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문제 정의
- 본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포에 꾸지뽕잎의 물및 70% 에탄올 추출물을 처리하여 세포의 분화 및 지방생성 억제에 미치는 영향을 관찰하여 저해 활성을 확인 하였기에 보고하고자 한다.
- 따라서 최근에는 천연물 유래 추출물을 이용하여 지방세포에 대한 중성지방의 축적을 억제하고 지방세포의 수를 줄이는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구팀도 지방축적을 저해하는 천연물 유래 추출물을 탐색하고자 비만개선에 효과가 있다고 알려진 꾸지뽕을 이용하여 실험을 수행하였다. 꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata) 뽕나무과에 속하는 낙엽성 소교목으로 잎 부분을 한방에서는 습진, 유행성이하선염, 폐결핵, 만성 요퇴통, 타박상, 급성관절염 등을 치료하는데 사용하고 있으며 최근 꾸지뽕나무의 생리활성 작용으로서는 뽕잎의 항염증 작용 및 항균작용(4-5), 마우스에서의 지질상승 및 산화 억제 작용(6), 간독성 억제작용(7), trypsin 효소 활성 저해능, 항염증활성 성분, Sraphylococcus awretts에 대한 항균효과도 보고되었다(8).
제안 방법
- 25% trypsin-EDTA (Gibco Co, USA) 용액을 넣어 371, 5% g 조건에서 3분간정치 후 세포를 탈착시켜 계대배양하여 유지하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 분화 유도하기 위하여 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco Co, USA)와 1% #$가 첨가된 DMEM을 이용하여 6 well plate의 각 well에 1.25xl()5 cells/well로 분주 하고 2일후 배지를 교환하여 3-4일째에 세포가 완전히 융합상태가 되게 하였다. 융합상태에서 10% FBS 와 MDI solution (0.
- MTT (3-(43niiniethylthiazol-2-yl)-255-diphenyl-tetezolium bromide, thiazolyl blue tetrazolium bromide) assay 는 cell {rfition과 cell viability의 in vitro 분석에 매우 유용하게사용되고 있으며 꾸지뽕의 물 및 70% 에탄올 추출물의 cell viability를 측정하기 위하여 3T3-L1 지방세포를 이용하여 측정하였다. 0-5 mg/mL 농도범위에서 측정한 결과는 Eg.
- OflRedO staining 은 분화 유도 7-9 일째 된 세포를 사용하여 실시하였다. 10% FBS DMEM을 제거한 뒤, 세포를 PBS 로 2번 세척하고, 10% fonmlin으로 4°C에서 1시간 동안 고정한 다음 증류수로 3번 세척하였다.
- Rutin 표준쑴은 1, 10, 20 pg/mL 농도로 제조하였다. 꾸지뽕잎 추출물의 rutin 함량 분석은 시료 1g을 메탄올 100 mL로 용해시켰다.
- 각 시 료 100 mg 을 0.05 M HC1 10 mL을 첨가하여 30초동안 교반하고 21, 690 g에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻고 증류수를 첨가하여 100 mL이 되도록 한 다각표준 용액 및 전 처리한 샘플 10 pL를 1.5 mL 마이크로튜브에 넣고 0.4 M potassium berate bufe pH 8.5를 10 pL 첨가하였다. 여기에 10 mM FOMC (CH3CN)를 10 pL를 첨가후 혼합하여 20°C에서 20분 동안 반응시켰다.
- 각 시료는 일반성분, 무기질 성분, 추출 수율을 측정하였다. 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 micro Kjeldahl 법, 조지 방은 Soxhlet 추출법, 조회분은 건식회화법 에 따라 각각 정 량하였다.
- 꾸지뽕잎의 물 및 70% 에탄올 추출물에 대한 세포의 독성 및 지방생성에 미치는 영향과 DNJ 함량과 rutin 함량을 측정하였다. Cell viability test에서 꾸지뽕잎 추출물 0.
- 여기에 10 mM FOMC (CH3CN)를 10 pL를 첨가후 혼합하여 20°C에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 종결을 위하여 0.1 M glycine 용액을 10 pL 첨가하여 반응을 종결하고 최종부피가 1000 가 되도록 0.1% (v/v) acetic acid를 960 pL를 첨가하여 0.2 pm nylon syringe filter를 이용하여 여과한 후 HPLC 분석을 하였다.
- 이때, 시료가 지방세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시료를 농도별로 함께처리하였다. 분화 유도 2일 후, 배지를 시료, 10% FBS, 1% P/S, 5 pg/mL insulin이 포함된 DMEM으로 교환 하였고분화 유도 4일째부터는 2일에 한번씩 10% 와 1% #가포함된 DMEM으로 교환하여 세포를 분화시켰다.
- Prolabo, France)를 사용하였다. 시료의 마이 크로웨이브 추출조건은 추출 용매로 water, 50% ethanol, 100% ethanol 을 사용하였고, 마이크로 파워는 90 W, 추출시간은 5분으로 하였다. 이렇게 하여 얻어진 추출물을 whatman filter paper No 2에 거른 후 회전 감압증발기(Ratavapor R-123, Buchi, Swrland)로 감압 농축하였고 50 mL 증류수로 정용하여 꾸지뽕잎 추출물을 얻었다.
- 세척된 세포는 세포 내 생성된 지방구와 특이적으로 반응하는 QI Red O (Sigma Co, USA)로 1 시간 동안 염색하였다. 염색 후, 염색액을 제거하고 증류수를 이용해 3번 세척한 다음 증류수를 well 에 채우고 현미경으로 관찰하였다. 중성지방의 정 량은 증류수를 제거한고 완전히 마른 well에 100% iso-propyl alcohol을 2 mL 첨가하여 Oil-Red O 를 다시 용출시킨 후 ELISA reader (Molecular devices Co, USA) 로 490nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- 25xl()5 cells/well로 분주 하고 2일후 배지를 교환하여 3-4일째에 세포가 완전히 융합상태가 되게 하였다. 융합상태에서 10% FBS 와 MDI solution (0.5mM 3-iso-Butyl-1 -methylxanthine, IpM dexamethsone, 5 insulin) (Sigma Co, USA) 를 처리하여 분화를 유도 하였다. 이때, 시료가 지방세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시료를 농도별로 함께처리하였다.
- 5mM 3-iso-Butyl-1 -methylxanthine, IpM dexamethsone, 5 insulin) (Sigma Co, USA) 를 처리하여 분화를 유도 하였다. 이때, 시료가 지방세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시료를 농도별로 함께처리하였다. 분화 유도 2일 후, 배지를 시료, 10% FBS, 1% P/S, 5 pg/mL insulin이 포함된 DMEM으로 교환 하였고분화 유도 4일째부터는 2일에 한번씩 10% 와 1% #가포함된 DMEM으로 교환하여 세포를 분화시켰다.
- 꾸지뽕잎의 물 및 70% 에탄올 추출물의 지방축적 Qipid accumulation)은 각각 61%, 21%로 측정되어 꾸지뽕잎 에탄올 추출물의 지방 축적에 대한 억제력이 물 추출물 보다 높았다. 지방축적 정도를 정확하게 알아보기 위하여 0.5-5 mg/mL 농도 범위에서 지방세포의 분화를 관찰하였다. 꾸지뽕잎 물 주줄물의 결과는 Fig.
대상 데이터
- 3T3-L1 지방전구세포의 배양은 1% penicillin-stteptomycin (P/S, Gibco Co, USA)과 10% bovine calf serum (BCS, Gibco Co, USA)이 첨가된 DMEM을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배 양은 3일 간격으로 하고, 세포는 100 0 plate 바닥에 70% 정도에서 phosphate buffered saline (PBS, Gibco Co, USA) 로 세척한 후, 0.
- DNJ (1 -deoxynojirimycin) 표준품은 Sigina Co (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고 증류수에 녹여 최종 10 mg/mL 의 용액을 제조하여 분석용 표준용액 0.1, 1.0, 5.0, 10 jjL 농도로 희석하여 표준용액으로 사용하였다.
- 본 실험에 시료로 사용된 꾸지뽕잎은 영농법인 고성 꾸지뽕에서 구입한 것을 분쇄기(M20, IKA®, Germany)로 분쇄하였고, 0.2 mm PE film에 밀봉 포장하여 냉동고에 보관하면서 사용하였다.
- 유용성분의 추출을 위해 2, 450 MHz 주파수에 환류냉각관이 장치된 상압형 마이크로파 추출장치 (MAP, Soxwave- 100, Prolabo, France)를 사용하였다. 시료의 마이 크로웨이브 추출조건은 추출 용매로 water, 50% ethanol, 100% ethanol 을 사용하였고, 마이크로 파워는 90 W, 추출시간은 5분으로 하였다.
데이터처리
- All values are expressed as mean ± SD. Means with the same lettered superscripts on bais are not significantly different at the 0.05 level by Duncan's multiple range test.
- All values are expsed as mean ± SD of triplicate detennmations. Means with the same lettered supeiscripts in a column are not significantly diffeient at the 0.05 level by Dencam's multiple range test.
- 본 실험은 3반복 측정하여 얻어진 결과에 대해 Statistical Analysis System (SAS version 8.0, 2004)을 이용하여 평균, 표준편차의 값을 산출하였고 Duncan's multiple range test를통해 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 micro Kjeldahl 법, 조지 방은 Soxhlet 추출법, 조회분은 건식회화법 에 따라 각각 정 량하였다.
- 시료에 대한 세포 생존율은 MTT (3-(4, 5-inethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenylte trazolium bromide} colorimetric assay 방법으로 실험하였다. 세포는 L25xl()5 cell/200 pL의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간배양 후 배지를 제거하였다.
성능/효과
- 측정하였다. Cell viability test에서 꾸지뽕잎 추출물 0.5-5mg/mL의 농도일 때 물 및 에탄올 추출물 모두 세포의 생장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 세포에 대한 독성이 없다고 판단되었다. 동일한 농도로 3T3-L1 지방세포의 지방축적에 미치는 영향은 물 및 에탄올 추출물 모두 농도의존적으로 지방축적을 저해하는 것으로 나타났으며 추출물 농도가 5 mgftnL 일 때, 물 추출물은 86%, 에탄올 추출물 50%의 지방축적을 보였다.
- 동일한 농도로 3T3-L1 지방세포의 지방축적에 미치는 영향은 물 및 에탄올 추출물 모두 농도의존적으로 지방축적을 저해하는 것으로 나타났으며 추출물 농도가 5 mgftnL 일 때, 물 추출물은 86%, 에탄올 추출물 50%의 지방축적을 보였다. DNJ 함량은 꾸지뽕잎의 에탄올 추출물에서 3921.3 ug/g로 높았고 rutin의 함량은 꾸지뽕잎의 물 추출물에서 4592.9 ug/g로 높게 나타냈다. 따라서 꾸지뽕잎 추출물에는 기능성 성분인 DNJ 함량과 rutin 함량이 다량 함유되어 있고 지방의 축적을 저해하는 효과가있어 비만과 대사관련 질환개선을 위한 기능성 소재로 활용될 수 있다고 생각한다.
- DNJ와 rutin 성분 모두 줄기보다 잎에서 다량으로 함유되었고 DNJ의 함량은 에탄올 추출물에서 ruthin의 함량은 물 추출물에서 상대적으로 많이 함유되어 있는 것이 특징이었다. DNJ 함량의 경우 잎과 줄기에서 처리구간에 유의적인 차이가 인정되었다. Rutin 함량의 경우 역시 잎과 줄기에서 처리구간에 유의적인 차이가 인정되었다.
- 과 같다. DNJ와 rutin 성분 모두 줄기보다 잎에서 다량으로 함유되었고 DNJ의 함량은 에탄올 추출물에서 ruthin의 함량은 물 추출물에서 상대적으로 많이 함유되어 있는 것이 특징이었다. DNJ 함량의 경우 잎과 줄기에서 처리구간에 유의적인 차이가 인정되었다.
- 꾸지뽕 분말과 물 및 에탄올 추출물의 미네랄 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 각 시료의 처리구에서 K 함량이 가장 높고 P, Ca, Na 순으로 높게 나타났으며 특히물 및 에탄올 추출물에서 Na, K 함량이 높았다. 무기질중 함량이 가장 높은 K의 경우 각 처리구간에 유의적인차이가 인정되었다.
- Rutrn 성분은 플라보놀 배당체의 하나로 모세혈관 강화작용과 수축작용을 나타내어순환계 질환 치료제, 고혈압 치료제, 보조인자 등의 주성분으로 사용되며(12) 항당뇨 효과가 있다고 보고되었다(13). 꾸지뽕잎 물 추출물의 rutin 함량도 4592.85 g로 측정 되어 함량이 매우 높다고 알려진 메밀종실의 rutin 함량 315 Ug/g (14) 보다 높은 것으로 나타나 기능성 식품 소재로서의 유용성과 가능성을 나타냈다.
- 농도 의존적으로 지방축적 이 감소하는 경향을 보였으며 5 mg/mL에서 86%로 지방축적이 가장적은 것을 관찰 하였다. 꾸지뽕잎 에탄올 추출물의 결과 Fig. 5에서 나타났듯이 농도 의존적이었으며 물 추출물보다 지방축적이 급격히 감소하여 5 mg/mL에서 50%의 지방축적을 나타냈다. 이는 포도씨 탈지박 추출물 200 ug/mL에서 11%의 지방축적을 보여준 Cho의 결과(18) 보다는 낮게 나타났지만, 2 mg/mL의 농도에서 지방축적 감소를 보인구기자(19)나 조릿대, 연근(20)과 비교해 정제되지 않은 식물초본 추출물로써는 높은 지방 축적 억제 능력을 나타냈다.
- 2-3과 같이 나타났다. 꾸지뽕잎의 물 및 70% 에탄올 추출물의 지방축적 Qipid accumulation)은 각각 61%, 21%로 측정되어 꾸지뽕잎 에탄올 추출물의 지방 축적에 대한 억제력이 물 추출물 보다 높았다. 지방축적 정도를 정확하게 알아보기 위하여 0.
- 4와 같다. 농도 의존적으로 지방축적 이 감소하는 경향을 보였으며 5 mg/mL에서 86%로 지방축적이 가장적은 것을 관찰 하였다. 꾸지뽕잎 에탄올 추출물의 결과 Fig.
- 5-5mg/mL의 농도일 때 물 및 에탄올 추출물 모두 세포의 생장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 세포에 대한 독성이 없다고 판단되었다. 동일한 농도로 3T3-L1 지방세포의 지방축적에 미치는 영향은 물 및 에탄올 추출물 모두 농도의존적으로 지방축적을 저해하는 것으로 나타났으며 추출물 농도가 5 mgftnL 일 때, 물 추출물은 86%, 에탄올 추출물 50%의 지방축적을 보였다. DNJ 함량은 꾸지뽕잎의 에탄올 추출물에서 3921.
- 92%로 가장 낮게 나타났고 에탄올 추출물에서 단백질함량이 1L15%로 가장 높았다. 물 추출물과 에탄올 추출물의 경우 수분 함량을 비교하면 유의적인 차이가 없었으나 꾸지뽕 원료분말과는 유의적인 차이가 인정되었다. 꾸지뽕 분말과 물 및 에탄올 추출물의 미네랄 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다.
- 측정한 결과는 Table 1과 같다. 수분 함량은 원료 분말 시료에서 2.92%로 가장 낮게 나타났고 에탄올 추출물에서 단백질함량이 1L15%로 가장 높았다. 물 추출물과 에탄올 추출물의 경우 수분 함량을 비교하면 유의적인 차이가 없었으나 꾸지뽕 원료분말과는 유의적인 차이가 인정되었다.
후속연구
- 9 ug/g로 높게 나타냈다. 따라서 꾸지뽕잎 추출물에는 기능성 성분인 DNJ 함량과 rutin 함량이 다량 함유되어 있고 지방의 축적을 저해하는 효과가있어 비만과 대사관련 질환개선을 위한 기능성 소재로 활용될 수 있다고 생각한다.
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