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문제 정의
- 단호박의 농도별, 발효시간별로 관능적 차이가 있는지 검사를 하였다. 이 실험은 어느 농도와 어느 발효시간이 가장 좋은 것인지 판단한 실험은 아니므로 차후 기호도 또는 선호도검사가 진행되어야 할 것이다.
- 동정된 유산균중 Lactobacillus sakei KJ123는 특히 사케의 발효과정에서도 분리되었고, 일부 조건에서 특정 향기성분을 만든다는 것을 본 연구실에서 확인한 결과, 이를 건강발효음료 개발에 적용하는 연구를 실시하였다. 또한 연구중 항균성에 대한 테스트를 실시한 결과 긍정적으로 판단되어 지속적으로 분석하였다.
- 특히, 호박분말 첨가가 아닌 단호박 자체를 기질로 사용한 발효음료나 유산균을 김치에서 분리하여 사용한 발효음료에 대한 연구는 되었으나 [19], 아직 상품화되어있지 않다. 따라서 본 연구는 단호박의 소비 수요의 유도 목적과 동시에 단호박의 식품영양학적 가치를 그대로 가진 새로운 유산균 발효 음료를 개발하고자 한다.
- 본 연구실에서는 맛과 향이 다양한 여러 가지 김치에서 미생물을 분리하고 동정하였다. 이들중 식품산업화에 응용이 가능하다고 사료되는 균주를 선택하여 지속적으로 연구하였다. 우리나라 대표적인 식품인 김치를 이용한 여러가지 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
가설 설정
- pH값의 측정은 pH-meter를 사용하여 측정하였고 적정산도는 단호박 발효배지 중 17.6 mL를 덜어낸 다음 증류수 17.6 mL를 더하여 총 볼륨 35.2 mL를 만든 후 phenolphthalein용액을 2~3적 가하였다. 0.
제안 방법
- 2 mL를 만든 후 phenolphthalein용액을 2~3적 가하였다. 0.1 N NaOH용액을 적정하여 30초 동안 분홍빛이 사라지지 않을 때 까지 사용된 NaOH용액의 양으로 계산하였다. 생균수 측정은 10-4배를 0.
- 이 실험은 인공위액에서 살아남은 유산균을 가지고 실험 하였다. 10%의 oxgall을 broth 배지에 첨가하여 균을 배양한 후 배양된 균을 10-3배 희석하여 MRS agar배지에 0.5 mL도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다. 생균수 측정결과 2.
- 동정된 균주들 중 활성이 가장 좋은 균주를 취하여 16s rRNA full sequencing을 하였다. 16s rRNA full sequencing을 한 결과를 rRNA database (NCBI: national center for biotechnology information, RDP: ribosomal database project, ERRD:European ribosomal RNA database)와 비교하여 대상 미생물이 어떤 종류의 미생물이 분리 되었는지 확인하였다.
- 최종적으로 선별된 3종 중 2종은 사멸하였고 CH123라 명한 1종만이 살아남았다. CH123을 10-3배 희석하여 MRS agar배지에 0.5 mL도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다. 생균수 측정결과 3.
- 균주 CH123의 배양액을 15,000 rpm에서 원심분리하고, 상등액을 채취하여 0.2 μm membrane filter로 여과하고, HPLC(Acme 9000, Youngjin)로 분석하였다.
- 향에 대한 판단은 관능검사 요원들에 의해 빠르게 설정하고, 동정하였다. 균주들을 선정하고, 이 균주들에 대한 생육특성을 조사하였다. 실험 결과 (Fig.
- 그리고 2시간 간격으로 spectrophotometer를 이용하여 660 nm에서 광밀도를 측정하고 glucose kit을 이용하여 tube에 효소액 3 mL과 측정할 검체와 맹검 (맹검은 DW를 이용하여 대조군으로 하였다. )을 20 μL을 넣고 37.5℃에서 중탕한 후 550 nm에서 포도당을 측정하고, pH meter를 이용하여 sample을 tube에 3 mL넣어 pH값을 측정하였다.
- 그리고 MRS agar에 10배 희석 (D.W 9 mL + E. coli 1 mL)한 E. coli를 100 μL spreading하고, 건조 된 paper disk를 배지 중심부에 올려놓고, 결과를 관찰하였다.
- 김치에서 분리한 균주 CH123의 최적 온도를 알기 위해 MRS broth 50 mL에 30℃ shaking incubator에서 배양 시킨 후, 250 mL에 계대배양하여 25℃, 30℃, 35℃ 조건에 맞춰 shaking incubator에서 120 rpm의 조건에서 배양하였다. 그리고 2시간 간격으로 spectrophotometer를 이용하여 660 nm에서 광밀도를 측정하고 glucose kit을 이용하여 tube에 효소액 3 mL과 측정할 검체와 맹검 (맹검은 DW를 이용하여 대조군으로 하였다.
- 김치에서 유산균으로 추정되는 균주를 분리하기 위하여 MRS배지를 사용하였고, 균주 19종을 분리하였다. 배양 후 젖산을 생산할 것으로 추정할 수 있는 pH 4 이하의 균주를 선택하여 총 3종류를 결정하였다.
- 단호박 배지를 농도별로 10, 20, 30%를 만들어 발효 시켰다. 무게는 wet weight를 이용하여 구하였다.
- 동정된 균주들 중 활성이 가장 좋은 균주를 취하여 16s rRNA full sequencing을 하였다. 16s rRNA full sequencing을 한 결과를 rRNA database (NCBI: national center for biotechnology information, RDP: ribosomal database project, ERRD:European ribosomal RNA database)와 비교하여 대상 미생물이 어떤 종류의 미생물이 분리 되었는지 확인하였다.
- sakei는 facultative hetero-fermentative 유산균으로, glucose fermentation을 통해 lactic acid 이외에 acetic acid나 그 이외의 다른 부산물을 생산하며, 김치숙성과정 중반기부터 생육을 시작하여 젖산과 기타 휘발성 대사산물을 생산하여 김치를 복합적이며 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 또한 probiotics의 효과를 확인하기 위해 내산성과 내담즙성을 통해 대장균에 대한 항균성과 식품과 음료의 가능성을 확인하였다.
- 동정된 유산균중 Lactobacillus sakei KJ123는 특히 사케의 발효과정에서도 분리되었고, 일부 조건에서 특정 향기성분을 만든다는 것을 본 연구실에서 확인한 결과, 이를 건강발효음료 개발에 적용하는 연구를 실시하였다. 또한 연구중 항균성에 대한 테스트를 실시한 결과 긍정적으로 판단되어 지속적으로 분석하였다. 본 연구에서는 특히 식품이나 음료 발효과정 중 유산균을 첨가하면 맛과 향은 물론 항균성이 특징적으로 작용한다면 방부제등을 대체할 수 있는 효과를 얻을 수 있으므로, 식품첨가미생물로 대체할 수 있다.
- 무게는 wet weight를 이용하여 구하였다. 발효시간 별로는 12, 24, 36, 48시간동안 발효를 시켰다. 이렇게 만들어진 발효 음료는 15℃로 냉각하여 5점 평점법 (매우 좋음 5점, 좋음 4점, 보통 3점, 나쁨 2점, 매우 나쁨 1점)으로 평가하였다.
- 김치에서 유산균으로 추정되는 균주를 분리하기 위하여 MRS배지를 사용하였고, 균주 19종을 분리하였다. 배양 후 젖산을 생산할 것으로 추정할 수 있는 pH 4 이하의 균주를 선택하여 총 3종류를 결정하였다. 그 중 독특한 향을 만들어 내는 균주를 선택하였다.
- 본 연구실에서 분리한 균주 CH123을 농도가 다른 세가지 종류의 단호박 배지 (5%, 10%, 20%), 250 mL에 5 mL씩 접종한 후 36℃의 shaking incubator에서 20시간 동안 배양하면서 광밀도와 포도당 농도, pH값을 측정하였고, 측정방법은 위와 같다.
- 특히 김치는 각 가정에서 만들어지므로 맛이나 향이 매우 다양하고, 이는 지역 및 원료물질의 종류와 조성에 따라 미생물의 생육조건도 다양하게 되어 흥미로운 발효결과를 얻게 되는 원인이 된다. 본 연구실에서는 맛과 향이 다양한 여러 가지 김치에서 미생물을 분리하고 동정하였다. 이들중 식품산업화에 응용이 가능하다고 사료되는 균주를 선택하여 지속적으로 연구하였다.
- 본 연구에서는 서울지역의 일반가정에서 담근 지 35일 된 김치에서 균을 분리하여, L. sakei를 동정하였다. L.
- 균을 활성화시켜 30℃에서 진탕배양기에서 120 rpm으로 배양하였다. 시료는 4시간 마다 채취하여 분광광도계(Spectrophotometer, Shimadzu)로 흡광도와 포도당 농도를 측정한다. 흡광도는 660 nm에서 측정하며, 오차를 줄이기 위하여 증류수로 25배 희석한 후 측정한다.
- 발효 식품 가공과정에서도 유산균의 기능과 함께 방부제로서의 역할도 기대할 수 있다. 약 18시간 배양 후 대장균에 대한 저해성을 확인하였다. 유산균이 최종적으로 머무를 곳은 사람의 대장이다.
- 위 실험을 통하여 최종적으로 분리된 균 CH123에 대한 16s rRNA Full Sequencing을 하여 균주 동정을 실시하였다. 그 결과 CH123은 Lactobacillus sakei의 확률이 99%로 동정되었다 (Fig.
- 45 μm에 거른 발효물을 묻힌 paper disk를 말린 후 plate에 올려놓았다. 이후 36℃ incubator에서 18시간 배양한 E. coli k12에 대한 항균활성을 측정하기 위해 LB broth배지 250 mL에 E. coli k12를 24시간 배양 하고, MRS broth 50 mL에 키워 놓았던 CH123을 250 mL에 계대시킨 후 4시간 간격으로 균주를 시료로 채취하였다. 균주 배양액은 1 mL를 13,000 rpm으로 5분 원심분리 하고, 멸균된 paper disk에 상등액 100 μL 흡착시킨 후, 15분 건조시킨다.
- 5 mL를 도말 한 후 36℃의 배양기에서 48시간 배양하였다. 이후 콜로니를 계수하여 희석배수를 곱하여 1 mL중의 생균수를 측정하였다.
- 김치에서 분리된 유산균을 36℃ MRS broth에서 24시간 배양시킨 후 15 mL tube에 넣고 3,000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다. 회수된 균에 상등약과 동일한 양의 인공위액을 넣은 후 36℃ shaking incubator에서 2시간 배양한 후 10-3배 희석하여 MRS agar배지에 0.5 mL 도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다. 대조군은 pepsin을 첨가하지 않고 pH를 맞추지 않은 broth를 이용 하였다.
대상 데이터
- 유의성 검정은 패널과 시료별로 점수의 합계를 계산한 뒤 분산분석 방법으로 하였다. 관능평가 요원은 의사소통이 가능하고, 단맛, 신맛, 짠맛, 쓴맛과 향을 구분 할 줄 아는 대학생 및 대학원생 13명으로 구성하였다.
- 국내산 단호박은 신토자 품종으로 2007년 10월에 경기도 양평에서 수확된 것으로 서울 경동시장에서 구입하였다. 단호박은 구입 후 분리 및 세절하여 초저온 냉동고 (-80℃)에 보관하면서 사용하였다.
- 배양 후 젖산을 생산할 것으로 추정할 수 있는 pH 4 이하의 균주를 선택하여 총 3종류를 결정하였다. 그 중 독특한 향을 만들어 내는 균주를 선택하였다. 향에 대한 판단은 관능검사 요원들에 의해 빠르게 설정하고, 동정하였다.
- 국내산 단호박은 신토자 품종으로 2007년 10월에 경기도 양평에서 수확된 것으로 서울 경동시장에서 구입하였다. 단호박은 구입 후 분리 및 세절하여 초저온 냉동고 (-80℃)에 보관하면서 사용하였다. 배지 제조는 과피 부분과 과육 그리고 씨 부분으로 나누었으며 과피 및 과육을 잘게 썰고 (1 cm이하)씨는 반으로 잘라 플라스크에 넣은 후 60℃에서 1시간 중탕하였다.
- 종균냉동보관은 glycerol을 처리하여 -80℃에서 3개월마다 계대하였다. 동정된 균주들중에서 주류 제조시 향을 생성하는 균주들을 선택하였고, 이중에서 인공위액과 인공담즙산에서 살아남은 1종을 최종적으로 실험에 사용하였다.
- 2 μm membrane filter로 여과하고, HPLC(Acme 9000, Youngjin)로 분석하였다. 사용된 컬럼은 Organic acid analysis columm Aminex HPX-87H Ion exclusion columm (Bio-Red, U.S.A.)으로 컬럼의 온도는 35℃로 유지시켰다. 이동상은 0.
- 담즙산은 유산균을 사멸시키는 또 다른 변수이며 이 담즙산도 통과해야 장에 유산균이 살아서 도달 할 수 있다. 이 실험은 인공위액에서 살아남은 유산균을 가지고 실험 하였다. 10%의 oxgall을 broth 배지에 첨가하여 균을 배양한 후 배양된 균을 10-3배 희석하여 MRS agar배지에 0.
데이터처리
- 이렇게 만들어진 발효 음료는 15℃로 냉각하여 5점 평점법 (매우 좋음 5점, 좋음 4점, 보통 3점, 나쁨 2점, 매우 나쁨 1점)으로 평가하였다. 유의성 검정은 패널과 시료별로 점수의 합계를 계산한 뒤 분산분석 방법으로 하였다. 관능평가 요원은 의사소통이 가능하고, 단맛, 신맛, 짠맛, 쓴맛과 향을 구분 할 줄 아는 대학생 및 대학원생 13명으로 구성하였다.
이론/모형
- 인공위액은 Kobayashi 등의 방법에 따라 1 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS broth에 pepsin 1%를 첨가하여 사용하였다 [16]. 김치에서 분리된 유산균을 36℃ MRS broth에서 24시간 배양시킨 후 15 mL tube에 넣고 3,000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다.
성능/효과
- 본 연구에서는 특히 식품이나 음료 발효과정 중 유산균을 첨가하면 맛과 향은 물론 항균성이 특징적으로 작용한다면 방부제등을 대체할 수 있는 효과를 얻을 수 있으므로, 식품첨가미생물로 대체할 수 있다. Lactobacillus sakei KJ123는 유기산 생성과 함께 대장균에 대한 테스트 결과 E. coli 균생성이 억제되었다.
- 8). pH값을 보면 5% 농도의 배지에서 가장 낮은 pH가 나타나지만, 5%, 10%, 20% 농도 모두 값이 근소한 것을 확인 하였다 (Fig. 9), 따라서, 20%의 단호박배지에서 L. sakei의 성장 및 생장이 가장 활발한 것으로 확인 되어 20% 농도의 단호박배지를 최적배지로 정하였다.
- 위 실험을 통하여 최종적으로 분리된 균 CH123에 대한 16s rRNA Full Sequencing을 하여 균주 동정을 실시하였다. 그 결과 CH123은 Lactobacillus sakei의 확률이 99%로 동정되었다 (Fig. 6). L.
- 단호박 배지에서 농도 별 L. sakei의 OD 값의 변화를 관찰한 결과 시간의 변화에 따라 단호박 배지의 농가가 20%인 경우에서 가장 많이 증가 됨을 확인 하였고 반대로 5%인 경우 가장 낮았다 (Fig. 7). 또한 단호박배지의 농도가 20%인 경우가 낮은 5%의 경우보다 포도당이 많이 소모 되어 지는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig.
- 인공위액 실험이나 인공담즙산 실험이나 대조군으로 사용되는 것은 아무것도 첨가하지 않은 MRS broth를 사용하였기 때문이다. 대조군보다는 생균수가 적지만, 10%의 oxgall배지에서도 CH123 유산균이 살아남는 것으로 관찰되었다 (Fig. 5).
- 7). 또한 단호박배지의 농도가 20%인 경우가 낮은 5%의 경우보다 포도당이 많이 소모 되어 지는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 8). pH값을 보면 5% 농도의 배지에서 가장 낮은 pH가 나타나지만, 5%, 10%, 20% 농도 모두 값이 근소한 것을 확인 하였다 (Fig.
- 균주들을 선정하고, 이 균주들에 대한 생육특성을 조사하였다. 실험 결과 (Fig. 1-3)에 의하면 OD 값의 변화와 포도당의 분해정도를 통해 30℃에서 가장 잘 자랐지만, 25℃에서와 비교했을 때 큰 차이는 없었다. 반면에, 35℃에서는 일정시간 동안 균의 생장을 관찰할 수 없었다.
- 대장에서의 대장균제어는 유산균의 가장 중요한 역할이고, 유산균발효음료가 의약품이 아닌 기능성식품의 종류인 음료이기 때문에 다른 병원성 미생물에 대한 생장저해 효과는 실험에서 배제하였다. 실험결과 대장균이 도포된 plate에서 단호박 배지 발효물을 묻힌 paper disk를 중심으로 지름 14 mm의 클리어존이 생성된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 발효되지 않은 단호박 배지를 묻힌 paper disk에서는 클리어존이 형성되지 않았다.
- 2 × 108 CFU/mL개였다. 인공위액에서 유산균의 일부 사멸이 관찰되었으나 위산에 대한 내산성이 있음을 확인하였다 (Fig. 4).
- 2830 mM로 분석되었다. 즉, 단호박 배지의 농도가 높을수록 당의 농도로 높고, 더 많은 양의 산이 생성되므로, 단호박을 이용한 발효 음료의 건강기능성이 일반적인 호박의 경우보다 더 유효할 것으로 추정된다 (Fig. 10,11).
- 유산균을 건강음료로 사용하기 위해서는 유산균이 대부분 죽는 위에서 위산을 견딜 수 있는 내산성이 요구된다. 최종적으로 선별된 3종 중 2종은 사멸하였고 CH123라 명한 1종만이 살아남았다. CH123을 10-3배 희석하여 MRS agar배지에 0.
후속연구
- 따라서 CH123은 발효식품 생산과정에서 매우 유용한 첨가 미생물로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, CH123은 발효과정과, 일부 조건에서 특정 향기성분을 생성할 수 있으므로 맛과, 향, 그리고 항균성까지 종합적으로 갖춘 뛰어난 기능성발효음료생산에 적용할 수 있을 것이다.
- 따라서 CH123은 발효식품 생산과정에서 매우 유용한 첨가 미생물로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, CH123은 발효과정과, 일부 조건에서 특정 향기성분을 생성할 수 있으므로 맛과, 향, 그리고 항균성까지 종합적으로 갖춘 뛰어난 기능성발효음료생산에 적용할 수 있을 것이다.
- 지금까지 여러 가지 유산균과 효모종들이 분리 및 동정되었으며 응용분야와 산업화에 관한 연구도 지속적으로 이루어지고 있다. 앞으로도 이러한 김치 유래 유산균과 미생물의 산업화는 매우 산업적으로 의미 있는 분야가 될 것이다.
- 단호박의 농도별, 발효시간별로 관능적 차이가 있는지 검사를 하였다. 이 실험은 어느 농도와 어느 발효시간이 가장 좋은 것인지 판단한 실험은 아니므로 차후 기호도 또는 선호도검사가 진행되어야 할 것이다. 결과 및 통계분석에 사용된 수식은 다음과 같다.
- 86 이므로 시료의 F값이 기준 값보다 크므로 유의수준 5%에서 단호박 발효음료는 농도별 발효시간별로 서로 다른 특성의 차이를 보인다고 볼 수가 있다. 정확한 최적 농도와 발효시간별 최적 발효는 기호도 또는 선호도 검사를 차후에 진행시켜 확인해야 한다.
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