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문제 정의
- 본 연구에서는 시설재배지 토양으로부터 선충 포식성 곰팡이와 선충 표피성분인 collagen과 gelatin 분해능이 뛰어난 세균을 분리하여 살선충 활성을 분석하고, 분리 미생물들과 계피추출물과 혼용 시 살선충 효과를 확인하여 친환경 선충방제제의 개발 가능성에 대해 조사하였다.
제안 방법
- 5%, skim milk 1%, Difco) 배지 상에서 10-3~10-5의 농도로 희석평판하여 30℃에서 24 hr 배양하여 colony 주변에 투명환 형성균을 1차 선발하였다. 1차 선발된 균주를 NSKA 배지에 획선을 긋고 동일조건에서 배양하여 투명환 크기를 측정하여 단백질 분해능이 우수한 2차 균주를 선발하였다. 2차 선발된 균주를 이용하여 선충 표피 구성성분인 collagen과 알집의 구성성분인 gelatin 분해능이 우수한 균을 선발하기 위해 nutrient collagen agar (NCA: nutrient broth 0.
- 1차 선발된 균주를 NSKA 배지에 획선을 긋고 동일조건에서 배양하여 투명환 크기를 측정하여 단백질 분해능이 우수한 2차 균주를 선발하였다. 2차 선발된 균주를 이용하여 선충 표피 구성성분인 collagen과 알집의 구성성분인 gelatin 분해능이 우수한 균을 선발하기 위해 nutrient collagen agar (NCA: nutrient broth 0.8%, agar 1.5%, collagen 1%와 nutrient gelatin agar (NGA: nutrient broth 0.8%, agar 1.5%, gelatin type B 1%)을 이용해 2차 선발과 같은 방식으로 3차 균주를 선발하였다. Collagenase 생성균의 동정은 16S rDNA의 27F, 1492R을 primer로 PCR증폭하였으며, 염기서열을 NCBI/GENEBANK의 Blast 프로그램을 이용하여 비교하였다.
- 5%, gelatin type B 1%)을 이용해 2차 선발과 같은 방식으로 3차 균주를 선발하였다. Collagenase 생성균의 동정은 16S rDNA의 27F, 1492R을 primer로 PCR증폭하였으며, 염기서열을 NCBI/GENEBANK의 Blast 프로그램을 이용하여 비교하였다.
- 배지조건에 따른 선충포식곰팡이의 포식능을 평가하기 위해 분리한 곰팡이를 NB, PDB, YMB 배지에 접종하여 25℃, pH 6 조건에서 7일간 진탕배양 또는 정치배양 하였다. Micro well plate의 각 well당 선충 200마리를 넣은 후 각 배지별로 배양된 곰팡이를 100, 500, 1,000, 2,000, 5,000 mL L-1의 농도로 3반복 접종하여 24, 48, 72, 168시간 후의 살선충율을 측정하였다. 살선충율은 치사 선충수 / 전체 선충수 × 100 (%) 로 계산하였다.
- NSKA 배지 상에서 단백질 분해능이 우수한 10개 균주를 1차 선발하여 선충 표피 구성성분인 collagen과 알집의 구성성분인 gelatin 분해능이 우수한 균을 halozone 크기로 확인하였다 (Fig. 3). 이 중 gelatin과 collagen 기질 모두에 분해활성이 나타낸 C-5를 최종 선발하여 16s rDNA 염기서열을 비교한 결과 C-5 균주는 Pseudomonas putida와 99%의 상동성을 보였다.
- 2 μm membrane filter를 이용하여 여과하였다. 각 well당 선충 200마리를 넣은 후 상기 1항에서 처럼 배지 종류별로 배양된 곰팡이를 5,000 mL L-1의 농도로 접종한 후, 이어서 collagenase 생성균주의 배양 여과액을 0, 5,000, 10,000, 20,000 mL L-1 농도로 추가 접종하여 동일방법으로 시간에 따른 선충 포획율을 측정하였다.
- 계피 추출물의 살선충 활성 비교는 80% MeOH 계피추출물을 멸균수를 이용하여 10, 20, 50, 100, 500, 1000 mg L-1 농도로 희석하여 동일 방법으로 살선충 효과를 검토하였다.
- 계피추출물과 선충포식곰팡이 혼용 시의 살선충 효과 검증은 선충 포식곰팡이 배양액 5,000 mL L-1에 계피 조출물 10, 20, 50, 100 mg L-1을 첨가하여 동일방법으로 측정하였다.
- 곰팡이 Nema-1균주와 세균 C-5균주가 계피 추출물 100 mg L-1 이하의 농도에서 생존이 가능 한 것을 확인 한 후 계피추출물, 곰팡이와 세균을 혼합하여 농도와 시간에 따른 살선충 효과를 검토하였다. 계피추출물 50 mg L-1과 Nema-1 또는 C-5 각각 5,000 mL L-1 혼합처리구에서 살선충율은 24시간 경과 후 88%, 72시간 경과 후 89%, 168시간 경과 후 98%로 4-2항의 계피추출물과 Nema-1 처리구에 비해 다소 높았으나 큰 차이가 없었다 (Table 2).
- 배지조건에 따른 선충포식곰팡이의 포식능을 평가하기 위해 분리한 곰팡이를 NB, PDB, YMB 배지에 접종하여 25℃, pH 6 조건에서 7일간 진탕배양 또는 정치배양 하였다. Micro well plate의 각 well당 선충 200마리를 넣은 후 각 배지별로 배양된 곰팡이를 100, 500, 1,000, 2,000, 5,000 mL L-1의 농도로 3반복 접종하여 24, 48, 72, 168시간 후의 살선충율을 측정하였다.
- 복합미생물과 계피추출물 혼합처리구의 살선충효과 비교는 선충포식곰팡이 와 collagenase 생성균 배양액을 각각 5,000 mL L-1의 농도로 선충 200마리에 접종한 후, 추가로 계피 조추출물 10, 20, 50, 100 mg L-1 농도로 첨가하여 같은 방법으로 측정하였다. 이상의 활성비교를 위한 대조약제로는 선충탄 (Fosthiazate) 100, 250, 500, 1,000 mg L-1과 님오일 500, 1,000, 2,000 mL L-1을 사용하였다.
- 지금까지 뿌리혹선충 방제를 위하여 살선충 미생물과 식물추출물을 이용한 생물 방제제가 제품으로 출시되었지만, 유기합성 농약의 효과에 비해 상대적으로 효과가 적어 친환경 방제제로서의 활용도가 낮았다. 본 연구를 통해 보다 효과적인 생물학적 살선충제를 개발하기 위하여 국내 시설재배지 토양으로부터 선충포식성 곰팡이 Arthrobotrys thaumasia Nema-1을 분리하고, 살선충곰팡이의 포식기관에서는 선충을 포획하고 침입할 수 있도록 collagenase와 gelatinase등 다양한 protease를 생성하여 선충의 치사를 돕는다는 보고 (Tunlid et al., 1991)에 근거하여 collagen 분해균 Pseudomonas putida C-5와 살선충효과가 알려진 계피추출물의 혼용 시 살선충활성의 상승효과를 함께 비교하였다. 포식성곰팡이 Nema-1의 생육 및 살선충 활성은 YMB 배지에서 진탕배양 시 NB나 PDB 배지에서 정체배양 보다 높아 배지조건에 따라 영향이 있음을 확인 하였다.
- 첨가한 potato dextrose agar (PDA, Difco, USA) 배지를 이용하여 희석평판법에 의하여 곰팡이를 1차 순수분리 하였다. 분리균들의 살선충 활성 조사하기 위하여 96 well micro plate에 각 well당 선충 200마리를 넣은 후 1차 순수 분리된 곰팡이를 1,000 mL L-1의 농도로 접종하여 7일 후 살아있는 선충수를 계수하여 포식능력이 가장 우수한 곰팡이를 분리하였다. 분리한 선충 포식성 곰팡이의 동정은 18S rDNA의 ITS1, ITS4를 primer로 PCR 증폭한 후, ITS 부분의 PCR product의 염기서열을 NCBI/GENEBANK의 Blast 프로그램을 이용하여 계통학적인 특성을 비교하였다.
- 분리균들의 살선충 활성 조사하기 위하여 96 well micro plate에 각 well당 선충 200마리를 넣은 후 1차 순수 분리된 곰팡이를 1,000 mL L-1의 농도로 접종하여 7일 후 살아있는 선충수를 계수하여 포식능력이 가장 우수한 곰팡이를 분리하였다. 분리한 선충 포식성 곰팡이의 동정은 18S rDNA의 ITS1, ITS4를 primer로 PCR 증폭한 후, ITS 부분의 PCR product의 염기서열을 NCBI/GENEBANK의 Blast 프로그램을 이용하여 계통학적인 특성을 비교하였다.
- 선발된 총 10종의 collagenase 생성균주를 YMB (pH 6)배지에 접종하여 30℃에서 48시간 진탕배양 (150 rpm)한 후 선충 200마리가 있는 각 well에 세균 배양액을 5,000 mL L-1와 10,000 mL L-1 농도로 각각 첨가하여 상기 1항과 같이 시간에 따른 살선충 활성을 관찰하였다.
- 선충 동정은 Meloidogyne 종 (species)의 유충의 길이만으로 동정이 가능하다는 기 결과에 따라 (Taylor and Sasser, 1978) 광학현미경 ×160, ×250, ×400 배율로 유충의 전체 길이와 구침, 꼬리의 모양 등 형태적 관찰을 통하여 동정하였다.
- 선충 표피 및 알집 구성성분인 collagen과 gelatin 분해능이 우수한 P. putida C-5의 살선충 효과를 확인하기 위하여 YMB에서 48시간 배양한 배양액을 농도별 (5,000 mL L-1과 10,000 mL L-1) 로 선충에 접종하여 시간에 따른 살선충율을 조사하였다. 접종 후 72시간에는 5,000 mL L-1에서는 30%, 10,000 mL L-1에서는 40%의 살선충활성을 보였으나, 168시간 후에는 두 농도 간 차이가 없었다 (Fig.
- 선충포식곰팡이 Nema-1과 collagenase 생성균 C-5를 함께 처리했을 때의 살선충효과를 확인하였다. Nema-1 5,000 mL L-1만을 단독처리 시 72시간 경과후의 살선충율은 55%이 었지만, 동일 농도로 Nema-1과 C-5 혼합처리구는 65%, 또한 Nema-1 5,000 mL L-1와 C-5 10,000 mL L-1 혼합 처리구에서는 70%로 단독처리구 보다 혼합처리 시 약 10%이상의 살선충 상승효과를 나타냈다 (Fig.
- 선충포식곰팡이 배양을 위한 배지는 Difco사의 NB (Nutrient broth), PDB (Potato dextrose broth)와 YMB (Yeast malt broth)를 각각 이용하였고, 배지의 pH 6.0, 배양온도 25℃에서 진탕배양 (회전수 150 rpm) 또는 정치배양 하여 7일 후 균사량을 검정하였다. 균사량 측정은 배양액 500 mL를 Whatman filter paper No.
- 선충포식곰팡이와 collagenase 생성균을 함께 처리 했을 때의 살선충 효과를 검토하기 위하여 선발한 세균 배양여액을 멸균한 0.2 μm membrane filter를 이용하여 여과하였다.
- 농도로 첨가하여 같은 방법으로 측정하였다. 이상의 활성비교를 위한 대조약제로는 선충탄 (Fosthiazate) 100, 250, 500, 1,000 mg L-1과 님오일 500, 1,000, 2,000 mL L-1을 사용하였다.
대상 데이터
- 2010년 7월 경북 성주군 선남면 참외 농가와, 충남 공주군 우성면 토마토 농가 중 뿌리혹선충 피해가 극심한 하우스 10개동에서 각 4주씩 기주식물과 토양을 직경 20 cm, 높이 30 cm인 포트에 옮겨와서 실험에 이용하였다. 선충 분리는 Bearmann의 깔때기법을 이용하였고 (Viglierchio and Schmitt, 1983), 2령 유충을 실험에 사용하였다.
- Collagen 분해균은 2009년 5월~2010년 7월까지 전국 20지역으로부터 500 여개의 근권토양 시료를 채집하여 nutrient skim milk agar (NSKA: nutrient broth 0.8%, agar 1.5%, skim milk 1%, Difco) 배지 상에서 10-3~10-5의 농도로 희석평판하여 30℃에서 24 hr 배양하여 colony 주변에 투명환 형성균을 1차 선발하였다. 1차 선발된 균주를 NSKA 배지에 획선을 긋고 동일조건에서 배양하여 투명환 크기를 측정하여 단백질 분해능이 우수한 2차 균주를 선발하였다.
- 공시 시료로 녹나무과 육계피 (Cinnamomum cassia, China)분말 50 g을 80% MeOH (v/v) 200 mL에 넣어 24시간 암실에서 추출한 후 추출액을 40℃에서 감압농축 (Büchi, Rotavapor R-200, swiss)하여 계피조추출물 5 g을 얻었다.
- 친환경 선충 방제제 개발을 위해 경북 성주군 선남면 및 충남 공주시 우성면의 시설원예 재배지 토양으로 부터 선충 포식성이 뛰어난 곰팡이 Arthrobotrys thaumasia Nema-1과 선충 표피성분인 collagen과 알집 주성분인 gelatin 분해능이 뛰어난 Pseudomonas putida C-5를 분리 하였다. 이들 분리균의 선충치사 효과를 검토한 결과, A.
이론/모형
- 2010년 7월 경북 성주군 선남면 참외 농가와, 충남 공주군 우성면 토마토 농가 중 뿌리혹선충 피해가 극심한 하우스 10개동에서 각 4주씩 기주식물과 토양을 직경 20 cm, 높이 30 cm인 포트에 옮겨와서 실험에 이용하였다. 선충 분리는 Bearmann의 깔때기법을 이용하였고 (Viglierchio and Schmitt, 1983), 2령 유충을 실험에 사용하였다. 선충 동정은 Meloidogyne 종 (species)의 유충의 길이만으로 동정이 가능하다는 기 결과에 따라 (Taylor and Sasser, 1978) 광학현미경 ×160, ×250, ×400 배율로 유충의 전체 길이와 구침, 꼬리의 모양 등 형태적 관찰을 통하여 동정하였다.
- 선충포식 곰팡이를 순수분리하기 위하여 채집한 토양시료를 10-1~10-3 농도로 희석하여 항생제 streptomycin sulfate salt (Sigma-Aldrich, USA) 100 mg L-1 첨가한 potato dextrose agar (PDA, Difco, USA) 배지를 이용하여 희석평판법에 의하여 곰팡이를 1차 순수분리 하였다. 분리균들의 살선충 활성 조사하기 위하여 96 well micro plate에 각 well당 선충 200마리를 넣은 후 1차 순수 분리된 곰팡이를 1,000 mL L-1의 농도로 접종하여 7일 후 살아있는 선충수를 계수하여 포식능력이 가장 우수한 곰팡이를 분리하였다.
성능/효과
- A. thaumasia Nema-1의 최적배지인 YMB 배지에서 배양방법에 따른 배양액의 농도별 살선충활성을 비교한 결과, 5,000 mL L-1 농도에서 정치배양액은 45%, 진탕배양액은 55%의 활성 차이를 보였다 (Fig. 4). 또한 동일배지에서 배양시간별 진탕배양액의 살선충 활성은 500 mL L-1 이하의 농도에서는 배양 168시간 까지 20%이하의 낮은 수준이었지만, 1,000 mL L-1의 농도로 접종된 처리구에서 24시간 경과 후에는 살선충율이 20% 정도에서 72시간 경과후에는 45%, 168시간 경과 후에는 85%까지 상승하는 결과를 보였다 (Fig.
- A. thaumasia Nema-1의 형태적 특징은 균사의 지름은 2~8 μm이고, 총맥은 양털모양이며 색깔은 흰색이었다 (Fig. 2a).
- 선충포식곰팡이 Nema-1과 collagenase 생성균 C-5를 함께 처리했을 때의 살선충효과를 확인하였다. Nema-1 5,000 mL L-1만을 단독처리 시 72시간 경과후의 살선충율은 55%이 었지만, 동일 농도로 Nema-1과 C-5 혼합처리구는 65%, 또한 Nema-1 5,000 mL L-1와 C-5 10,000 mL L-1 혼합 처리구에서는 70%로 단독처리구 보다 혼합처리 시 약 10%이상의 살선충 상승효과를 나타냈다 (Fig. 7). 이는 C-5균주가 생성하는 단백질분해 효소가 선충 표피를 일부 분해하여 균사의 선충 내 침입을 도와주는 결과로 생각된다.
- 계피 추출물 중 cinnamic aldehyde 또는 cinnmic acid 성분의 살선충 활성이 보고 되어 있어 (Chanh, 2010), 80% MeOH 추출물의 농도별 살선충 활성을 실험한 결과, 접종 72시간 경과 후 20 mg L-1 이하의 농도 처리구에서는 12% 이하의 낮은 선충치사 효과를 보였으나, 50 mg L-1 처리구는 86%, 100 mg L-1 처리구는 100%의 강한 살선충 활성을 나타냄으로서 미생물과 혼용 시 살선충 효과를 증진시킬 수 있는 식물추출물로 판단되었다 (Table 2).
- 이하의 농도에서 생존이 가능 한 것을 확인 한 후 계피추출물, 곰팡이와 세균을 혼합하여 농도와 시간에 따른 살선충 효과를 검토하였다. 계피추출물 50 mg L-1과 Nema-1 또는 C-5 각각 5,000 mL L-1 혼합처리구에서 살선충율은 24시간 경과 후 88%, 72시간 경과 후 89%, 168시간 경과 후 98%로 4-2항의 계피추출물과 Nema-1 처리구에 비해 다소 높았으나 큰 차이가 없었다 (Table 2). 이상의 계피추출물은 물론 미생물들과 혼용처리 한 결과는 대조약제로 사용한 대표적 유기합성 살선충제인 선충탄 (Fosthiazate) 50 mg L-1의 72시간 경과 후 살선충율 17%, 친환경성분인 님오일 2,000 mL L-1의 57% 보다 높은 약 89% 이상의 살선충 활성을 나타냄으로서 효과적인 생물학적 방제제로의 가능성을 제시하였다 (Table 2.
- , 1991), 선충포식곰팡이는 균사에서 생성되는 끈끈이 봉 및 끈끈이 그물을 이용하여 선충을 포식하기 때문에 균사 생장이 살선충 활성에 큰 영향을 미친다. 따라서 Nema-1에 의한 살선충효과는 균사생장을 위해 적어도 3일 이상의 배양기간이 요구된다는 결과를 나타내었다.
- 선충포식곰팡이를 이용한 선충방제법의 가장 큰 단점은 곰팡이의 균사 성장 속도가 늦기 때문에 적어도 76시간 경과 후에나 방제효과를 나타낼 수 있다. 따라서 초기의 방제 효율을 높여주는 물질의 첨가가 필요하므로 살선충활성이 높은 계피 추출물을 적용하면 선충포식곰팡이의 단점을 보완해줄 수 있으리라 기대되어 Nema-1 배양액 5,000 mL L-1와 계피 추출물 50 mg L-1 혼합 처리 시의 살선충효과를 비교한 결과, 살선충율은 24시간 경과 후에는 86%, 72시간 경과 후는 88%, 168시간 경과 후는 96%로 Nema-l 단독처리구보다 약 10% 이상 살선충효과를 높여주었다 (Table 2).
- 4). 또한 동일배지에서 배양시간별 진탕배양액의 살선충 활성은 500 mL L-1 이하의 농도에서는 배양 168시간 까지 20%이하의 낮은 수준이었지만, 1,000 mL L-1의 농도로 접종된 처리구에서 24시간 경과 후에는 살선충율이 20% 정도에서 72시간 경과후에는 45%, 168시간 경과 후에는 85%까지 상승하는 결과를 보였다 (Fig. 5). 이 결과는 선충포식곰팡이의 진탕배양 시 균사 말단에서 생성되는 protease와 같은 2차 대산산물의 생성이 촉진되어 균사의 선충 내 침입이 용이해지기 때문이라 여겨지며 (Tunlid et al.
- 의 성장특성은 온도 25℃, pH 6에서 최적조건으로 알려져 있어 (Lee, 2003) 동일조건에서 Nema-1의 배지종류별 성장 특성을 비교한 결과, YMB에서 배양 7일 이후 건조중량이 PDB 보다는 약 6%, NB 배양체에 비해서는 약 10% 수준으로 증가함을 보였다. 또한 배양방식의 경우 배양 7일 후 까지 정치배양보다 진탕배양 시 배양체 건조중량이 약 2% 높은 결과를 보였다 (Table 1).
- 분리균에 의한 살선충효과는 Nema-1 단용 미생물로 사용하는 것보다 C-5균주를 혼합 사용 시 활성이 증진되는 결과를 보였는데 이는 C-5에 의해 생성된 collagenase 및 gelatinase가 선충포식성 곰팡이 Nema-1의 선충내 침투력을 향상시킨 결과로 요인으로 보여진다. 또한 살선충효과가 우수하다고 알려진 계피 추출물을 첨가한 Nema-1과 C-5 혼합물을 사용 시에는 처리 후 24시간 이후 부터 85% 이상의 선충치사 효과를 보임으로서 미생물과 식물추출물을 함께 사용하는 복합제제 형태가 생물학적 선충방제로서 더 효과적일 수 있다는 가능성을 제시하였다. 현재 이들 곰팡이 Nema-1균주와 세균 C-5균주, 계피 추출물을 이용한 뿌리혹선충 감수성 토마토 품종을 이용하여 포트실험 및 포장실험을 진행하고 있으며, 차후 선발된 Arthrobotrys thaumasia Nema-1의 선충포식능에 관한 추가실험과 단백질 분해능이 우수한 Pseudomonas putida C-5균주에서 collagenase를 분리, 정제와 분리된 효소의 대량생산을 위해 유전자 복제 기술을 이용한 gene cloning 실험을 계획하고 있다.
- putida C-5 세균 배양액 각각 5,000 mL L-1 혼합 처리구에서는 65%로 상승하였다. 또한 선충치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 50 mg L-1을 5,000 mL L-1의 Nema-1과 C-5 배양액과 혼합하여 처리하였을 때 72시간 경과 후의 치사율은 89%로 상승되었으며, 대표적 살선충제인 선충탄 (Fosthiazate) 50 mg L-1의 방제가 17%와 님오일 2,000 mL L-1의 방제가 57% 보다 훨씬 높은 수준이었다. 이상의 결과는 생물학적 선충방제제는 미생물 또는 식물체 추출물 단제 보다는 혼합물 형태로 사용하는 것이 더 효과적이라는 결과를 제시하였다.
- 6). 배지성분이 선충의 치사에 영향을 미치는지를 확인한 결과 YMB 10,000 mL L-1에서 약 20%의 치사효과를 나타냄으로서 실제 C-5에 의한 살선충 효과는 20% 정도임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Nema-1 곰팡이 처리구에 비교해 C-5가 상대적으로 낮은 살선충 활성을 보여줌으로서 C-5 세균 배양액에 의한 살선충 효과를 증진시키기 위해서는 식물추출물이나 곰팡이를 함께 이용하는 방법에 관한 실험이 필요하다고 판단되었다.
- 분리균 C-5의 생육은 Nema-1과 같이 YMB배지에서 가장 생육이 우수하였으며 48시간 배양시의 생균수는 2.0×106 cfu mL-1 수준이었다 (data not shown).
- 포식성곰팡이 Nema-1의 생육 및 살선충 활성은 YMB 배지에서 진탕배양 시 NB나 PDB 배지에서 정체배양 보다 높아 배지조건에 따라 영향이 있음을 확인 하였다. 분리균에 의한 살선충효과는 Nema-1 단용 미생물로 사용하는 것보다 C-5균주를 혼합 사용 시 활성이 증진되는 결과를 보였는데 이는 C-5에 의해 생성된 collagenase 및 gelatinase가 선충포식성 곰팡이 Nema-1의 선충내 침투력을 향상시킨 결과로 요인으로 보여진다. 또한 살선충효과가 우수하다고 알려진 계피 추출물을 첨가한 Nema-1과 C-5 혼합물을 사용 시에는 처리 후 24시간 이후 부터 85% 이상의 선충치사 효과를 보임으로서 미생물과 식물추출물을 함께 사용하는 복합제제 형태가 생물학적 선충방제로서 더 효과적일 수 있다는 가능성을 제시하였다.
- 3). 이 중 gelatin과 collagen 기질 모두에 분해활성이 나타낸 C-5를 최종 선발하여 16s rDNA 염기서열을 비교한 결과 C-5 균주는 Pseudomonas putida와 99%의 상동성을 보였다. 분리균 C-5의 생육은 Nema-1과 같이 YMB배지에서 가장 생육이 우수하였으며 48시간 배양시의 생균수는 2.
- 친환경 선충 방제제 개발을 위해 경북 성주군 선남면 및 충남 공주시 우성면의 시설원예 재배지 토양으로 부터 선충 포식성이 뛰어난 곰팡이 Arthrobotrys thaumasia Nema-1과 선충 표피성분인 collagen과 알집 주성분인 gelatin 분해능이 뛰어난 Pseudomonas putida C-5를 분리 하였다. 이들 분리균의 선충치사 효과를 검토한 결과, A. thaumasia Nema-1곰팡이 배양액 5,000 mL L-1을 처리 시 방제효과는 72시간 후에 55%이었으나, 포식성 곰팡이 Nema-1과 P. putida C-5 세균 배양액 각각 5,000 mL L-1 혼합 처리구에서는 65%로 상승하였다. 또한 선충치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 50 mg L-1을 5,000 mL L-1의 Nema-1과 C-5 배양액과 혼합하여 처리하였을 때 72시간 경과 후의 치사율은 89%로 상승되었으며, 대표적 살선충제인 선충탄 (Fosthiazate) 50 mg L-1의 방제가 17%와 님오일 2,000 mL L-1의 방제가 57% 보다 훨씬 높은 수준이었다.
- 또한 선충치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 50 mg L-1을 5,000 mL L-1의 Nema-1과 C-5 배양액과 혼합하여 처리하였을 때 72시간 경과 후의 치사율은 89%로 상승되었으며, 대표적 살선충제인 선충탄 (Fosthiazate) 50 mg L-1의 방제가 17%와 님오일 2,000 mL L-1의 방제가 57% 보다 훨씬 높은 수준이었다. 이상의 결과는 생물학적 선충방제제는 미생물 또는 식물체 추출물 단제 보다는 혼합물 형태로 사용하는 것이 더 효과적이라는 결과를 제시하였다.
- 계피추출물 50 mg L-1과 Nema-1 또는 C-5 각각 5,000 mL L-1 혼합처리구에서 살선충율은 24시간 경과 후 88%, 72시간 경과 후 89%, 168시간 경과 후 98%로 4-2항의 계피추출물과 Nema-1 처리구에 비해 다소 높았으나 큰 차이가 없었다 (Table 2). 이상의 계피추출물은 물론 미생물들과 혼용처리 한 결과는 대조약제로 사용한 대표적 유기합성 살선충제인 선충탄 (Fosthiazate) 50 mg L-1의 72시간 경과 후 살선충율 17%, 친환경성분인 님오일 2,000 mL L-1의 57% 보다 높은 약 89% 이상의 살선충 활성을 나타냄으로서 효과적인 생물학적 방제제로의 가능성을 제시하였다 (Table 2.).
- , 1991)에 근거하여 collagen 분해균 Pseudomonas putida C-5와 살선충효과가 알려진 계피추출물의 혼용 시 살선충활성의 상승효과를 함께 비교하였다. 포식성곰팡이 Nema-1의 생육 및 살선충 활성은 YMB 배지에서 진탕배양 시 NB나 PDB 배지에서 정체배양 보다 높아 배지조건에 따라 영향이 있음을 확인 하였다. 분리균에 의한 살선충효과는 Nema-1 단용 미생물로 사용하는 것보다 C-5균주를 혼합 사용 시 활성이 증진되는 결과를 보였는데 이는 C-5에 의해 생성된 collagenase 및 gelatinase가 선충포식성 곰팡이 Nema-1의 선충내 침투력을 향상시킨 결과로 요인으로 보여진다.
- 항생제를 첨가한 PDA배지에서 20균주를 순수분리한 후 96 well plate에서 선충포식능력이 가장 우수한 곰팡이 Nema-1을 선발하여 18S rDNA의 ITS1과 ITS4 염기서열을 비교한 결과, Arthrobotrys thaumasia와 98%의 상동성을 보여 Arthrobotrys thaumasia Nema-1으로 동정되었다. A.
후속연구
- 배지성분이 선충의 치사에 영향을 미치는지를 확인한 결과 YMB 10,000 mL L-1에서 약 20%의 치사효과를 나타냄으로서 실제 C-5에 의한 살선충 효과는 20% 정도임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Nema-1 곰팡이 처리구에 비교해 C-5가 상대적으로 낮은 살선충 활성을 보여줌으로서 C-5 세균 배양액에 의한 살선충 효과를 증진시키기 위해서는 식물추출물이나 곰팡이를 함께 이용하는 방법에 관한 실험이 필요하다고 판단되었다.
- 또한 살선충효과가 우수하다고 알려진 계피 추출물을 첨가한 Nema-1과 C-5 혼합물을 사용 시에는 처리 후 24시간 이후 부터 85% 이상의 선충치사 효과를 보임으로서 미생물과 식물추출물을 함께 사용하는 복합제제 형태가 생물학적 선충방제로서 더 효과적일 수 있다는 가능성을 제시하였다. 현재 이들 곰팡이 Nema-1균주와 세균 C-5균주, 계피 추출물을 이용한 뿌리혹선충 감수성 토마토 품종을 이용하여 포트실험 및 포장실험을 진행하고 있으며, 차후 선발된 Arthrobotrys thaumasia Nema-1의 선충포식능에 관한 추가실험과 단백질 분해능이 우수한 Pseudomonas putida C-5균주에서 collagenase를 분리, 정제와 분리된 효소의 대량생산을 위해 유전자 복제 기술을 이용한 gene cloning 실험을 계획하고 있다.
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