선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
제안 방법
- C4-dicarboxylates 대사의 거동특성에 핵심적인 영향을 미치는 dctA 유전자의 전체적인 발현특성을 이해하기 위해서 우리는 dctA 유전자 발현을 Green fluorescence protein (GFP) 리포터를 이용하여 측정할 수 있는 박테리아 시스템을 구축하였다(Fig. 1). 다양한 푸마르산 농도 조건에서 dctA 유전자 활성화 특성이 복합배지와 최소배지에서 조사되었다.
- coli는 DcuS/R TCS를 이용하여 외부의 푸마르산을 모니터하고, 이의 흡수 및 호기성 대사과정에 관련된 유전자 발현을 조절한다. DcuS/R의 활성화 기작을 이해하기 위해서 dctA 프로모터와 GFP를 융합하여 리포터 플라스미드를 구축하였으며, 이것은 외부의 푸마르산에 반응하여 GFP 형광을 발현한다. 본 연구에서 DcuS/R TCS에 의하여 발현이 조절되는 dctA 유전자의 프로모터와 gfp 리포터 유전자를 pUC19 플라스미드에 삽입하여, 다양한 푸마르산 농도에서 GFP 발현 및 형광도를 관찰하였다.
- E. coli (pDGFP1) 균주의 dctA 유전자 발현을 확인하기 위하여 다양한 범위의 푸마르산을 함유한 LB와 M9 배지에서 GFP 형광을 측정했다. 다양한 푸마르산 농도(0, 0.
- 균주는 reflected fluorescence microscope (Olympus, Japan)와 charge-coupled device camera (B&W SenSys, KAF1401)를 이용하여 100× 배율로 형광발광을 측정하였다. Emission intensity는 MetaMorph image analysis software (Molecular devices, USA)를 이용하여 기록되었으며 excitation과 emission filter는 EGFP 이미지의 최적조건으로 조정되었다.
- Polymerase chain reaction (PCR)은 Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 이용하여 MJ mini Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, USA)에서 수행하였다. Oligonucleotides dctA FEcoRI와 GFP RBamHI을 사용하여 overlap PCR을 수행하여 dctA 프로모터와 gfp 유전자를 통합하였다(Table 1). PCR product를 pUC19 플라스미드(NEB, USA)에 클로닝하여 pDGFP1 플라스미드(Fig.
- Oligonucleotides dctA FEcoRI와 GFP RBamHI을 사용하여 overlap PCR을 수행하여 dctA 프로모터와 gfp 유전자를 통합하였다(Table 1). PCR product를 pUC19 플라스미드(NEB, USA)에 클로닝하여 pDGFP1 플라스미드(Fig. 2)를 제작하였으며, 이를 E. coli 균주에 형질전환시켰다(13). 구축된 pDGFP1 플라스미드의 염기서열은 oligonucleotides dctA FEcoRI 와 GFP RBamHI를 이용한 primers extension sequencing을 통해 확인하였다(Table 1).
- GFP를 암호화하는 gfp 유전자는 oligonucleotides GFP FPstI와 GFP RBamHI을 사용하여 pPROBE-NT’ 플라스미드로부터 증폭되었다(Table 1)(5). Polymerase chain reaction (PCR)은 Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 이용하여 MJ mini Personal Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, USA)에서 수행하였다. Oligonucleotides dctA FEcoRI와 GFP RBamHI을 사용하여 overlap PCR을 수행하여 dctA 프로모터와 gfp 유전자를 통합하였다(Table 1).
- Spectrofluorimeter의 excitation 파장은 490/10 nm, 그리고 emission 파장은 510/10 nm로 작동하였다. Specific fluorescence intensity (SFI)는 각각의 시점에서 측정한 형광도를 그에 상응하는 600 nm에서 측정한 흡광도로 나눈 값으로 각각의 시료로부터 최소한 3개의 측정치를 구하였다.
- dctA 프로모터에 의한 GFP 발현 여부를 분석하기 위하여 푸마르산 유도 4시간 후 균주의 형광도를 측정하였다. 균주를 3,500×g, 4℃ 조건에서 5분 동안 원심분리를 수행한 후, 원심 분리 된 균주를 phosphate buffered saline (PBS) 용액을 이용하여 씻고 0.
- coli 균주에 형질전환시켰다(13). 구축된 pDGFP1 플라스미드의 염기서열은 oligonucleotides dctA FEcoRI 와 GFP RBamHI를 이용한 primers extension sequencing을 통해 확인하였다(Table 1).
- 균주는 reflected fluorescence microscope (Olympus, Japan)와 charge-coupled device camera (B&W SenSys, KAF1401)를 이용하여 100× 배율로 형광발광을 측정하였다.
- 균주를 3,500×g, 4℃ 조건에서 5분 동안 원심분리를 수행한 후, 원심 분리 된 균주를 phosphate buffered saline (PBS) 용액을 이용하여 씻고 0.3% 아가로즈가 첨가된 PBS 용액으로 re-suspend 시켰다.
- coli (pDGFP1) 균주의 dctA 유전자 발현을 확인하기 위하여 다양한 범위의 푸마르산을 함유한 LB와 M9 배지에서 GFP 형광을 측정했다. 다양한 푸마르산 농도(0, 0.1, 1.0, 10, 50 mM)에서 흡광도와 형광을 측정하였다. 균주의 성장은 spectrophotometer (Shimadzu, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 통해 확인하였다.
- DcuS/R의 활성화 기작을 이해하기 위해서 dctA 프로모터와 GFP를 융합하여 리포터 플라스미드를 구축하였으며, 이것은 외부의 푸마르산에 반응하여 GFP 형광을 발현한다. 본 연구에서 DcuS/R TCS에 의하여 발현이 조절되는 dctA 유전자의 프로모터와 gfp 리포터 유전자를 pUC19 플라스미드에 삽입하여, 다양한 푸마르산 농도에서 GFP 발현 및 형광도를 관찰하였다. E.
- 시간에 따른 dctA 유전자의 발현특성을 파악하기 위하여, 푸마르산 첨가 후에 일정한 시간 간격으로 GFP에 의한 형광을 측정하였다. 시간에 따라서 형광이 점차적으로 증가하는 경향을 보여주었으며, 형광도는 첨가 후 16시간이 지난 후에 가장 높음을 확인하였다(Fig.
- 푸마르산 농도에 따른 dctA 유전자의 발현특성을 정량분석하기 위하여 푸마르산 농도와 그에 상응하는 SFI 사이의 상관관계를 분석하였다. M9 배지에서의 경우, 0.
- 배양배지는 LB 와 M9 배지를 이용하였다. 형광현미경을 사용하여 재조합 균주의 형광도를 관찰한 결과, LB 배지에는 2시간 후에 약한 형광발광을 관찰하였다. M9 배지에서 배양하였을 경우 1 mM 이상의 푸마르산 농도에서 GFP에 의한 형광을 관찰할 수 있었으며, 형광도는 푸마르산의 농도가 증가함에 따라 함께 증가하는 경향을 보여주었다.
대상 데이터
- E. coli XL1-Blue가 재조합 균주로 사용되었으며, 연구에서 사용된 박테리아 종류와 제작된 플라스미드는 Table 1에 정리하였다. 균주배양을 위한 배지는 Luria-Bertani (LB) 배지(10 g/L bacto-tryptone, 5 g/L bacto-yeast extract, 5 g/L NaCl) 그리고 M9 최소배지(2 mM MgSO4, 0.
- coli XL1-Blue가 재조합 균주로 사용되었으며, 연구에서 사용된 박테리아 종류와 제작된 플라스미드는 Table 1에 정리하였다. 균주배양을 위한 배지는 Luria-Bertani (LB) 배지(10 g/L bacto-tryptone, 5 g/L bacto-yeast extract, 5 g/L NaCl) 그리고 M9 최소배지(2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 1% Thiamine HCl, 0.4% glucose)가 사용되었다. 항생물질로 ampicillin (100 mg/L)을 첨가하였으며, 균주는 37℃, 225 rpm에서 배양되었다.
- 4). 배양배지는 LB 와 M9 배지를 이용하였다. 형광현미경을 사용하여 재조합 균주의 형광도를 관찰한 결과, LB 배지에는 2시간 후에 약한 형광발광을 관찰하였다.
- 푸마르산 농도에 따른 dctA 유전자의 발현 특성을 파악하기 위하여, E. coli (pDGFP1) 균주를 0.1-50 mM 농도의 푸마르산을 포함한 배지에서 배양하였다(Fig. 4). 배양배지는 LB 와 M9 배지를 이용하였다.
이론/모형
- 균주의 성장은 spectrophotometer (Shimadzu, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 통해 확인하였다. 균주의 GFP 형광발광 정도는 RF-5301PC Spectrofluorimeter (Shimadzu)를 이용하여 측정되었다. Spectrofluorimeter의 excitation 파장은 490/10 nm, 그리고 emission 파장은 510/10 nm로 작동하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.