[논문]다이오스민(diosmin)에 의한 병원성 대장균 세포부착 및 생물막 형성 억제

김현정; 김승민

doi:10.9721/kjfst.2018.50.4.414

다이오스민(diosmin)에 의한 병원성 대장균 세포부착 및 생물막 형성 억제
Inhibition of adhesion and biofilm formation in Escherichia coli O157:H7 by diosmin 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.50 no.4, 2018년, pp.414 - 419

김현정 (한국식품연구원 소비안전연구단) , 김승민 (한국방송통신대학교 생활과학과)

초록
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병원성 대장균 O157:H7은 식중독 사고를 일으키는 주된 원인균으로서 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 병원성 대장균 O157:H7을 제어하기 위한 새로운 방법이 개발되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 식물화학물질을 스크리닝하여 병원성 대장균 O157:H7의 부착에 주된 역할을 하는 LEE 오페론의 발현을 감소시키는 물질을 찾고자 하였다. 스크리닝을 통해 선발된 식물화학물질 중 다이오스민은 사람 결장 상피세포 부착능을 3.62배 감소시킴으로써(p<0.01) 양성대조군으로 사용된 미리세틴과 유사한 정도의 효과를 나타냈다. 생물막 형성에 있어서는 다이오스민 처리 시 표현형이 25.6% 감소하여 유의적 차이가 확인되었고(p<0.05), curli 유전자의 발현 역시 미리세틴 처리 때보다 1.57-2.60배 더 유의미하게 감소하는 것으로 나타나 양성대조군보다 더 좋은 효과를 보였다. 한편 다이오스민은 병원성 대장균 O157:H7의 생장에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 내성 발생률이 저감화된 새로운 항미생물제재로서 사용 가능하리라 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Escherichia coli O157:H7 is one of the most common foodborne pathogens responsible for outbreaks of hemorrhagic colitis, which can lead to the life-threatening hemolytic-uremic syndrome. In this study, we identified phytochemicals that specifically inhibit the expression of LEE operon in E. coli O157:H7. Among phytochemicals, diosmin decreased the adherence of E. coli O157:H7 towards Caco-2 cells in vitro (p<0.01) and its biofilm formation activity (p<0.05). Quantitative RT-PCR analysis revealed that the transcripts of Ler-regulated genes and genes related to curli production were significantly reduced in the presence of diosmin. However, diosmin does not affect bacterial viability, indicating that the resistance rate to diosmin was remarkably low. Overall, these results provide significant insights into the development of a novel anti-infective agent that is different from conventional antibiotics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

KS02를 이용한 high-throughput screen을 통해 선정된 식물화학물질들이 실제 병원성 대장균 O157:H7에서도 효과를 나타내는지 확인해 보고자 사람 결장 상피세포에 대한 부착 억제 활성을 평가했다. Caco-2 세포에 DMSO, 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴, 노밀린을 각각 처리한 병원성 대장균 O157:H7을 MOI 10으로 감염시켜 2시간 후 Caco-2 세포에 부착된 박테리아수를 세어 비교하였다.
병원성 대장균 O157:H7은 식중독 사고를 일으키는 주된 원인 균으로서 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 병원성 대장균 O157:H7을 제어하기 위한 새로운 방법이 개발되어야 한다. 따라 서 본 연구에서는 식물화학물질을 스크리닝하여 병원성 대장균 O157:H7의 부착에 주된 역할을 하는 LEE 오페론의 발현을 감소 시키는 물질을 찾고자 하였다. 스크리닝을 통해 선발된 식물화학 물질 중 다이오스민은 사람 결장 상피세포 부착능을 3.
따라서 본 연구에서는 Ler에 의해 전사가 조절되는 LEE 오페론을 타깃으로 삼아 병원성 대장균 O157:H7의 생장은 억제하지 않으면서 LEE 오페론 발현을 감소시키는 식물화학물질을 스크리닝하여 장 상피세포 부착과 생물막 형성을 억제할 수 있는 천연물을 탐색함으로써 새로운 병원성 대장균 O157:H7 제어제로서의 가능성을 타진하고자 하였다.
사람 결장 상피세포에 대한 부착 억제능을 보였던 식물화학물질들이 생물막 형성 억제능 역시 보이는지 확인하였다. 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴 처리 시, 병원성 대장균 O157:H7의 생물막 형성 정도가 DMSO 처리 때에 비하여 각각 18.

제안 방법

KS02를 이용한 high-throughput screen을 통해 선정된 식물화학물질들이 실제 병원성 대장균 O157:H7에서도 효과를 나타내는지 확인해 보고자 사람 결장 상피세포에 대한 부착 억제 활성을 평가했다. Caco-2 세포에 DMSO, 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴, 노밀린을 각각 처리한 병원성 대장균 O157:H7을 MOI 10으로 감염시켜 2시간 후 Caco-2 세포에 부착된 박테리아수를 세어 비교하였다. 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴 처리 시, 병원성 대장균 O157:H7의 Caco-2 세포 부착 정도가 DMSO 처리 때에 비하여 각각 3.
각 식물화학물질이 병원성 대장균 O157:H7의 생장에 영향을미치는지 알아보기 위해 미리세틴과 다이오스민 유무에 따른 병원성 대장균 O157:H7의 생장능을 측정했다. Fig.
병원성 대장균 O157:H7에 의한 감염을 예방할 수 있는 항부착 물질을 찾기 위하여 식물 유래의 화학물질 32종에 대한 LEE 오페론 발현 저해능을 스크리닝했다. LEE3 promoter가 promoterless luxCDABE 오페론에 결합된 reporter 플라스미드 pKS1304와 아라비노스에 의해 야생형 ler 유전자 발현이 유도되는 pKS1303 플라스미드가 E.
양성대조군으로 사용된 미리세틴과 비교하여 저해 효과가 좋았던 다이오스민에 대해 검증실험을 실행하였다. 병원성 대장균 O157:H7의 LEE 오페론 및 생물막 형성 관련 유전자 발현 정도가 미리세틴과 다이오스민 처리에 의해 어떻게 바뀌는지 알아보고자 qRT-PCR을 이용하였다. LEE 오페론에 속하는 유전자로는 escJ, sepZ, escV, escN, tir, eae, espA, espD의 전사물을 분석했다.
양성대조군으로 사용된 미리세틴과 비교하여 저해 효과가 좋았던 다이오스민에 대해 검증실험을 실행하였다. 병원성 대장균 O157:H7의 LEE 오페론 및 생물막 형성 관련 유전자 발현 정도가 미리세틴과 다이오스민 처리에 의해 어떻게 바뀌는지 알아보고자 qRT-PCR을 이용하였다.
전사물 분석을 위해 병원성 대장균 O157:H7을 식물화학물질이 있는 상태, 없는 상태에서 각각 8시간 동안 배양한 후, RNeasy minikit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 병원성 대장균 O157:H7으로부터 전체 RNA를 순수분리했다. 정량적 real-time PCR (qRT-PCR)을 위해 maxima first strand cDNA synthesis kit(Thermo Fisher Scientific)로 cDNA가 합성되었고, PikoReal 24 RT-PCR (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 cDNA가 증폭되었으며, PikoReal software 2.

대상 데이터

LEE3 promoter가 promoterless luxCDABE 오페론에 결합된 reporter 플라스미드 pKS1304와 아라비노스에 의해 야생형 ler 유전자 발현이 유도되는 pKS1303 플라스미드가 E. coli DH5에 함께 형질전환된 KS02 균주를 스크리닝에 사용했다. 따라서 식물화학물질 처리 시 KS02 발광 정도가 감소하면 그 물질은 Ler 억제제로 간주했다.
) 배지에서 정치배양하였다. 식물화학물질은 fla-vones, flavanones, flavonols, isoflavones, flavanonols, catechins계열이 포함된 총 32종류가 사용되었으며 Extrasynthese (Genay, France)에서 구매하여 다이메틸설폭사이드(DMSO, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 녹여서 20 mM 농도의 용액을 만들어 희석한 후 사용하였다.

데이터처리

모든 실험 단계는 3반복 실시하였으며 결과의 통계분석은 GraphPad software version 5.02 (Graphpad Software, La Jolla, CA, USA) 프로그램을 통하여 일원배치 분산분석(ANOVA) 방법을 이용하여 p<0.05 유의 수준에서 통계분석하였다.

이론/모형

Kim과 Kim의 논문(2017)에서 사용된 reporter strain KS02가 병원성 대장균 O157:H7 억제제를 찾기위한 스크리닝 시스템에 사용되었다. KS02를 하룻밤 배양한 후 적절한 항생제(앰피실린과 클로람페니콜)가 포함된 새로운 LB 배지에 100분의 1로 희석해 접종했다.
시간에 따른, 식물화학물질 존재에 따른 tufA 항존유전자의 발현에는 차이가 없었다. 모든 샘플은 세 번 반복 실험하였고 Livac과 Schmittgen(2001)이 보고한 바에 따라 2^−ΔΔCq 방법으로 분석되었다.
병원성 대장균 O157:H7에 대한 식물화학물질의 생물막 형성 억제 효과는 Kim 등(2013)의 방법으로 확인하였다. 병원성 대장균 O157:H7은 BHI 배지에서 16시간 배양 후 1/100 희석하여 준비하였다.

성능/효과

이 때 제 3형 분비 시스템에 포함되는 eae 유전자의 발현을 유의미하게 억제시켰다고 보고된 브로콜리 성분의 미리세틴(myricetin)은 양성대조군으로 사용되었고(Lee 등, 2011), LEE 오페론 발현에 큰 영향을 미치지 않았다는 Vikram 등(2010)의 연구결과에 따라 자몽 성분인 노밀린(nomilin)은 음성대조군으로 사용되었다. 100 μM의 농도에서 50% 이상의 발광 억제 효과를 나타낸 물질은 아카세틴(acacetin), 다이오스민, 아이소람네틴(isorhamnetin) 세 종으로 각각 57.3, 64.7, 50.2%의 억제 효과를 나타내어, LEE 오페론 발현양을 두 배 이상(p<0.05) 감소시킴을 확인했다(Fig. 1).
병원성 대장균 O157:H7의 생물막 형성에 있어서는 curli fimbriae 생성이 중요한 역할을 한다고 알려져 있으므로(Arita-Morioka 등, 2018), 생물막 형성에 관련하여서는 curli 유전자인 csgABDFG의 발현 변화를 보았다. DMSO 처리 때에 비해 미리세틴과 다이오스민 처리 시 LEE 오페론에 속하는 유전자와 curli 유전자의 발현은 현저하게 줄어들었다(Fig. 3).
Caco-2 세포에 DMSO, 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴, 노밀린을 각각 처리한 병원성 대장균 O157:H7을 MOI 10으로 감염시켜 2시간 후 Caco-2 세포에 부착된 박테리아수를 세어 비교하였다. 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴 처리 시, 병원성 대장균 O157:H7의 Caco-2 세포 부착 정도가 DMSO 처리 때에 비하여 각각 3.63, 2.23, 3.62, 2.34배 감소하여, 다이오스민은 미리세틴과 유사한 수준의 세포 부착 억제능을 나타냈다(Fig. 2A).
사람 결장 상피세포에 대한 부착 억제능을 보였던 식물화학물질들이 생물막 형성 억제능 역시 보이는지 확인하였다. 미리세틴, 아카세틴, 다이오스민, 아이소람네틴 처리 시, 병원성 대장균 O157:H7의 생물막 형성 정도가 DMSO 처리 때에 비하여 각각 18.1, 17.0, 25.6, 17.3% 감소하여 유의적 차이가 확인되었다(Fig.2B). 이 중 다이오스민은 이미 보고된 미리세틴보다 뛰어난 활성을 보여 새로운 생물막 형성 억제제로서의 가능성을 보였다.
01) 양성대조군으로 사용된 미리세틴과 유사한 정 도의 효과를 나타냈다. 생물막 형성에 있어서는 다이오스민 처리 시 표현형이 25.6% 감소하여 유의적 차이가 확인되었고(p<0.05), curli 유전자의 발현 역시 미리세틴 처리 때보다 1.57-2.60배 더 유의미하게 감소하는 것으로 나타나 양성대조군보다 더 좋은 효 과를 보였다. 한편 다이오스민은 병원성 대장균 O157:H7의 생장 에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 내성 발생률이 저감화된 새로운 항미생물제재로서 사용 가능하리라 판단된다.
따라 서 본 연구에서는 식물화학물질을 스크리닝하여 병원성 대장균 O157:H7의 부착에 주된 역할을 하는 LEE 오페론의 발현을 감소 시키는 물질을 찾고자 하였다. 스크리닝을 통해 선발된 식물화학 물질 중 다이오스민은 사람 결장 상피세포 부착능을 3.62배 감소 시킴으로써(p<0.01) 양성대조군으로 사용된 미리세틴과 유사한 정 도의 효과를 나타냈다. 생물막 형성에 있어서는 다이오스민 처리 시 표현형이 25.
2B). 이 중 다이오스민은 이미 보고된 미리세틴보다 뛰어난 활성을 보여 새로운 생물막 형성 억제제로서의 가능성을 보였다. 따라서 본 연구를 통해 효과가 검증된 flavone 유도체 다이오스민은 선행연구들에서 보고된 바와 같이 인간에게 안전할 뿐만 아니라 생물막 형성 저해 효과도 새로이 증명되었으므로 식중독 예방 및 제어에 이용될 수 있으리라 판단된다.

후속연구

이 중 다이오스민은 이미 보고된 미리세틴보다 뛰어난 활성을 보여 새로운 생물막 형성 억제제로서의 가능성을 보였다. 따라서 본 연구를 통해 효과가 검증된 flavone 유도체 다이오스민은 선행연구들에서 보고된 바와 같이 인간에게 안전할 뿐만 아니라 생물막 형성 저해 효과도 새로이 증명되었으므로 식중독 예방 및 제어에 이용될 수 있으리라 판단된다.
4에서와 같이 실험조건에서 병원성 대장균 O157:H7의 생장에 아무런 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에 활용된 식물 화학물질 중 특히 효과가 좋았던 다이오스민은 내성 발생률이 저감화된 새로운 항미생물제재로서 사용 가능하리라 판단된다.
병원성 대장균 O157:H7은 식중독 사고를 일으키는 주된 원인 균으로서 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 병원성 대장균 O157:H7을 제어하기 위한 새로운 방법이 개발되어야 한다. 따라 서 본 연구에서는 식물화학물질을 스크리닝하여 병원성 대장균 O157:H7의 부착에 주된 역할을 하는 LEE 오페론의 발현을 감소 시키는 물질을 찾고자 하였다.
60배 더 유의미하게 감소하는 것으로 나타나 양성대조군보다 더 좋은 효 과를 보였다. 한편 다이오스민은 병원성 대장균 O157:H7의 생장 에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 내성 발생률이 저감화된 새로운 항미생물제재로서 사용 가능하리라 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	EspA란?	병원성 대장균 O157:H7의 LEE 오페론에 암호화되어 있는 EspA는 장 상피세포 부착을 도와 생물막을 형성하는 데에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다(Moreira 등, 2006; Sharma 등, 2016). 병원성 대장균은 장 상피세포 뿐만 아니라 식물체, 유리, 스테인리스강 등 다양한 표면에 생물막을 형성한다(Patel 등, 2011; Ryu와 Beuchat, 2005).
	새로운 항미생물제재를 개발해야 하는 이유는?	의료계뿐만 아니라 식품 산업계에서도 항생제 내성 문제는 심각한 문제로 대두되고 있어 새로운 항미생물제재를 시급히 개발해야 하는 시점에 놓여 있다(Clatworthy 등, 2007). 항생제 내성을 가지는 균주들의 출현을 극복하기 위해서는 기존의 미생물 세포벽 생합성, 단백질 합성, DNA 복제와 복구 등의 억제를 통해 생장을 억제시키는 전통적인 방법에서 벗어나 새로운 타깃이 지속적으로 발굴되어야 한다.
	생물막 제거를 위해 화학적 방법을 사용할 경우 문제점은?	일반적으로는 경제적인 측면과 사용 편리성 등을 고려하여 식품첨가물, 살균제와 살균소독제를 이용하는 화학적 방법이 가장 많이 사용되고 있다(Kim 등, 2009). 하지만 화학적 제어 방법은 미생물의 저항성과 돌연변이 혹은 유전자 전이에 의한 내성화 등의 문제점을 가져올 수 있고 소비자에 있어서는 장기 손상, 면역 과민 반응 등 부작용이 발생될 우려가 있어 식물화학물질과 같은 자연 항균물질에 대한 요구도가 높아지고 있다(Srey 등, 2013).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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