[논문]Lactobacillus brevis DK25의 박테리오신과 안식향산칼륨과의 혼용에 의한 Hurdle Technology 적용 가능성

임성미

Lactobacillus brevis DK25의 박테리오신과 안식향산칼륨과의 혼용에 의한 Hurdle Technology 적용 가능성
Application Potential of Hurdle Technology by Combination of Bacteriocin Produced by Lactobacillus brevis DK25 and Potassium Benzoate 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.47 no.4, 2011년, pp.364 - 374

초록
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동치미에서 분리된 Lactobacillus brevis DK25 균주는 생화학적 특성, 당 분해능 및 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 동정하였다. L. brevis DK25가 생산한 박테리오신의 항균활성은 Enterococcus faecalis와 Listeria monocytogenes에 대해서만 나타나 항균 스펙트럼은 비교적 좁은 것으로 확인되었다. 배양과정 동안 L. brevis DK25의 박테리오신은 정지기 초기에 최대의 활성(1,280 AU/ml)을 나타내었으나, 그 이후에는 급격하게 감소되었으므로 박테리오신은 생산균이 증식하는 과정 동안 생성됨을 알 수 있었다. 박테리오신의 활성은 protease 처리에 의해 완전히 소실되었으나 pH 4-9의 범위에서는 활성에 변함이 없었고, $100^{\circ}C$에서 30분간 가열처리에도 활성을 유지하였으므로 열에 비교적 안정하였다. 박테리오신의 L. monocytogenes KCTC 3569에 대한 항균활성은 농도의존적으로 나타났고 특히, $4^{\circ}C$와 $25^{\circ}C$에 저장하는 동안 마요네즈 내에 존재하는 L. monocytogenes KCTC 3569의 증식을 억제하기 위해선 박테리오신과 안식향산칼륨 용액을 단독으로 처리하는 것보다는 이들을 혼합하여 처리했을 때 유의적으로 더 높은 항균 효과를 얻을 수 있었다. 따라서 L. brevis DK25가 생산한 박테리오신은 안식향산칼륨과 함께 식품의 제조 공정 중 식중독균 제어를 위해서 hurdle technology에 적용될 수 있다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Lactobacillus brevis DK25 isolated from Dongchimi was identified by physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis. Bacteriocin of L. brevis DK25 exhibits inhibitory activity against Enterococcus faecalis and Listeria monocytogenes when using agar well diffusion method. Maximal production of bacteriocin was reached in the beginning of the stationary phase, and inhibitory activity declined after the late stationary phase. This result suggested that bacteriocin was produced in a growth-associated manner. Complete inactivation of bacteriocin activity was observed after treatment with protease, but the activity was stable between pH 4-9 and heat resistant (30 min at $100^{\circ}C$). Bacteriocin showed a concentration-dependent antimicrobial activity against L. monocytogenes KCTC 3569. Moreover, the application experiment showed that combination of bacteriocin (320 AU/ml) with potassium benzoate (0.05%) could significantly reduce the counts of L. monocytogenes KCTC 3569 in mayonnaise during storage at 4 or $25^{\circ}C$ for 10 days. Thus, bacteriocin from L. brevis DK25 may be used for hurdle technology by combination with potassium benzoate in order to increase pathogenic bacteria inactivation in food processing and food safety control.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 숙성된 동치미로부터 분리된 Lactobacillus brevis DK25가 생산하는 박테리오신의 항균 스펙트럼과 물리화학적 안정성을 조사하고, 또한 박테리오신과 화학 합성품인 안식향산칼륨과의 혼합 처리가 L. monocytogenes KCTC 3569의 증식에 미치는 영향을 살펴보고자 한다.

가설 설정

3) ND; Not detected.

제안 방법

L. monocytogenes KCTC 3569와 L. brevis DK25를 BHI broth에 접종하여 37℃에서 30시간 동안 혼합 배양하는 과정 중 L. monocytogenes의 균수 변화를 관찰하였고, 아울러 L. brevis DK25의 배양 상등액(50과 100 μl/ml)과 박테리오신 용액(320과 640 AU/ml), 안식향산칼륨 용액(0.05와 0.1%)의 단독 및 이들의 혼합 처리에 의한 L. monocytogenes KCTC 3569의 항균효과를 살펴본 결과는 Table 3과 같다.
PBS에 현탁된 세포들의 균수를 각각 1.0×105 CFU/ml로 조정한 다음 BHI broth에 접종하여 37℃에서 배양하는 동안 Oxford agar (Difco Co.)를 사용하여 표준한천평판배양법으로 L. monocytogenes KCTC 3569생균수를 측정함으로써 실험 균주와의 혼합배양에 의한 식중독균의 균수 변화를 조사하였다.
게다가 API 50 CHL kit (bioMérieux, France)를 이용하여 당 분해능을 조사하였다.
동치미에서 분리된 Lactobacillus brevis DK25 균주는 생화학적 특성, 당 분해능 및 16S rDNA 염기서 열 분석을 통해 동정하였다. L.
0으로 되돌린 후 박테리오신의 활성 변화를 조사하였다. 또한 효소(Sigma-Aldrich)의 영향을 알아보기 위해 amylase는 50 mM sodium acetate (pH 6.0), trypsin은 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), pepsin는 10 mM citrate (pH 2.0), protease는 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 lipase는 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 용해한 효소액(1 mg/ml)을 조제한 후 박테리오신 용액과 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 80℃에서 10분간 가열 처리하여 효소를 불활성화 시켜 잔존하는 박테리오신의 활성을 측정하였다.
박테리오신 활성은 Parente 등(31)의 방법에 따라 agar well diffusion method를 일부 수정하여 측정하였다. 즉, B.
, USA) 평판배지 상에서 배양(37℃, 48시간)하여 집락 주위에 투명한 환을 생성한 DK25 균주를 분리하여 사용하였다. 분리된 균주를 MRS broth에서 배양(37℃, 24시간)하여 얻은 배양액을 20% glycerol 과 1:1의 비율로 혼합하여 -80℃에서 보관하는 동안 실험에 사용하기 직전 MRS agar 사면배지에서 3회 계대 배양하여 사용하였다. 항균스펙트럼 측정에 사용된 Bacillus subtilis ACTCC 35421, L.
샐러드드레싱(마요네즈)에 실험 균주가 생산한 박테리오신과 안식향산칼륨 용액을 첨가하여 저장하는 동안 L. monocytogenes KCTC 3569의 균수 변화를 관찰하였다. 우선 얼음이 담긴 용기 내에 볼(bowl)을 넣고 계란 노른자에 머스타드를 혼합한 후 식용유를 소량씩 첨가하여 한쪽 방향으로 계속해서 저어주면서 마요네즈를 제조하였다.
세척된 gel은 L. monocytogenes KCTC 3569 (1.0×105 CFU/ml)가 접종된 BHI 평판배지 위에 올려 놓고 37℃에서 24시간 배양하여 항균 활성을 확인하였다.
실험 균주가 생산한 박테리오신의 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 박테리오신 용액을 100℃에서 30분 및 121℃에서 15분간 각각 가열 처리한 후 대조구와의 활성과 비교하였다. 한편, pH에 대한 안정성을 살펴보기 위해 박테리오신 용액을 pH 4.
실험 균주를 MRS broth에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하는 동안 정해진 시간에 일정량의 배양액을 채취한 다음 원심분리(7,000×g, 4℃, 20분간)하여 회수한 상등액은 pH meter (Hanna Instruments, Sarmeola di Rubano, PD, Italy)로 pH를 측정하였다.
여기에 L. monocytogenes KCTC 3569 (1.0×105 CFU/ml)를 접종하고 박테리오신 용액 320 AU/ml 및 안식향산칼륨 용액 0.05%를 각각 단독 및 혼합 첨가하여 밀봉한 다음 4℃와 25℃의 온도 대에서 저장하면서 2일 간격으로 시료를 채취하여 Oxford agar (Difco Co.) 배지에서 L. monocytogenes KCTC 3569의 균수를 조사하였다.
(South Korea)사에 의뢰하여 DNA sequcencing하였다. 염기서열은 GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov)의 database와 비교한 후 BLASTN program으로 상동성을 검색하였고, sequence alignment는 CLUSTER W 알고리즘으로 정렬한 후 MEGA 5.05 program으로 Neighbor-joining tree (Bootstrap method, Replication : 1,000)에 의해 계통도를 작성하여 유전적 유사성을 확인하여 동정하였다(19).
monocytogenes KCTC 3569의 균수 변화를 관찰하였다. 우선 얼음이 담긴 용기 내에 볼(bowl)을 넣고 계란 노른자에 머스타드를 혼합한 후 식용유를 소량씩 첨가하여 한쪽 방향으로 계속해서 저어주면서 마요네즈를 제조하였다. 여기에 L.
응고된 평판배지 위에 well (Ø 8 mm)을 뚫어 단계적으로 희석한 박테리오신 용액 50 μl를 well 내에 주입한 후 37℃에서 24시간 배양한 다음 저해환을 생성하는 최대의 희석배수에 20을 곱하여 박테리오신 활성(arbitrary unit, AU/ml)을 측정하였다.
한편, Otero과 Nader-Macias (30)의 방법에 따라 과산화수소 활성을 측정하였는데 즉, 실험 균주를 1 mM 3,3′,5,5′-tetramethyl-benzidine (TMB)와 2 U/ml peroxidase (Sigma-Aldrich)가 첨가된 MRS agar 평판배지에서 37℃, 혐기적인 조건(anoxomat system, MART, Netherlands)으로 48시간 배양한 후 20분 동안 공기 중에 산소와 접촉시킨다음 집락의 색깔 변화를 조사하였다. 이때 청색(+++), 짙은 갈색(++), 옅은 갈색(+) 및 백색(-)으로 구분하여 활성을 측정하였다.
즉, B. subtilis ACTCC 35421, L. monocytogenes KCTC 3569, S. aureus ATCC 6538, E. aerogenes ATCC 13480 및 S. enteritidis ATCC 13076는 BHI broth, E. faecalis KCTC 3206, L. brevis KCTC 3102 및 L. plantarum KCTC 1048는 MRS broth 및 V. vulnificus KCTC 2982는 Marine broth에 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고 난 뒤 각각의 균수를 1.0×105 CFU/ml로 조정한 다음 반고체 배지(agar 0.8%, w/v)에 접종한 후 평판배지 위에 중층하고 일정 시간 방치하여 응고시켰다.
총산도는 Mante 등 (21)의 방법에 따라 배양액 (10 ml)에 증류수를 첨가해서 250 ml로 정용하고 난후 여과(Whatman, No. 2)하여 0.1% 페놀프탈레인 지시약을 첨가한 다음 0.1 N NaOH로 적정해서 총산도를 측정하였다(총산도 = {[0.009×NaOH 소비량(ml)×NaOH 역가×희석배수]/시료의 무게(g)}×100).
한편, Otero과 Nader-Macias (30)의 방법에 따라 과산화수소 활성을 측정하였는데 즉, 실험 균주를 1 mM 3,3′,5,5′-tetramethyl-benzidine (TMB)와 2 U/ml peroxidase (Sigma-Aldrich)가 첨가된 MRS agar 평판배지에서 37℃, 혐기적인 조건(anoxomat system, MART, Netherlands)으로 48시간 배양한 후 20분 동안 공기 중에 산소와 접촉시킨다음 집락의 색깔 변화를 조사하였다.
실험 균주가 생산한 박테리오신의 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 박테리오신 용액을 100℃에서 30분 및 121℃에서 15분간 각각 가열 처리한 후 대조구와의 활성과 비교하였다. 한편, pH에 대한 안정성을 살펴보기 위해 박테리오신 용액을 pH 4.0-10.0의 범위에서 1.0의 간격으로 조정하여 1시간 동안 반응시킨 후 다시 pH 7.0으로 되돌린 후 박테리오신의 활성 변화를 조사하였다. 또한 효소(Sigma-Aldrich)의 영향을 알아보기 위해 amylase는 50 mM sodium acetate (pH 6.
한편, 염기서열 분석을 위해 16S rDNA는 518F (5′-CCAGCAG CCGCGGTAATACG-3′)과 800R (5′-TACCAGGGTATCTA ATCC-3′) primer를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR, Biorad Laboratories Ltd., Canada)로 증폭시켜 얻은 PCR 산물은 QIA quick PCR kit (QIAGEN, Germany)로 정제하고 Macrogen Co. (South Korea)사에 의뢰하여 DNA sequcencing하였다.
한편, 항균물질의 단독 및 혼합에 의한 L. monocytogenes KCTC 3569의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위해 L. monocytogenes를 1.0×105 CFU/ml로 맞춘 후 BHI broth에 접종한 다음 실험 균주의 배양 상등액 50과 100 μl/ml, 박테리오신 용액 320과 640 AU/ml 및 안식향산칼륨 용액 0.05와 0.1% 각각을 단독으로 첨가하고, 또한 배양 상등액 50μl/ml와 안식향산칼륨 용액 0.05% 및 박테리오신 용액 320 AU/ml 혹은 640 AU/ml와 안식향산칼륨 용액 0.05%를 혼합첨가하여 30시간 배양하는 동안 L. monocytogenes KCTC 3569의 균수 변화를 관찰하였다.

대상 데이터

) 배지에서 배양하였다. 게다가 Enterococcus faecalis KCTC 3206, L. brevis KCTC 3102및 L. plantarum KCTC 1048는 MRS agar 상에서 그리고 Vibrio vulnificus KCTC 2982는 Marine agar (Difco Co.) 배지에서 계대 배양하여 실험하였다.
본 실험에 사용된 유산균은 가정에서 담궈 숙성시킨 동치미를 무균적으로 수거하여 0.85% (w/v) NaCl 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후 약 3분간 분쇄한 시료를 1% (w/v) CaCO₃이 첨가된 Lactobacilli MRS (Difco Co., USA) 평판배지 상에서 배양(37℃, 48시간)하여 집락 주위에 투명한 환을 생성한 DK25 균주를 분리하여 사용하였다. 분리된 균주를 MRS broth에서 배양(37℃, 24시간)하여 얻은 배양액을 20% glycerol 과 1:1의 비율로 혼합하여 -80℃에서 보관하는 동안 실험에 사용하기 직전 MRS agar 사면배지에서 3회 계대 배양하여 사용하였다.
한편, 안식향산칼륨(Sigma-Aldrich)은 물에 용해시켜 농도를 맞춘 다음 여과 제균(0.45 μm, Milipore Corp., USA)하여 실험에 사용하였다.
분리된 균주를 MRS broth에서 배양(37℃, 24시간)하여 얻은 배양액을 20% glycerol 과 1:1의 비율로 혼합하여 -80℃에서 보관하는 동안 실험에 사용하기 직전 MRS agar 사면배지에서 3회 계대 배양하여 사용하였다. 항균스펙트럼 측정에 사용된 Bacillus subtilis ACTCC 35421, L. monocytogenes KCTC 3569, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterobacter aerogenes ATCC 13480 및 Salmonella enteritidis ATCC 13076는 Brain Heart Infusion agar (BHI) (Difco Co.) 배지에서 배양하였다. 게다가 Enterococcus faecalis KCTC 3206, L.

데이터처리

Values are mean±standard deviation of triplicate determinations and means with the different letters in the same row are significantly different (p<0.05) as determined by Duncan’s multiple range test.
박테리오신과 안식향산칼륨 처리에 의한 L. monocytogenes KCTC 3569의 균수를 측정하여 얻은 실험값은 SPSS (version 12.0) 프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석법 (one-way ANOVA)의 Duncan’s test로 유의수준 p<0.05에서 측정값들 간의 유의적인 차이를 검증하였다.

이론/모형

Bacteriocin activity was estimated by agar well diffusion method.
DK25 균주가 생산한 박테리오신의 분자량은 Laemmli (20)의 방법에 따라 sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE)를 사용하여 측정하였다. 즉, 박테리오신 용액을 sample buffer와 동량 혼합하여 95℃에서 3분간 가열 처리한 후 protein marker (3.
실험 균주 DK25의 형태학적 및 배양학적 특성은 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (24)에 따라 그람염색, 항산성염색 및 포자염색, 편모, blood agar상에서의 용혈능, amylase, protease, catalase, oxidase, urease, 아미노산 탈탄산 효소 등의 생성능, tryptophan 분해능, 생육 가능한 온도, pH 및 염농도 범위 등을 조사하였다.

성능/효과

L. brevis DK25 균주의 배양액 pH는 시간이 지남에 따라 감소된 반면 총 산도의 양은 비례적으로 증가하여 배양 30시간 만에 1.07±0.08%를 나타내었는데 이는 유기산 생성에 의한 것이다.
brevis DK25 균주의 배양 상등액으로부터 제조한 박테리오신 용액의 항균활성과 항균 스펙트럼을 agar well diffusion method에 따라 측정한 결과는 Table 2와 같다. L. brevis DK25가 생산한 박테리오신의 항균활성은 B. subtilis, S. aureus, E. aerogenes, L. plantarum, L. brevis, S. enteritidis 및 V. vunificus에 대해서는 전혀 나타나지 않은 반면, E. faecalis에 대한 항균 활성은 320 AU/ml로 나타났고, L. monocytogenes KCTC 3569에 대해서는 이 보다 더 높은 항균활성(1,280 AU/ml)을 나타내었다. 따라서 L.
동치미에서 분리된 Lactobacillus brevis DK25 균주는 생화학적 특성, 당 분해능 및 16S rDNA 염기서 열 분석을 통해 동정하였다. L. brevis DK25가 생산한 박테리오신의 항균활성은 Enterococcus faecalis와 Listeria monocytogenes에 대해서만 나타나 항균 스펙트럼은 비교적 좁은 것으로 확인되었다. 배양과정 동안 L.
monocytogenes KCTC 3569의 항균효과를 살펴본 결과는 Table 3과 같다. L. brevis DK25와 혼합 배양할 때 L. monocytogenes KCTC 3569의 초기 균수는 점진적으로 감소하여 24시간 후 초기균수에 비해약 2 log cycle 정도 감소되었는데 이는 배양과정 동안 생성된 유기산과 박테리오신의 영향인 것으로 추정된다. 또한 L.
L. lactis JW3이 생산한 박테리오신은 protease I, protease IX, protease XII, α-chymotrypsin, β-chymotrypsin, trypsin 및 pepsin 등의 단백질 분해효소에 대해선 전혀 영향을 받지 않았으나, protease IV에 의해선 활성이 완전히 파괴되었고 특이하게도 α-amylase에 의해서도 항균 활성이 일부 소실되어 단백질과 일부 당으로 구성된 박테리오신임을 확인하였다.
1과 같다. Neighbor-joining tree에 의해 계통도를 작성하여 유전적 유사성을 확인했을 때 L. brevis ATCC 14687^T와 98.7% 상동성을 나타내었다.
게다가 API kit를 이용한 당 분해능을 조사한 결과, L-arabinose, ribose, D-xylose, β-methyl-xyloside, galactose, D-glucose, D-fructose, mannitol, α-methyl-D-glucoside, N-acetyl glucosamine, maltose 및 melibiose 등의 당을 발효할 수 있었던 반면, 그 외에 D-arabinose, D-mannose, rhamnose, inositol, sorbitol, amygdaline, esculine, cellobiose, saccharose 및 inuline 등의 당은 분해할 수 없었다.
monocytogenes KCTC 3569의 초기 균수는 유도기가 대조구에 비해 다소 연장 되었으나, 그 이후에는 서서히 증가되기 시작하였고, 배양상등액 100 μl/ml 처리한 경우 12시간까지는 초기 균수가 감소된 반면 이후에는 조금씩 증가되었다. 게다가 L. brevis DK25가 생산한 박테리오신 320 AU/ml 처리시에는 배양 18시간 만에 초기 균수가 약 1 log cycle 감소되었고, 640 AU/ml 처리시에는 약 2 log cycle 정도의 감소되었는데 320 AU/ml 첨가했을 때 보다는 균 증식 억제효과가 크게 나타나 박테리오신의 항균 활성은 농도의존적인 것을 확인하였다. 그리고 배양 상등액 50 μl/ml와 안식향산칼륨 용액(0.
그리고 L. brevis DF01의 박테리오신은 α-chymotrypsin, pronase E, proteinase K, trypsin 등에 의해 활성을 잃었으나, pH 2-12의 범위와 121℃에서 15분간의 가열 처리에도 활성은 그대로 유지하였다.
하지만 정지기 이후에는 자가용해효소 작용에 의한 박테리오신의 분해로 인하여 항균활성은 다시 급격하게 저하되었다. 그리고 L. brevis DK25 균주는 과산화수소를 생성하지 않는 것으로 확인되었다(자료 미제시).
그리고 배양 상등액 50 μl/ml와 안식향산칼륨 용액(0.05%)을 혼합 처리한 경우에는 배양 초기에 균수가 뚜렷하게 감소되었고, 박테리오신 320 AU/ml와 안식향산칼륨 용액 0.05%를 혼합 처리한 경우에는 12시간 만에 초기 균수가 약 1 log cycle 감소되었고, 이후에도 균수는 크게 증가하지 않았다.
monocytogenes KCTC 3569의 증식을 억제하기 위해선 박테리오신과 안식향산칼륨 용액을 단독으로 처리 하는 것보다는 이들을 혼합하여 처리했을 때 유의적으로 더높은 항균 효과를 얻을 수 있었다. 따라서 L. brevis DK25가 생산한 박테리오신은 안식향산칼륨과 함께 식품의 제조 공정중 식중독균 제어를 위해서 hurdle technology에 적용될 수 있다고 판단된다.
또한 amylase, pepsin 및 lipase 처리에 대해서는 활성에 영향을 받지 않았으나, trypsin에 의해선 75% 감소되었고 protease 처리에 의해서는 활성이 완전히 소실되었다. 따라서 L. brevis DK25의 박테리오신은 일반적인 가열 처리 공정이나 산성식품 등 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 사료되며, 특히 pepsin에 대해선 안정하여 위장을 통과하는 동안에도 영향을 받지 않고 소장에 도달하면 trypsin의 작용에 의해 분해되어 체내에 잔류하지 않을 것으로 여겨진다. 한편, L.
monocytogenes KCTC 3569에 대해서는 이 보다 더 높은 항균활성(1,280 AU/ml)을 나타내었다. 따라서 L. brevis DK25의 박테리오신은 일부 특정한 균에 대해서만 항균 효과를 보여 항균 스펙트럼은 비교적 좁은 범위로 나타났다.
또한 L. brevis DK25의 배양 상등액 50 μl/ml 처리 시 L. monocytogenes KCTC 3569의 초기 균수는 유도기가 대조구에 비해 다소 연장 되었으나, 그 이후에는 서서히 증가되기 시작하였고, 배양상등액 100 μl/ml 처리한 경우 12시간까지는 초기 균수가 감소된 반면 이후에는 조금씩 증가되었다.
brevis DK25의 박테리오신 활성은 절반으로 감소되었다. 또한 amylase, pepsin 및 lipase 처리에 대해서는 활성에 영향을 받지 않았으나, trypsin에 의해선 75% 감소되었고 protease 처리에 의해서는 활성이 완전히 소실되었다. 따라서 L.
Horse 혈액한천배지 상에서 적혈구 용혈능은 보이지 않았고, amylase, protease 및 oxidase 등은생성하였으나, catalase와 urease 생성능은 없었다. 또한 ornithine과 lysine는 가수분해할 수 있었으나, arginine 가수분해능은 나타내지 않았고, tryptophan으로부터 indole 생성능도 음성으로 나타났다. 호기적 및 혐기적 조건에서 모두 증식 가능하고 10-45℃와 pH 4.
05%를 혼합 처리한 경우에는 12시간 만에 초기 균수가 약 1 log cycle 감소되었고, 이후에도 균수는 크게 증가하지 않았다. 박테리오신 640 AU/ml와 안식향산칼륨 용액 0.05%를 혼합했을 때에는 배양 초기부터 급격하게 균수가 감소하여 24시간 후에는 초기 균수로부터 약 3 log cycle 정도의 균수가 감소되어 다른 처리구 보다 유의하게 높은 항균 효과가 나타났다. 한편 각 배양 시간별 항균 물질의 종류에 따른 항균 효과를 비교해 볼 때, 배양 24시간 후 모든 항균 물질 처리구는 대조구에 비해 항균 효과가 유의적으로 높았으며 (p<0.
박테리오신과 안식향산칼륨 용액을 각각 단독으로 처리한 경우에는 저장하는 동안 대조구에 비해 유의적으로 낮은 균수를 유지하였으나(p<0.05), 저장 10일째에는 박 테리오신 용액만을 처리했을 때 대조구와 유의적인 차이가 없을 정도로 균수가 높게 나타났고 안식향산칼륨 단독처리구 보다 균수는 더 높게 검출되었다.
박테리오신의 활성은 protease 처리에 의해 완전히 소실되었으나 pH 4-9의 범위에서는 활성에 변함이 없었고, 100℃에서 30분간 가열처리에도 활성을 유지하였으므로 열에 비교적 안정하였다. 박테리오신의 L. monocytogenes KCTC 3569에 대한 항균활성은 농도의존적으로 나타났고 특히, 4℃와 25℃에 저장하는 동안 마요네즈 내에 존재하는 L. monocytogenes KCTC 3569의 증식을 억제하기 위해선 박테리오신과 안식향산칼륨 용액을 단독으로 처리 하는 것보다는 이들을 혼합하여 처리했을 때 유의적으로 더높은 항균 효과를 얻을 수 있었다. 따라서 L.
brevis DK25의 박테리오신은 정지기 초기에 최대의 활성(1,280 AU/ml)을 나타내었으나, 그 이후에는 급격하게 감소되었으므로 박테리오신은 생산균이 증식하는 과정 동안 생성됨을 알 수 있었다. 박테리오신의 활성은 protease 처리에 의해 완전히 소실되었으나 pH 4-9의 범위에서는 활성에 변함이 없었고, 100℃에서 30분간 가열처리에도 활성을 유지하였으므로 열에 비교적 안정하였다. 박테리오신의 L.
brevis DK25가 생산한 박테리오신의 항균활성은 Enterococcus faecalis와 Listeria monocytogenes에 대해서만 나타나 항균 스펙트럼은 비교적 좁은 것으로 확인되었다. 배양과정 동안 L. brevis DK25의 박테리오신은 정지기 초기에 최대의 활성(1,280 AU/ml)을 나타내었으나, 그 이후에는 급격하게 감소되었으므로 박테리오신은 생산균이 증식하는 과정 동안 생성됨을 알 수 있었다. 박테리오신의 활성은 protease 처리에 의해 완전히 소실되었으나 pH 4-9의 범위에서는 활성에 변함이 없었고, 100℃에서 30분간 가열처리에도 활성을 유지하였으므로 열에 비교적 안정하였다.
게다가 API kit를 이용한 당 분해능을 조사한 결과, L-arabinose, ribose, D-xylose, β-methyl-xyloside, galactose, D-glucose, D-fructose, mannitol, α-methyl-D-glucoside, N-acetyl glucosamine, maltose 및 melibiose 등의 당을 발효할 수 있었던 반면, 그 외에 D-arabinose, D-mannose, rhamnose, inositol, sorbitol, amygdaline, esculine, cellobiose, saccharose 및 inuline 등의 당은 분해할 수 없었다. 이와 같은 당분해능 결과 DK25 균주는 L. brevis와 99.9% 일치하였고 이때 T-index는 0.62로 나타났다. 한편, DK25의 16S rDNA 염기서열 분석 결과는 Fig.
DK25 균주는 그람양성 간균이며, 포자를 형성하지 않고, 항산성 염색결과 음성이며, 운동성이 없는 균이다. 포도당으로부터 산을 생성하며, 생성된 젖산의 이성질체는 DL형이고, 황화수소 생성능은 없고, 질산염 환원력도 나타내지 않았으며 포도당으로부터 acetoin 생성능도 없었다. Horse 혈액한천배지 상에서 적혈구 용혈능은 보이지 않았고, amylase, protease 및 oxidase 등은생성하였으나, catalase와 urease 생성능은 없었다.
한편 각 배양 시간별 항균 물질의 종류에 따른 항균 효과를 비교해 볼 때, 배양 24시간 후 모든 항균 물질 처리구는 대조구에 비해 항균 효과가 유의적으로 높았으며 (p<0.05), 그 중에서 특히 박테리오신 640 AU/ml와 안식향산칼륨 0.05%를 혼합 처리했을 때 가장 항균 효과가 높게 나타났고, 그 다음으로는 박테리오신 640 AU/ml의 단독 처리 및 박테리오신 320 AU/ml와 안식향산칼륨 0.05%의 혼합 처리 순으로 나타났다.
brevis DK25의 박테리오신은 일반적인 가열 처리 공정이나 산성식품 등 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 사료되며, 특히 pepsin에 대해선 안정하여 위장을 통과하는 동안에도 영향을 받지 않고 소장에 도달하면 trypsin의 작용에 의해 분해되어 체내에 잔류하지 않을 것으로 여겨진다. 한편, L. brevis DK25 균주가 생산한 박테리오신의 분자량을 측정한 결과 약 9.4 kDa으로 확인되었다(Fig. 3).
5%의 활성이 감소되어 160 AU/ml의 값을 나타내었다. 한편, pH 4-9의 범위에서도 활성에 변함에 없었으나, pH 10에서 L. brevis DK25의 박테리오신 활성은 절반으로 감소되었다. 또한 amylase, pepsin 및 lipase 처리에 대해서는 활성에 영향을 받지 않았으나, trypsin에 의해선 75% 감소되었고 protease 처리에 의해서는 활성이 완전히 소실되었다.
08%를 나타내었는데 이는 유기산 생성에 의한 것이다. 한편, 박테리오신의 활성도 대수기에 나타나기 시작하여 배양 시간이 지날수록 급격하게 증가하여 18-24시간 동안 최대의 활성을 나타내었다. 하지만 정지기 이후에는 자가용해효소 작용에 의한 박테리오신의 분해로 인하여 항균활성은 다시 급격하게 저하되었다.

후속연구

brevis DK25 균주를 발효식품 스타터로서 사용할 경우 발효과정 중 생성된 유기산이나 박테리오신에 의한 항균활성 효과로 인하여 식품의 저장기간 연장및 식품의 변질을 억제할 수 있을 것으로 판단된다. L. brevisDK25의 박테리오신과 안식향산칼륨을 복합적으로 사용할 경우 합성보존료의 사용량을 줄여 인체의 위해 발생 위험을 감소시키고, 최소 가공식품을 선호하는 소비자들의 요구를 충족시킬 수 있으며, 항균 활성에 대한 상승효과를 얻을 수 있을 것이다. 향후 식품보존제로서 박테리오신을 적용하기 위해선동물 독성시험을 통해 박테리오신의 안전성이 우선 입증되어야 하며, 식품에 적용하거나 가공 및 보존 과정 중 박테리오신의 활성 유지 방법 모색, 박테리오신의 활성을 높일 수 있는 배양 방법, 유전자 재조합 기술을 통한 박테리오신의 대량 생산 기술 및 박테리오신과 함께 적용할 수 있는 다양한 허들들을 개발하여 식품첨가물로서의 이용 가치를 향상시켜야 할 것이다.
brevis DK25는 동치미에서 분리되었으므로 인체에 미치는 유해성은 적을 것으로 사료된다. 또한 L. brevis DK25의 박테리오신은 산이나 열에 안정하였으므로 산성식품이나 가열처리 식품에도 적용 가능하며, L. brevis DK25 균주를 발효식품 스타터로서 사용할 경우 발효과정 중 생성된 유기산이나 박테리오신에 의한 항균활성 효과로 인하여 식품의 저장기간 연장및 식품의 변질을 억제할 수 있을 것으로 판단된다. L.
박테리오신과 함께 hurdle technology에 적용 가능한 방법으로는 무기염, 킬레이트, 유기산, 지방산 분해물, 페놀화합물, 라이소자임 및 락토페린 등의 항균물질과 혼용하거나 물리적인 방법으로는 pH, 온도, 수분활성도, 산화환원전위 조절과 가스치환 및 방사선 조사 등의 허들들을 조합하여 적용할 수 있다. 또한 화학 합성품과 병용 처리함으로써 돌연 변이, 발암 등의 유발 위험이 높은 이들 합성품의 사용량을 감소시킬 수 있을 것이다(11). 효과적으로 L.
monocytogenes를 제어할 수 있다고 보고되는 허들로는 enterocin EJ97과 nitrite (10), nisin과 lactate (6), nisin과 sorbate (2), nisin과 lactoperoxidase system (41) 등의 처리 방법들이 알려져 있다. 박테리오신을 식품보존제로 이용할 경우, 식품의 저장기간 연장을 비롯하여 적절하지 않은 저장 조건에 보관된 식품의 품질 보호, 식중독 사고 위험성 감소, 교차오염 방지, 식품이 부패와 변패되어 폐기할 때 발생되는 경제적 손실 방지, 화학합성품 사용량 감소, 비가열 처리로 인한 비타민과 같은 영양 성분 파괴 감소 및 향미 유지, 새로운 저장 기술 적용으로 인한 판매 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 독성이 낮은 천연 보존제로서 소비자들의 만족도 제고 등의 유리한 잇점이 있으므로 향후 박테리오신의 적용 가능성은 매우 확대될 것으로 전망된다(37).
brevisDK25의 박테리오신과 안식향산칼륨을 복합적으로 사용할 경우 합성보존료의 사용량을 줄여 인체의 위해 발생 위험을 감소시키고, 최소 가공식품을 선호하는 소비자들의 요구를 충족시킬 수 있으며, 항균 활성에 대한 상승효과를 얻을 수 있을 것이다. 향후 식품보존제로서 박테리오신을 적용하기 위해선동물 독성시험을 통해 박테리오신의 안전성이 우선 입증되어야 하며, 식품에 적용하거나 가공 및 보존 과정 중 박테리오신의 활성 유지 방법 모색, 박테리오신의 활성을 높일 수 있는 배양 방법, 유전자 재조합 기술을 통한 박테리오신의 대량 생산 기술 및 박테리오신과 함께 적용할 수 있는 다양한 허들들을 개발하여 식품첨가물로서의 이용 가치를 향상시켜야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	리스테리아 균에 의한 식중독 사고 중 미국의 사례는 어떠한가?	지구온난화로 인하여 기온이 점점 상승하고 각 국가들간 국제 교역은 날로 활발해지며 단체급식이 확대 보급됨에 따라 전세계적으로 식중독 사고는 끊임없이 계속해서 발생하여 막대한 경제적 피해와 공중보건을 위협하고 있다. 1981년 캐나다 노바스코샤주에서 오염된 샐러드를 먹은 41명의 환자로부터 Listeria monocytogenes을 확인한 이후 해마다 리스테리아 균에 의한 식중독 사고는 끊이질 않고 있으며 얼마 전 미국 보건당국의 발표에 따르면, 리스테리아균에 오염된 멜론을 먹고 100여 명이 식중독에 걸렸고 이중에서 총 18명이 사망한 것으로 보고된 바 있다(33). 음식물을 통해 체내에 유입된 리스테리아균은 혈류를 따라 중추신경계 장애를 일으켜 설사, 발열, 근육통 및 두통을 동반하며 특히 임산부들에게는 유산이나 사산을 유발하고 신생아들에게는 뇌수막염을 일으킬 뿐만 아니라 면역력이 약한 노인들과 에이즈나 암 환자, 알코올중독자 및 면역억제제를 복용하는 장기 이식수술 환자들에게 위험성이 높은 것으로 알려져 있다(28).
	체내에 유입된 리스테리아균은 인체에 어떤 영향을 주는가?	1981년 캐나다 노바스코샤주에서 오염된 샐러드를 먹은 41명의 환자로부터 Listeria monocytogenes을 확인한 이후 해마다 리스테리아 균에 의한 식중독 사고는 끊이질 않고 있으며 얼마 전 미국 보건당국의 발표에 따르면, 리스테리아균에 오염된 멜론을 먹고 100여 명이 식중독에 걸렸고 이중에서 총 18명이 사망한 것으로 보고된 바 있다(33). 음식물을 통해 체내에 유입된 리스테리아균은 혈류를 따라 중추신경계 장애를 일으켜 설사, 발열, 근육통 및 두통을 동반하며 특히 임산부들에게는 유산이나 사산을 유발하고 신생아들에게는 뇌수막염을 일으킬 뿐만 아니라 면역력이 약한 노인들과 에이즈나 암 환자, 알코올중독자 및 면역억제제를 복용하는 장기 이식수술 환자들에게 위험성이 높은 것으로 알려져 있다(28). 리스테리아균은 저온하에서도 증식이 가능한데 이는 세포막을 구성하는 지방산의 조성을 변화시켜 세포막의 유동성을 유리한 조건으로 만들고 저온에 강한 단백질(cold shock proteins, Csps)을 생산하며 glycine betaine 및 carnitine과 같은 동해방지물질을 생산하여 자신의 세포를 보호할 수 있기 때문이다.
	Listeria monocytogenes는 주로 어떤 식품에서 발견되는가?	주로 가공육, 훈연생선, 생야채, 사과쥬스, 우유, 치즈, 버터와 같은 유제품 등 다양한 식품에서 흔히 발견되므로 식품의 제조, 유통, 보관 및 조리 과정 중 각별한 주의가 필요하며, 학계나 식품 제조업체에서는 식품의 관능학적 및 영양학적 성분 변화없이 리스테리아균을 제어할 수 있는 식품 저장 기술 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다(39). 식중독균의 오염으로부터 안전한 식품 제조를 위해 철저한 위해요소 분석및 제품의 광범위한 미생물 조사, 식품제조 시설의 관리 감독및 식품제조업자의 위생교육 강화 등의 위해요소중점관리기준 (Hazard Analysis Critical Control Point, HACCP) 제도 도입을 적극 권장하고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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