔존하는 박테리오신의 항균 활성을 측정하였다[20].
- 나머지 gel은 3차 증류수를 30분마다 교체하면서 5회 세척하였다. 세척한 gel을 petri dish에 넣고 UV를 10분간 조사시킨 후 1% M. luteus IAM 1056 가 접종된 ENB soft agar를 중층 하여 30℃에서 18시간 배양하여 항균활성을 확인하였다[24].
- 전통발효식품에서 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리하고 박테리오신을 정제하고 특성을 조사하기 위해 일차적으로 창원시 가정집에서 배추김치를 수집하였다. 김치국물을 멸균된 생리식염수에 10-1~10-5 희석하여 Lactobacilli De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 고체 배지에 도말한 후 37℃에서 배양하고 나타난 집락의 형태학적 특성에 근거하여 분리주를 선정하였다.
- 분리주의 분자계통학적 동정을 위해 primer로 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)와 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)를 사용하였고, PCR 조건은 95℃에서 15분 처리 후, 95℃에서 20초, 50℃에서 40초, 72℃에서 90초로 구성된 PCR cycle을 30회 반복하고, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and clean-up system (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 GenBank의 ribosomal DNA sequence Datebase와 비교하였으며, 염기서열의 상동성은 Clustal X 2.
- 배양 상등액의 항균활성을 검증을 위해서 well diffusion method [30]를 사용하였다. 지시균(indicator)인 M. luteus IAM 1056 배양액을 1% 농도로 접종하고 0.1 M potassium phosphate (pH 7.0) 완충액을 함유한 enriched nutrient broth (ENB, 1.25% brain heart infusion, 0.55% nutrient broth, 0.25% yeast extract) soft agar (0.8% agar) 10 ml를 ENB 고체 배지에 중층하여 test plate를 제조하였다[8, 13, 28]. 분리주의 배양 상등액을 50 μl 씩 well에 얹고 무균대에서 30분간 건조한 후 30℃에서 18시간 배양하여 well 주위에 생육 저해환의 유무를 관찰하였다[32].
- 0 M NaCl gradient를 걸어주어 이온교환체에 결합한 단백질을 용출하면서 분획을 2 ml씩 받고 이를 280 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 지시균인 M. luteus IAM 1056에 항균활성이 있는 분획을 합치고 증류수에서 투석을 한 다음 동결건조로 농축하였다.
- KD 28균주의 배양 상등액 500 ml을 65%의 황산암모늄으로 포화시킨 후 4℃에서 3시간 교반한 후 원심분리(15,000 rpm, 25 min, 4℃)하였다. 침전물을 회수하여 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) 40 ml에 녹이고, MWCO가 1,000인 투석막(Spectrum Laboratories, Houston, TX, USA)을 사용하여 하룻밤 투석한 후 항균활성을 측정하였다[14, 20].
- luteus IAM 1056에 대한 생육저해 여부를 조사한 결과 분획 중 85~102번째 분획에서 항균활성이 나타났다. 항균활성 분획을 투석 및 동결 건조 시킨 후에 3차 증류수에 용해시켜 RP-HPLC를 통해 정제를 하였는데 C18 column에서 박테리오신의 정제는 2번 실시하였고 이 때의 크로마토그램은 Fig. 6와 같다. C18 column으로 분석한 결과 단일 peak로 확인되었고 peak가 나타난 분획을 회수하여 tricine-SDS-PAGE 전기영동에 사용하였다.
대상 데이터
- ivanovii subsp. ivanovii KCTC 3444, X. citri KCTC 2499 등(Table 1)을 시험균주로 사용하여 저해환의 지름을 측정하였다[20].
- 전통발효식품에서 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리하고 박테리오신을 정제하고 특성을 조사하기 위해 일차적으로 창원시 가정집에서 배추김치를 수집하였다. 김치국물을 멸균된 생리식염수에 10-1~10-5 희석하여 Lactobacilli De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 고체 배지에 도말한 후 37℃에서 배양하고 나타난 집락의 형태학적 특성에 근거하여 분리주를 선정하였다. 선정된 균주를 4 ml의 MRS 액체배지 37℃에서 하룻밤 배양하고 원심분리한 후 상등액을 회수하여 항균활성 확인에 사용하였다[14, 20].
- MRS 고체배지에 생성된 형태학적인 특징에 따라 16주를 분리하여 ４ ml의 MRS 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하여 회수한 배양 상등액을 well diffusion method [29]으로 항균활성을 나타내는 시료를 일차적으로 선별하였다. 이 중에서 상대적인 항균 범위가 넓고 가수분해 효소인 proteinase K를 처리했을 때 항균 활성이 상실되는 단백질성 항균물질이 생산하는 분리주를 최종적으로 선별하였다. 선정한 분리주의 주사전자현미경 사진을 Fig.
데이터처리
- 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and clean-up system (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 GenBank의 ribosomal DNA sequence Datebase와 비교하였으며, 염기서열의 상동성은 Clustal X 2.0 software, DNADIST 프로그램 및 MEGA 5.0 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree analysis을 수행하여 확인하였다[2, 14].
이론/모형
- MRS 고체배지에 생성된 형태학적인 특징에 따라 16주를 분리하여 ４ ml의 MRS 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하여 회수한 배양 상등액을 well diffusion method [29]으로 항균활성을 나타내는 시료를 일차적으로 선별하였다. 이 중에서 상대적인 항균 범위가 넓고 가수분해 효소인 proteinase K를 처리했을 때 항균 활성이 상실되는 단백질성 항균물질이 생산하는 분리주를 최종적으로 선별하였다.
- KD28을 100 ml MRS 액체배지에서 25℃, 30℃ 및 37℃, 200 rpm에서 48시간 배양하면서 6시간 마다 배양액을 회수하여 600 nm에서 흡광도를 재어 세포생장을 측정하였다. 나머지 배양액을 원심분리하여 얻은 배양 상등액의 M. luteus IAM 1056에 대한 항균활성을 well diffusion method으로 측정하였다[11].
- 박테리오신의 항균 스펙트럼은 well diffusion method [21]를 사용하여 조사하였다. M.
- 배양 상등액의 항균활성을 검증을 위해서 well diffusion method [30]를 사용하였다. 지시균(indicator)인 M.
- 분리주를 MRS 액체배지에서 30℃, 48시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양 상등액의 박테리오신 활성은 256 AU/ml 이었고, 황산암모늄 침전법으로 정제된 박테리오신 활성은 1,280 AU/ml으로 활성을 나타내었다. 분리주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위하여 배양 상등액 중의 단백질을 황산 암모늄 침전법으로 농축시킨 후 이온교환 크로마토그래피와 역상 HPLC를 실시하여 정제를 시도한 결과는 Table 4와 같다.
- 정제한 박테리오신의 순도와 분자량을 추정하기 위해 Schägger와 Von Jagow [26, 27]의 방법으로 tricine SDS-PAGE를 실시하였다.
성능/효과
- 5). pH 8.0까지의 영역에서 항균활성을 유지하여 안정하다는 것을 알 수 있었다. 대부분의 유산균이 생산하는 박테리오신은 낮은 pH에서 활성을 보이거나, 매우 좁은 범위의 pH에서만 안정한 것으로 알려져 있다.
- 일부 단백질 분해효소에 의해 활성이 소실되지 않은 것은 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 타이로신, 카르복실기 c-말단, 등과 같은 특이적인 절단부위가 없거나 반응시킨 효소농도의 문제로 추정된다[14]. 단백질 가수분해효소인 lipase, carboxypeptidase A 및 proteinase K에 의해서는 박테리오신의 활성이 제거됨으로써 단백질성 물질임을 확인할 수 있었다. 단백질분해효소에 대한 감수성은 class II 박테리오신의 전형적인 성질이다[17].
- 4 kDa인 분자량을 가지는 것으로 추정되었다. 또한 항균활성을 알아보기 위하여 전기영동 한 gel을 멸균된 3차 증류수로 30분간 5회 세척한 후 M. luteus IAM 1056가 접종된 ENB soft agar를 중층하여 박테리오신의 활성을 조사한 결과 염색한 gel의 밴드와 일치하는 곳에 저해환이 생겨 박테리오신임을 확인할 수 있었다. 본 실험에서 분리된 박테리오신은 분자량이 적은 펩타이드에 속하며 소수성 아미노산으로 구성되어 있을 것으로 추정된다.
- 부분 정제한 박테리오신 용액에 여러 종류의 가수분해효소를 2 mg/ml의 농도가 되도록 첨가하여 반응시킨 후 항균물질의 활성을 측정한 결과, proteinase K에 의해서는 항균활성이 완전히 소실되어 항균 활성물질이 단백질성 물질인 박테리오신임을 확인할 수 있었다(Table 2). 일부 단백질 분해효소에 의해 활성이 소실되지 않은 것은 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 타이로신, 카르복실기 c-말단, 등과 같은 특이적인 절단부위가 없거나 반응시킨 효소농도의 문제로 추정된다[14].
- 4). 이를 토대로 분리주가 생산하는 박테리오신은 비교적 열에 안정함을 알 수 있었다. 미생물로부터의 항균물질은 저분자의 펩타이드로써 일반적으로 열에 안정한 것으로 알려져 있다.
- 7과 같다. 정제된 박테리오신은 단일 밴드를 나타내었고 분자량 표준 marker(Bio-Rad)와 비교한 결과 약 3.4 kDa인 분자량을 가지는 것으로 추정되었다. 또한 항균활성을 알아보기 위하여 전기영동 한 gel을 멸균된 3차 증류수로 30분간 5회 세척한 후 M.
- 항균물질을 20℃~100℃범위에서 60분 동안 배양하여 열 안정성을 조사한 결과 20℃~80℃에서 60분간 처리부터 항균활성이 감소하기 시작하여 30분간 처리시 50%의 항균활성을 나타내었고 50분간 처리할 경우 항균활성이 완전히 사라졌다(Fig. 4). 이를 토대로 분리주가 생산하는 박테리오신은 비교적 열에 안정함을 알 수 있었다.
- 황산암모늄 침전법으로 농축한 시료를 column에 통과시킨 후 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) 천천히 흘려준 후에 NaCl gradient를 걸어 주어 column에 결합된 단백질을 완전히 용출시킨 결과를 M. luteus IAM 1056에 대한 생육저해 여부를 조사한 결과 분획 중 85~102번째 분획에서 항균활성이 나타났다. 항균활성 분획을 투석 및 동결 건조 시킨 후에 3차 증류수에 용해시켜 RP-HPLC를 통해 정제를 하였는데 C18 column에서 박테리오신의 정제는 2번 실시하였고 이 때의 크로마토그램은 Fig.
후속연구
- 또한 gel에 나타난 밴드가 확산되는 현상 또한 박테리오신 분자가 강한 소수성에 기인하고 다수의 항균성 펩타이드들과 지시균 세포막과의 상호작용과 관계된 사실을 뒷받침한다[10, 12]. 한국고유의 전통식품인 김치에서 분리한 젖산균인 박테리오신은 비교적 항균범위가 넓고 식품에서 발생하기 쉬운 병원성 미생물에서 저해효과를 보이고 있으므로 앞으로 추가 연구를 통해 무독, 무해의 천연 식품 보존제로서의 응용이 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.