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문제 정의
- 본 연구에서는 병원 감염의 주요 원인균으로 생물막 관련 감염증에서 흔히 분리되고 있는 Citrobacter, Enterobacter 및 Serratia 등의 임상분리 장내세균 22주를 대상으로 생물막 형성능을 조사하고, 생물막의 세포외 바탕질의 구성 성분을 알아보기 위하여 Congo-red 한천배지상의 집락 형상과 calcofluor 염색을 시행하였다. 또한 curli 생성 오페론인 csgBA(C) 유전자의 유무 확인과 csgA 유전자의 염기서열을 규명하였다.
- 상기의 균주들을 대상으로 curli 생성에 중요한 구조 단백질인 csgA 유전자의 보유 유무를 확인하기 위해서 csgA유전자의 보유 유무를 조사하였다. 22주 가운데 5주(C.
제안 방법
- 0.1% crystal violet 염색용액으로 15분간 염색하고 200 μl의 phosphate buffered saline (PBS) 완충용액으로 두 번 세척한 후 생물막을 관찰하였다.
- Calcofluor 염색법: 임상검체 분리균주의 셀룰로오스 생성을 확인하기 위한 방법으로 BHI 한천 배지에 균주를 도말하고 37°C에서 24시간 또는 28°C에서 48시간 배양하였다. 1 mg/ml농도의 calcofluor 염색용액(Calcofluor white M2R, Sigma, USA)으로 5분간 염색하고, PBS로 세 번 세척한 후 UV (350-400 nm) 하에서 균집락의 발광정도를 관찰하였다.
- 94°C에서 5분간 DNA를 변성시킨 다음, 94°C에서 1분, 57°C에서 1분 그리고 72°C에서 1분간 35회 반복하고, 72°C에서 10분간 반응시켰다. 1% agarose gel 전기영동을 통해 생성된 DNA를 확인하였다.
- marcescens 7주 및 Pantoea spp. 1주를 포함한 22주의 임상검체 분리균주들을 대상으로 catheter의 주요 성분인 폴리스틸렌(polystyrene)에 대한 생물막 형성능을 분석하였다(Fig. 1과 Table 1). 37°C에서 24시간 배양 후 생물막 형성능을 분석한 결과는 음성 대조균주로 사용한 E.
- 2). Congo-red 염색결과에 따라, 적색의 rough 표면을 갖는 집락(rdar: red, dry, and rough), 갈색 또는 핑크색의 smooth 표면을 갖는 집락 (bas/pas: brown and smooth/pink and smooth), 갈색의 rough 표면을 갖는 집락(bdar: brown, dry, and rough), 갈색의 smooth 표면을 갖는 집락(bas: brown and smooth), 핑크색의 smooth 표면을 갖는 집락(pas: pink and smooth) 및 smooth 표면을 갖는 흰색 집락(saw: smoothand white) 등으로 분류하였다(Table 1). 28°C에서 48시간 배양 조건하에서는 rdar형은 C.
- Congo-red 염색법: 임상검체 분리균주의 집락성상을 관찰하기 위한 방법으로 1% sucrose 및 0.8% Congo red dye가 포함된 BHI 한천 배지에 균주를 도말하고 37°C에서 24시간 또는 28°C에서 48시간 배양 후 균집락의 색을 관찰하였다.
- PCR 반응을 통해 증폭된 csgBA(C) 오페론 유전자의 염기서열 분석을 위하여, PCR purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR 산물을 순수 정제한 후 염기서열 분석 전문 회사인 바이오넥스(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하고, GenBank의 BLAST search program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 이용하여 csgBA(C) 오페론에 삽입되어 있는 csgA 유전자 염기서열과 일치하는지를 확인하였다. csgA유전자의 아미노산 염기서열 번역은 ExPASy Proteomics Server(http://www.
- Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 균주로부터 genomic DNA를 분리하였다. csgBA(C) 오페론 유전자에 대한 특이적인 primer 쌍 (S: 5′-ATGATGT TAACAATACTGGGTGC-3′, AS:5′-TTTTTGCAGCAGATC GATAGAA-3′)을 이용하여 다음과 같이 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
- csgBA(C) 오페론 유전자에 대한 특이적인 primer 쌍 (S: 5′-ATGATGT TAACAATACTGGGTGC-3′, AS:5′-TTTTTGCAGCAGATC GATAGAA-3′)을 이용하여 다음과 같이 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
- 각 균주로부터 추출한 0.5 μl의 genomic DNA를 주형으로 사용하여 5 μl의 10×PCR reaction buffer, 1 μl의 10 mM dNTP mix, 1.5 μl의 50 mM MgCl2, 1 μl의 sense와 antisense primer (10 pmol/μl)와 0.5 μl의 Taq DNA polymerase (5 U/μl, TaKaRa, Japan)를 혼합하였다.
- marcescens 및 Pantoea spp. 등의 균주를 대상으로 폴리스틸렌에 대한 생물막 형성능을 조사하고, Congo-red 및 calcofluor 염색법을 시행하여 균집락의 형상(morphotype)을 조사하여 생물막의 세포외 바탕질 성분으로 curli 및 셀룰로오스의 생성 유무를 확인하고 균 집락의 morphotype에 따른 생물막 형성능을 비교하였다. 또한 세포외 바탕질의 주요 구성 성분인 curli 생성 오페론인 csgBA(C) 유전자의 유무 확인과 새로운 csgA 유전자의 염기서열을 규명하였다.
- 본 연구에서는 병원 감염의 주요 원인균으로 생물막 관련 감염증에서 흔히 분리되고 있는 Citrobacter, Enterobacter 및 Serratia 등의 임상분리 장내세균 22주를 대상으로 생물막 형성능을 조사하고, 생물막의 세포외 바탕질의 구성 성분을 알아보기 위하여 Congo-red 한천배지상의 집락 형상과 calcofluor 염색을 시행하였다. 또한 curli 생성 오페론인 csgBA(C) 유전자의 유무 확인과 csgA 유전자의 염기서열을 규명하였다. 37℃에서 24시간 배양 후 생물막 형성능 분석에서는 2주의 S.
- 등의 균주를 대상으로 폴리스틸렌에 대한 생물막 형성능을 조사하고, Congo-red 및 calcofluor 염색법을 시행하여 균집락의 형상(morphotype)을 조사하여 생물막의 세포외 바탕질 성분으로 curli 및 셀룰로오스의 생성 유무를 확인하고 균 집락의 morphotype에 따른 생물막 형성능을 비교하였다. 또한 세포외 바탕질의 주요 구성 성분인 curli 생성 오페론인 csgBA(C) 유전자의 유무 확인과 새로운 csgA 유전자의 염기서열을 규명하였다.
- 형성된 생물막의 정량적 측정을 위하여 200 μl의 95% 에탄올로 5분간 용해시키고 microplate reader (Molecular Devices, USA) 분석기기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 대구, 대전 및 천안에 위치한 대학병원에 입원한 환자의 임상 검체에서 유래된 Citrobacter, Enterobacter 및 Serratia균속 22주를 사용하였다. 생화학적 동정검사인 API20E kit (bioMerieux, France)를 이용하여 Citrobacter freundii 6주, Enterobacter cloacae 5주, Enterobacter aerogenes 3주, Serratia marcescens 7주 및 Pantoea spp.
- 생물막 형성능 분석 실험의 음성 대조균주로 E. coli strain DH5α를 사용하였다.
이론/모형
- Polystyrene에 대한 생물막 형성능 분석은 Heilmann 등(11)에 의해 기술된 방법을 이용하여 다음과 같이 시행하였다. 배양된 균액을 600 nm에서 흡광도 값 1.
- gov/BLAST)을 이용하여 csgBA(C) 오페론에 삽입되어 있는 csgA 유전자 염기서열과 일치하는지를 확인하였다. csgA유전자의 아미노산 염기서열 번역은 ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy.ch/)에 있는 아미노산 번역 프로그램을 이용하였고, 장내세균 종에 따른 csgA유전자간의 상동성 조사는 ClustalW alignment 프로그램(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)을 이용하였다.
- marcescens 및 Pantoea spp. 등의 임상검체 분리균주를 대상으로 배양된 균의 표면형태를 관찰하고 생물막 형성을 이루는 세포외 바탕질의 주요 구성성분인 curli와 셀룰로오스의 생성 유무를 확인하기 위해서 Congo-red 및 calcofluor 염색법을 실시하였다(Fig. 2). Congo-red 염색결과에 따라, 적색의 rough 표면을 갖는 집락(rdar: red, dry, and rough), 갈색 또는 핑크색의 smooth 표면을 갖는 집락 (bas/pas: brown and smooth/pink and smooth), 갈색의 rough 표면을 갖는 집락(bdar: brown, dry, and rough), 갈색의 smooth 표면을 갖는 집락(bas: brown and smooth), 핑크색의 smooth 표면을 갖는 집락(pas: pink and smooth) 및 smooth 표면을 갖는 흰색 집락(saw: smoothand white) 등으로 분류하였다(Table 1).
성능/효과
- marcescens 5주 및 Pantoea spp. 1주, 그리고 saw형은 C. freundii 3주, E. cloacae 1주, E. aerogenes 1주 및 S. marcescens 2주에서 확인되었다. 37°C에서 24시간 배양 조건하에서는 rdar형은 C.
- 상기의 균주들을 대상으로 curli 생성에 중요한 구조 단백질인 csgA 유전자의 보유 유무를 확인하기 위해서 csgA유전자의 보유 유무를 조사하였다. 22주 가운데 5주(C. freundii1주, E. cloacae 4주)에서 csgBA(C) operon 유전자가 확인되었으며, E. aerogenes과 S. marcescens 균주는 csgA 유전자 음성으로 나타났다(Fig. 3). C.
- 28°C에서 48시간 배양 후 생물막 형성능을 분석한 결과, E. coli DH5α 균주와 비교하였을 때 22주 모두 생물막 형성능이 있는 것으로 확인되었다(Table 1).
- 37°C에서 24시간 배양 후 생물막 형성능을 분석한 결과는 음성 대조균주로 사용한 E. coli DH5 α 균주와 비교하였을 때 S. marcescens 191번과 165번은 생물막 형성능이 아주 낮거나 없는 것으로, 그리고 나머지 20주는 모두 생물막 형성능이 있는 것으로 확인되었다.
- 37°C에서 24시간 배양 후 생물막 형성능을 분석한 결과와 마찬가지로 E. cloacae 41번과 S. marcescens 154번은 흡광도 값이 각 각 1.76과 1.37로 가장 높은 생물막 형성능을 나타내었다.
- 또한 curli 생성 오페론인 csgBA(C) 유전자의 유무 확인과 csgA 유전자의 염기서열을 규명하였다. 37℃에서 24시간 배양 후 생물막 형성능 분석에서는 2주의 S. marcescens를 제외한 나머지 20주는 모두 생물막 형성능이 있는 것으로, 28℃에서 48시간 배양 후 분석에서는 22주 모두 생물막 형성능이 있는 것으로 확인되었다. Congo-red 한천 배지에서의 균집락 형상을 조사한 결과 균속에 따라서 균 집락의 표현형상이 다르게 나타났으며, 동일 균속내에서도 균집락의 표현형상과 색 농도의 차이가 관찰되어 세포외 바탕질의 주요 성분 및 생성량의 차이가 있음을 시사하였다.
- 37℃에서 배양한 Congo-red 염색에서 curli의 생성이 추정(rdar, bdar, bas형)되는 12주 중 curli 생성 유전자(csgA)가 확인된 균주는 5주(C. freundii 1주, E. cloacae 4주)였다. E.
- 3). C. freundii와 E. cloacae에서 확인된 csgA 유전자의 염기서열과 아미노산서열을 분석한 결과, 각 각 150개와 152개의 아미노산으로 이루어져 있는 것으로 확인되었다. BLAST 분석에서 C.
- Congo-red 염색법과 동시에 셀룰로오스 또는 다당류에 결합하는 것으로 알려진 calcofluor를 이용한 염색법을 시행한 결과, 배양 온도 28°C에서 Congo-red 염색에서는 셀룰로오스의 생성을 시사하는 pdar, rdar 및 pas 형이 15주에서 나타났으나, 이 중 calcofluor 염색에서 양성을 나타낸 균주는 11주였다.
- marcescens를 제외한 나머지 20주는 모두 생물막 형성능이 있는 것으로, 28℃에서 48시간 배양 후 분석에서는 22주 모두 생물막 형성능이 있는 것으로 확인되었다. Congo-red 한천 배지에서의 균집락 형상을 조사한 결과 균속에 따라서 균 집락의 표현형상이 다르게 나타났으며, 동일 균속내에서도 균집락의 표현형상과 색 농도의 차이가 관찰되어 세포외 바탕질의 주요 성분 및 생성량의 차이가 있음을 시사하였다. 1주의 C.
- freundii Fec4 csgA (accession number AJ515701) 유전자의 염기서열과 일치하였다. E. cloacae의 csgA (EF490314) 유전자는 E. coli csgA와 80.9%, E. sakazakii csgA와 75.7%, 그리고 C. freundii csgA와 67.8%의 상동성이 있는 새로운 염기서열의 csgA 유전자임이 확인되어 EMBL에 등록(accession number EF490314)하였다.
- 8%의 상동성이 있는 것으로 나타났다. E. cloacae의 경우 Congo-red 염색의 결과와 curli 유전자 검색 결과가 일치하였을 뿐만 아니라, csgA 유전자를 보유하지 않은 균주의 생물막 형성능이 csgA 유전자를 보유한 균주에 비해 현저하게 낮은 것으로 나타나, curli가 E. cloacae의 생물막 세포외 바탕질 구성성분의 주요 요소일 것으로 추정되었다.
- cloacae 4주)였다. E. cloacae의 경우, csgA 유전자를 보유한 4주 모두 bas 또는 bas/pas로, csgA 유전자를 보유하지 않은 1주는 pas 형으로 나타나 Congo-red 균집락 표현형상이 curli 생성을 잘 반영하는 것으로 나타났다. 그러나 C.
- cloacae의 경우, csgA 유전자를 보유한 4주 모두 bas 또는 bas/pas로, csgA 유전자를 보유하지 않은 1주는 pas 형으로 나타나 Congo-red 균집락 표현형상이 curli 생성을 잘 반영하는 것으로 나타났다. 그러나 C. freundii의 경우 6주 중 5주가 bdar (4주) 또는 rdar (1주)로 확인되었음에도 불구하고 csgA가 rdar형 1주에서만 확인되었고, E. aerogenes와 S. marcescens는 csgA 유전자가 확인되지 않았으나 각각 2주와 1주에서 bas형으로 나타나 이들 균종에서는 congo-red 염색법에 의한 curli 생성 판단과 curli 생성 유전자 검출의 결과가 일치하지 않았다. 이러한 결과는 장내세균에 속하는 모든 균종들이 csgA 유전자를 보유하지는 않을 뿐만 아니라 같은 균종이라 할지라도 csgA 유전자 보유 유무가 다르다는 사실을 보여준다.
- marcescens 및 Pantoea spp. 등의 Congo-red 한천 배지에서의 균집락 형상을 조사한 결과 rdar, pdar, bdar 및 saw 이외에도 pas (pink and smooth) 및 bas (brown and smooth) 등의 다양한 형태로 나타났으며, 균속에 따라서 균 집락의 표현형상이 다르게 나타났으며, 동일 균속내에서도 균 집락의 표현형상과 색 농도의 차이가 관찰되어 세포외 바탕질의 주요 성분 및 생성량의 차이가 있음을 시사하였다. 또한 일부 균주의 경우 배양 온도에 따라 균집락의 표현형상이 다르게 나타났는데, 이는 curli 및 셀룰로오스의 생성량이 온도 변화에 의해 조절될 수 있음을 시사한다.
- 배양 온도 37°C에서는 10주에서 Congo-red 염색시 rdar 및 pas 형의 집락을 나타내었고, 이 중 8주에서 calcofluor 염색 양성을 나타내었다. 따라서 Congo-red 염색법과 calcofluor 염색의 결과가 일치하지 않는 균주는 28℃ 배양시 22주 중 4주, 그리고 37℃ 배양시 22주 중 3주인 것으로 나타났다. 또한 Congo-red 염색법과 calcofluor 염색 모두에서 셀룰로오스를 생성하는 것으로 추정된 균주는 37℃ 배양에서는 8주였으나 28℃ 배양에서는 11주로 나타났다.
- 또한 calcofluor 염색법을 실시한 결과 28°C에서 48시간 또는 37°C에서 24시간 배양한 균주의 셀룰로오스 생성으로 인해 형광을 띠는 양성의 균주를 확인할 수 있었다(Table 1).
- cloacae의 경우 Congo-red 한천배지상의 균집락 표현형상이 curli의 존재 및 생성 정도를 대략적으로 나타낼 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다. 뿐만 아니라, E. cloacae의 경우 csgA유전자를 보유하지 않은 균주 (E. cloacae 24)의 생물막 형성능이 csgA유전자를 보유한 4주에 비해 현저하게 낮은 것으로 나타나, curli가 E. cloacae의 생물막 세포외 바탕질 구성성분의 주요 요소일 것으로 추정된다.
- 생물막 형성능이 가장 높았던 E. cloacae 41 균주와 S. marcescens 154 균주는 bas/pas의 표면형태와 calcofluor양성으로 나타나 curli 및 셀룰로오스를 모두 생성하는 것으로 추정되었고, 28℃에서 48시간 배양시 saw의 표면형태를 나타낸 7주의 균주 중 2주(C. freundii 9와 C. freundii 4)를 제외한 5주 모두 낮은 정도의 생물막 형성능을 나타내었다. 이러한 결과들은 장내세균에서 curli와 셀룰로오스의 생성이 생물막 형성능과 밀접한 관련이 있음을 시사한다.
- cloacae에서 csgBA(C) 유전자 양성을 나타내었다. 염기서열 분석결과, E. cloacae의 csgA는 E. coli의 csgA와 80.9%, E. sakazakii의 csgA와 75.7%, 그리고 C. freundii의 csgA와 67.8%의 상동성이 있는 것으로 나타났다. E.
- marcescens는 csgA 유전자가 확인되지 않았으나 각각 2주와 1주에서 bas형으로 나타나 이들 균종에서는 congo-red 염색법에 의한 curli 생성 판단과 curli 생성 유전자 검출의 결과가 일치하지 않았다. 이러한 결과는 장내세균에 속하는 모든 균종들이 csgA 유전자를 보유하지는 않을 뿐만 아니라 같은 균종이라 할지라도 csgA 유전자 보유 유무가 다르다는 사실을 보여준다. 이들 균주의 경우 본 연구에서 csgA 유전자를 검출하기 위해 사용된 PCR primer로는 검출되지 않는 다른 종류의 curli 유전자를 보유하여 curli를 생성할 가능성도 있으므로 추후 확인이 필요하다.
- 또한 Congo-red 염색법과 calcofluor 염색 모두에서 셀룰로오스를 생성하는 것으로 추정된 균주는 37℃ 배양에서는 8주였으나 28℃ 배양에서는 11주로 나타났다. 한편, 배양온도 28℃에서는 curli 생성을 시사하는 Congo-red 균집락 bdar, rdar 및 bas형이 22주 중 4주에 불과하였으나, 배양 온도 37℃에서는 22주 중 12주에서 bdar, rdar 또는 bas형이 확인되었다. 따라서 셀룰로오스의 생성은 28℃에서 48시간 배양시 더욱 증가하는 것으로, 그리고 curli 생성은 37℃에서 24시간 배양시 더욱 증가하는 것으로 추정되었으나, 추후 좀 더 다양한 방법으로 확인이 필요한 것으로 사료된다.
후속연구
- 이들 균주의 경우 본 연구에서 csgA 유전자를 검출하기 위해 사용된 PCR primer로는 검출되지 않는 다른 종류의 curli 유전자를 보유하여 curli를 생성할 가능성도 있으므로 추후 확인이 필요하다. 결론적으로 현재까지 curli 생성 유전자(csgA)가 확인된 대장균과 살모넬라 및 본 연구에서 확인된 E. cloacae의 경우 Congo-red 한천배지상의 균집락 표현형상이 curli의 존재 및 생성 정도를 대략적으로 나타낼 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다. 뿐만 아니라, E.
- 한편, 배양온도 28℃에서는 curli 생성을 시사하는 Congo-red 균집락 bdar, rdar 및 bas형이 22주 중 4주에 불과하였으나, 배양 온도 37℃에서는 22주 중 12주에서 bdar, rdar 또는 bas형이 확인되었다. 따라서 셀룰로오스의 생성은 28℃에서 48시간 배양시 더욱 증가하는 것으로, 그리고 curli 생성은 37℃에서 24시간 배양시 더욱 증가하는 것으로 추정되었으나, 추후 좀 더 다양한 방법으로 확인이 필요한 것으로 사료된다. 이전의 보고에서 임상검체 대장균과 살모넬라 분리균주는 curli와 셀룰로오스 생성량이 37℃보다 28℃에서 훨씬 더 증가되어 rdar 표현형을 보였으며, 이는 전사조절 인자인 csgD 발현의 증가로 인한 것으로 확인된 바 있다(8, 17, 22).
- 이러한 결과는 장내세균에 속하는 모든 균종들이 csgA 유전자를 보유하지는 않을 뿐만 아니라 같은 균종이라 할지라도 csgA 유전자 보유 유무가 다르다는 사실을 보여준다. 이들 균주의 경우 본 연구에서 csgA 유전자를 검출하기 위해 사용된 PCR primer로는 검출되지 않는 다른 종류의 curli 유전자를 보유하여 curli를 생성할 가능성도 있으므로 추후 확인이 필요하다. 결론적으로 현재까지 curli 생성 유전자(csgA)가 확인된 대장균과 살모넬라 및 본 연구에서 확인된 E.
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