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문제 정의
- 본 연구는 초액의 정제정도에 따른 차이와 쑥과 자소엽을 추가하여 정제한 초액의 항산화 및 항아토피 활성을 확인하여 초액의 이용을 확대하는데 있다.
- 본 연구에서는 초액 4종인 2차 정제초액 (2nd refined liquid smoke, 2 CV), 3차 정제초액(3, rd refined chaff liquid smoke, 3 CV), 쑥 정제초액(Artemisia plus refined chaff liquid smoke, A CV)5 자소엽 정제 초액 (Perillae folium plus refined chaff liquid smoke, Pf CV)의 항산화 능력과 항 아토피 효과를 연구하였다. 항산화능 측정결과로 DPPH 활성은 3차 정제초액을 제외한 3종에서 높은 항산화 활성을 확인할 수 있었고, FRAP 실험 역시 DPPH와 마찬가지로 3종의초액에서 높은 활성을 보였다.
제안 방법
- CV), 쑥 정제초액。CV), 자소엽 정제초액(&CV)에 0.2 DPPH (Ll-Diphenyl-2-picTylhydmzyF^ 초액 추출물 4종과 DPPH solution을 1/20의 비율로 해서 실온에서 10분간 incubation한 후 517 mi (Victor3, Perkin Elmer)에서흡광도를 즉정하였다. 시료의 처리 농도는 1, 3, 10 iil/well (200 pl)로 처리하였다.
- DNFB를 이용하여 C57BL/6 마우스의 귀에 염증을 유도한 다음 초액을 처리하여 염증이 억제되는 정도를 관찰하였다. 염증을 유도한 군에서는 귀에 부종과 함께 윤기, 형태 등에 손상이 나타남을 알 수 있었으며, 이에 반해 2차 정제초액(2 CV), 3차 정제초액(3 CV), 쑥 정제초액(4 CV), 자소엽 정제초액(gfCV)을 처리한 군에서는 손상 정도가 육안으로 보기에 크게 감소한 것을 확인하였다(Rg.
- FRAP (Ferric reducing antioxidant power) assay를 이용 하역 tad&l을 어느 정도 환원시킬 수 있는지의 활성을 알아보았다. 실험을 위한 반응액으로는 acetate buffer (pH 3.
- 마우스 귀를 절취한 다음 10% formalin을 이용하여 고정하였으며, 수세, 탈수, 파라핀 고정 등을 거쳐 약 6~7 pm의 두께로 절편을 만늘었다. Hematoxyline (H), eosin (E)을 이용하여 HE 염색과정을 거쳐 현미경을 이용하여 관찰하였다(9).
- 2% DNFB를 마우스의 귀에 처리하여 알레르기를 유도하였다. 귀의 피부 표면에 염증반응이 일어난 것을 확인한 후 초액 4종 식염수(대조구)를 총 3회씩 5일간 20 mm를각각의 귀에 처리하였다. 마우스 귀를 절취한 다음 10% formalin을 이용하여 고정하였으며, 수세, 탈수, 파라핀 고정 등을 거쳐 약 6~7 pm의 두께로 절편을 만늘었다.
- 귀의 피부 표면에 염증반응이 일어난 것을 확인한 후 초액 4종 식염수(대조구)를 총 3회씩 5일간 20 mm를각각의 귀에 처리하였다. 마우스 귀를 절취한 다음 10% formalin을 이용하여 고정하였으며, 수세, 탈수, 파라핀 고정 등을 거쳐 약 6~7 pm의 두께로 절편을 만늘었다. Hematoxyline (H), eosin (E)을 이용하여 HE 염색과정을 거쳐 현미경을 이용하여 관찰하였다(9).
- 알레르기의 대표적인 실험방법은 chemical을 이용한 알레르기성 피부염모델이므로 이를 적용하였다. 면역반응 유도물질은 DNFB (dinitrofluorobenzene) 를 처리하여 마우스의 귀 부분에 염증반응을 유도한 다음, 2차 정제초액(2 CV), 3차 정제초액(3 CV), 쑥 정제초액(A CV), 자소엽 정제초액(&CV)을 처리히여 귀에서의 염증반응(inflammation)의 완화 정도를 확인하였다. 마우스는 샘 타코(주)에서 5주령의 Balb/c 수컷을 구입하여 사육장 내에서 약 일주일간 순화과정을 거쳤다.
- 1-10 iWwell (200 pl) 범위로 처리하였다. 반응액과 2차 정제초액(2 CV), 3차정제초액(3 CV), 쑥 정제초액(4 CV), 자소엽 정제초액(& CV)을 각각의 비율로 혼합한 후 10분간 상온에서 보관 후 590 nm에서 흡광도를 측정하였다(8).
- 2 DPPH (Ll-Diphenyl-2-picTylhydmzyF^ 초액 추출물 4종과 DPPH solution을 1/20의 비율로 해서 실온에서 10분간 incubation한 후 517 mi (Victor3, Perkin Elmer)에서흡광도를 즉정하였다. 시료의 처리 농도는 1, 3, 10 iil/well (200 pl)로 처리하였다. DPPH radical 소거활성 비율(% inhibition)은 아래와 같이 계산하였다(7).
- 시료의 항산화 활성 측정은 DPPH (l, bDiphenyl-2- piciylhydrazyl)> 이용한 radical 소거활성능 측정방법을 이용하였다 4종의 초액시료인 차 정제초액(2 CV), 3차 정제초액(3 CV), 쑥 정제초액。CV), 자소엽 정제초액(&CV)에 0.2 DPPH (Ll-Diphenyl-2-picTylhydmzyF^ 초액 추출물 4종과 DPPH solution을 1/20의 비율로 해서 실온에서 10분간 incubation한 후 517 mi (Victor3, Perkin Elmer)에서흡광도를 즉정하였다.
- 마우스는 샘 타코(주)에서 5주령의 Balb/c 수컷을 구입하여 사육장 내에서 약 일주일간 순화과정을 거쳤다. 실험 0일째 0.5% DNIB 50 ul를 복강에 감작한 후, 일주일 후 1일 간격으로 3회 0.2% DNFB를 마우스의 귀에 처리하여 알레르기를 유도하였다. 귀의 피부 표면에 염증반응이 일어난 것을 확인한 후 초액 4종 식염수(대조구)를 총 3회씩 5일간 20 mm를각각의 귀에 처리하였다.
- 실험에 사용된 귀 조직을 파라핀블럭을 만들어 슬라이드를 제작하여 HE (henratoxyline-asin) 염색을 이용하여 현미경으로 관찰하였다. DNFB를 이용하여 염증을 유도한 군은무처리군에 비해 귀의 두께가 현저히 증가한 것을 알 수 있었으며, 특히 귀상피의 두께가 크게 증가한 것을 알 수 있었다ug.
대상 데이터
- 면역반응 유도물질은 DNFB (dinitrofluorobenzene) 를 처리하여 마우스의 귀 부분에 염증반응을 유도한 다음, 2차 정제초액(2 CV), 3차 정제초액(3 CV), 쑥 정제초액(A CV), 자소엽 정제초액(&CV)을 처리히여 귀에서의 염증반응(inflammation)의 완화 정도를 확인하였다. 마우스는 샘 타코(주)에서 5주령의 Balb/c 수컷을 구입하여 사육장 내에서 약 일주일간 순화과정을 거쳤다. 실험 0일째 0.
- 본 실험에 이용된 4종의 왕겨초액은 대원GSI (WaeGwan, Korea)에서 제공 받은 것으로 각각 2차 정제초액(2nd refined liquid smoke, 2 CV), 3차 정제초액 (3rd refired liquid smoke, 3 CV), 쑥 정제초액(Artemisia plus refined liquid smoke, A CV), 자소엽 정제 초액 (Perillae plus refined liquid smoke, Pf (기이 다. 실험 에 사용된 초액시료는 1M NaOH를 이용하여 pH 7.
이론/모형
- 같이 실시하였다. 알레르기의 대표적인 실험방법은 chemical을 이용한 알레르기성 피부염모델이므로 이를 적용하였다. 면역반응 유도물질은 DNFB (dinitrofluorobenzene) 를 처리하여 마우스의 귀 부분에 염증반응을 유도한 다음, 2차 정제초액(2 CV), 3차 정제초액(3 CV), 쑥 정제초액(A CV), 자소엽 정제초액(&CV)을 처리히여 귀에서의 염증반응(inflammation)의 완화 정도를 확인하였다.
성능/효과
- DNFB를 이용하여 염증을 유도한 군은무처리군에 비해 귀의 두께가 현저히 증가한 것을 알 수 있었으며, 특히 귀상피의 두께가 크게 증가한 것을 알 수 있었다ug. 2B, Q. 반면 초액 4종을 처리한 군에서는 현미경 관찰 결과 귀의 두께와 상피의 두께가 현저히 감소된것을 확인하였다. DNFB를 처리하여 염증을 유도한 군에서는 귀의 두께 증가와 함께 면역세포의 침투가 일어난다.
- 시료의 농도에 따라 활성의 증가를 알 수 있었는데, 1~10 uL/weU 의 농도에 따라 약 2~18%의 횔성을 나타냄을 확인하였다. 2차 정제초액(2 CV)은 시료의 농도 1~3 u 1丿well의 농도에 따른 활성은 1 uWweU 처리한 경우 24%, 3 pL/well을 처리한 경우 71%, 10 yL/well을 처리한 경우 82%의 높은 활성을 나타내었다. 쑥 정제초액은 2차 정제초액과 마찬가지로 농도에 따라 활성을 증가함을 나타내었으며, 1 ul/well일 경우 27%, 3 ul/well에서는 61%, 10 unwell 에서는 82%의 활성을 나타내었다.
- 반면 초액류를 처리한 경우 크게 감소하는 것을 확인하였다. 2차 정제초액을 처리한 결과 약 234%, 쑥 초액을 처리한 경우 약 312%, 자소엽 초 액을 처리한 경우 약 23%, 3차 정제초액을 처리한 경우 약 239%로 증가 정도가 크게 감소함을 알 수 있었다. 귀의 두께 증가와 마찬가지로 자소엽 초액을 처리한 군에서 증가 정도가 가장 적게 나타남을 확인하였다.
- 3차 정제초액(3 CV)은 DPPH 실험에서의 결과와 마찬가지로 상대적으로 다른 시료에 비해 활성이 낮게 나오는 것을 확인하였다(Fig. IB). 정제초액(2 CV), 쑥 정제초액日 CV), 자소엽 정제초액(/CV)이 3차 정제초액(3 CV)에 비해 상대적으로 활성이 매우 높게 나타남을 확인하였다.
- 3차 정제초액(3 CV)은 DPPH 항산화 활성능이 다른 3종의 시료에 비해 가장 낮게 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 시료의 농도에 따라 활성의 증가를 알 수 있었는데, 1~10 uL/weU 의 농도에 따라 약 2~18%의 횔성을 나타냄을 확인하였다.
- 관찰하였다. DNFB를 이용하여 염증을 유도한 군은무처리군에 비해 귀의 두께가 현저히 증가한 것을 알 수 있었으며, 특히 귀상피의 두께가 크게 증가한 것을 알 수 있었다ug. 2B, Q.
- Jeong 등⑴은 대두유에 목초액을 첨가하였을 때 DPPH 실험의 항산화 활성을 확인하였으며, 목초액을 첨가하지 않은 대조구보다 목초액을 처리한 군에서 저장 기간 동안 TBA (2-thid)arbituric acid) 수치가 더 낮게 확인되어 지빙으] 산패 억제 효과를 나타내었다. Kim 등⑵은 왕겨초액, 목초액, 죽초액을 포함한 19종의 탄화초액 중 대부분 모두 높은 DPPH 및 지질과산화에 대한 억제활성을 확인하였다.
- 3종의 초액 모두 DPPH와 마찬가지로 비슷한 활성을 나타냄을 확인하였다. Kim ⑵등은 환원력 실험을 통해 죽초액과 목초액 시료의 대부분이 0.008% (v/v)의 낮은 농도에서도 높은 항산화 활성을 확인하였으며, 본 실험결과에 덧붙여 초액이 전반적으로 환원력에 의한 항산화 활성을 나타냄을확인하였디-.
- 억제 효과를 나타내었다. Kim 등⑵은 왕겨초액, 목초액, 죽초액을 포함한 19종의 탄화초액 중 대부분 모두 높은 DPPH 및 지질과산화에 대한 억제활성을 확인하였다. 특히 정제되지 않은 원액이 정제 탄화초액보다 높은 활성을 보인 것은 본 연구의 결과와 마찬가지로 정제 과정 중에 항산화 활성을 지니는 성분들이 손실됨을 알 수 있었다.
- 귀상피의 경우 두께와 마찬가지로 DNFB를 처리한 경우 두꺼워지는 양상을 보이는데, 아토피를 유도한 경우 약 785% 증가하는 것을 확인하였다. 반면 초액류를 처리한 경우 크게 감소하는 것을 확인하였다.
- 정제초액을 처리한 결과 약 158%, 쑥 초액을 처리한 경우 약 196%, 자소엽 초액을 처리한 경우 약 115%, 3차 정제초액을 처리한 경우 약 246% 증가하는데 그쳤다. 귀의 두께 증가 측정 결과 자소엽 초액이 귀의 두께 증가를 크게 감소시키는 것으로 나타났으며, 2차 정제초액, 쑥 초액, 3차 정제초액의 순으로 나타났다.
- 1A). 시료의 농도에 따라 활성의 증가를 알 수 있었는데, 1~10 uL/weU 의 농도에 따라 약 2~18%의 횔성을 나타냄을 확인하였다. 2차 정제초액(2 CV)은 시료의 농도 1~3 u 1丿well의 농도에 따른 활성은 1 uWweU 처리한 경우 24%, 3 pL/well을 처리한 경우 71%, 10 yL/well을 처리한 경우 82%의 높은 활성을 나타내었다.
- 2차 정제초액(2 CV)은 시료의 농도 1~3 u 1丿well의 농도에 따른 활성은 1 uWweU 처리한 경우 24%, 3 pL/well을 처리한 경우 71%, 10 yL/well을 처리한 경우 82%의 높은 활성을 나타내었다. 쑥 정제초액은 2차 정제초액과 마찬가지로 농도에 따라 활성을 증가함을 나타내었으며, 1 ul/well일 경우 27%, 3 ul/well에서는 61%, 10 unwell 에서는 82%의 활성을 나타내었다. 자소엽 정제초액은 1 UL/well일 경우 20%, 3 uL/well에서는 64%, 10 ul/well에서는 79%의 활성을 나타내었다.
- 아토피 동물모델에서 귀의 두께를 측정한 결과 염증을 유도한 경우 귀의 두께가 약 514% 증가함을 알 수 있었으며, 초액 4종을 처리한 결과 모든 시료이서 귀의 두께를 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 3). 정제초액을 처리한 결과 약 158%, 쑥 초액을 처리한 경우 약 196%, 자소엽 초액을 처리한 경우 약 115%, 3차 정제초액을 처리한 경우 약 246% 증가하는데 그쳤다.
- 염증을 유도한 군에서는 귀에 부종과 함께 윤기, 형태 등에 손상이 나타남을 알 수 있었으며, 이에 반해 2차 정제초액(2 CV), 3차 정제초액(3 CV), 쑥 정제초액(4 CV), 자소엽 정제초액(gfCV)을 처리한 군에서는 손상 정도가 육안으로 보기에 크게 감소한 것을 확인하였다(Rg. 2A). 육안으로 확인한 손상 정도는 2차 정제초액과 3차 정제왕겨초액을 처리한 군에 비해 쑥 초액과 자소엽 초액에서 처리한 시료 군에서 다소 손상 정도가 적게 나타남을 확인하였다.
- 2A). 육안으로 확인한 손상 정도는 2차 정제초액과 3차 정제왕겨초액을 처리한 군에 비해 쑥 초액과 자소엽 초액에서 처리한 시료 군에서 다소 손상 정도가 적게 나타남을 확인하였다.
- 쑥 정제초액은 2차 정제초액과 마찬가지로 농도에 따라 활성을 증가함을 나타내었으며, 1 ul/well일 경우 27%, 3 ul/well에서는 61%, 10 unwell 에서는 82%의 활성을 나타내었다. 자소엽 정제초액은 1 UL/well일 경우 20%, 3 uL/well에서는 64%, 10 ul/well에서는 79%의 활성을 나타내었다.
- IB). 정제초액(2 CV), 쑥 정제초액日 CV), 자소엽 정제초액(/CV)이 3차 정제초액(3 CV)에 비해 상대적으로 활성이 매우 높게 나타남을 확인하였다. 3종의 초액 모두 DPPH와 마찬가지로 비슷한 활성을 나타냄을 확인하였다.
- 3). 정제초액을 처리한 결과 약 158%, 쑥 초액을 처리한 경우 약 196%, 자소엽 초액을 처리한 경우 약 115%, 3차 정제초액을 처리한 경우 약 246% 증가하는데 그쳤다. 귀의 두께 증가 측정 결과 자소엽 초액이 귀의 두께 증가를 크게 감소시키는 것으로 나타났으며, 2차 정제초액, 쑥 초액, 3차 정제초액의 순으로 나타났다.
- 초액 4종(2차 정제초액, 3차 정제초액, 쑥 정제초액, 자소엽 정제초액)의 DPPH 활성 실험 결과 2차 정제초액(2 CV) 쑥 정제초액(0 CV), 자소엽 정제초액(&CV) 3종에서 높은 항산화 활성이 있음을 확인할 수 있었으며, 3차 정제초액(3 CV)에서는 상대적으로 활성이 낮게 나타나는 것을 확인하였다. 이는 2차 정제초액이 높은 항산화 활성을 보이는 것에 비해 정제과정을 거친 3차 정제초액은 활성이 감소되는것。로 사료된다
- Kim 등⑵은 왕겨초액, 목초액, 죽초액을 포함한 19종의 탄화초액 중 대부분 모두 높은 DPPH 및 지질과산화에 대한 억제활성을 확인하였다. 특히 정제되지 않은 원액이 정제 탄화초액보다 높은 활성을 보인 것은 본 연구의 결과와 마찬가지로 정제 과정 중에 항산화 활성을 지니는 성분들이 손실됨을 알 수 있었다.
- 효과를 연구하였다. 항산화능 측정결과로 DPPH 활성은 3차 정제초액을 제외한 3종에서 높은 항산화 활성을 확인할 수 있었고, FRAP 실험 역시 DPPH와 마찬가지로 3종의초액에서 높은 활성을 보였다. DNFB를 이용한 C57BL/6 마우스의 귀에 염증 유발을 통한 실험에서는 4가지 초액모두 높은 활성을 보였다* 특히 육안, 귀의 두께 및 귀의 상피 두께를 확인한 결과 자소엽 초액이 염증을 유도한 군에 비해 두께가 현저히 감소하여 가장 높은 활성을 보였다.
후속연구
- 7세포에서 염증 유발에 주요 분자인 일산화질소 억제 활성을 억제하는 것을 보고하였다. 반면에 높은 활성을 가지는 초액이 세포 독성이 높게 나타나므로 그에 대한 연구가 필요하다(2).
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