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문제 정의
- 2002). 본 review에서는 현재까지 알려진 각각의 type별로 AFP의 삼차 구조를 소개하고 밝혀진 삼차 구조 정보로 부터 새롭게 규명된 AFP의 얼음결합기작을 소개하고자 한다.
제안 방법
- 최근 일본 연구그룹에서는서로 다른 두가지 호냉성 곰팡이류(Typhula ishikariensis와 Antarctomyces psychrotrophicus)에서 새로운 AFP를 분리해 내고 두 AFP의 활성 및 생화학적인 특성을 비교하였다. Antarctomyces psychrotrophicus로부터의 AFP는(AnpAFP) 약 28 kDa의 분자량을 가지며 glycosylation에 의해 translation modification이 되어 있다는 사실을 glycosidase에 의해 glycosylation 된 당을 제거함으로써 생기는 size 변화를 통해 규명하였다. 두 AFP모두 bipyramidal 형태의 얼음결정을 유도하지만 AnpAFP는 type I-III AFP와 유사한 antifreeze activity를 가지는 반면에 Typhula ishikariensis AFP(TisAFP)는 insect AFP와 유사하게 hyperactive antifreeze activity를 가진다.
- 2006). apolipoprotein A-I 단백질의 경우와 비슷하게 Type IV LS-12 AFP도 얼음 결합에 의해 구조 변화를 가질 것으로 가설을 세우고 homology modeling을 통해 Type IV LS-12 AFP의 두 가지 conformation(open conformation and closed conformation) 의 모델 구조를 만들고 얼음결합 예상 부위를 모델 구조로 부터 예측하였다(Fig. 4).
- 2004). 그리고 최근 2008년 Biochemical Journal에 발표된 결과에 의하면 남극의 Marinomonas primoryensis 균 유래의 hyperactive calcium dependent AFP(MpAFP)를 클로닝하고 재조합 단백질을 정제하였고 더 나아가 삼차 구조 모델링을 시도하였다. 이 단백질의 Antifreeze activity를 가지는 322 아미노산 부위는 19개의 아미노산들의 반복으로 이루어져 있는데, XGTGND motif를 가진다.
- 뿐만 아니라 이 논문에서는 Calcium이 결합된 alkaline protease의 β-roll 구조를 template로 한 homology modeling을 통해 MpAFP의 삼차 구조 모델을 만들었다.
성능/효과
- Ca2+ 의존형 herring Type II AFP(hAFP) 구조와 Ca2+ 비의존형 longsnout poacher(Brachyosis rostratus) Type II AFP(lpAFP) 구조의 Ca2+ 결합부위 구조를 비교해 보면 hAFP의 Ca2+ 결합에 중요한 아미노산 잔기들이(Gln92, Asp94, Glu99 그리고 Asn113) lpAFP는 다른 잔기(Lys95, Asn97, Asp102 그리고 Asp116)에 의해 대체되어 있는 것을 알 수 있다(Fig. 2b).
- 특히 Thr-X-Thr(X 위치에는 다른 모든 아미노산이 위치 가능) 아미노산이 얼음결합에 직접적으로 관여한다고 알려졌다. CfAFP의 구조와 얼음 결정과의 결합구조 모델링을 통해 Thr의 OH group이 얼음결정의 lattice와 공간적으로 잘 맞추어진다는 사실을 규명하였다. 이를 “ice lattice occupation” model이라고 부른다.
- hAFP와 C-type lectin 단백질의 또 다른 차이점은 hAFP는 5개의 disulfide bond를 가지지만 C-type lectin 단백질은 3개 혹은 4개의 disulfide bond를 가진다는 것이다. hAFP의 구조 정보를 기반으로 얼음 결합 부위로 예상되는 아미노산의 돌연변이 단백질을 제작하여 TH 값을 측정한 결과 Thr96, Leu97, Thr98, 그리고 Thr115 잔기가 얼음 결합에 중요하다는 사실을 알게 되었다. 재미있는 것은 이 잔기들 모두가 Ca2+ 결합 부위 근처에 위치하고 있다는 사실이다.
- 2a). 구조 연구의 결과로부터 Type II AFP가 아미노산 서열에 있어서는 유사점이 낮지만(sequence identity 20%) 삼차 구조적으로는 칼슘농도에 의존해서 당에 결합하는 단백질의 모듈로써 알려져 있는 C-type lectin 단백질과 유사하다는 사실을 규명하였다. 이와 같은 사실은 Type II AFP가 sugar binding lectin 단백질의 삼차구조 골격을 이용해서 진화되었음을 나타내고 있다(Fig.
- 예상 얼음결합 부위의 가운데에 위치하는 Ala16 아미노산을 더 큰 side chain을 가지는 다른 아미노산으로 치환을 했을 때도 steric hindrance 때문에 얼음결합이 저해되는 것을 확인하였다. 그리고 Asn14를 짧은 길이의 Ser으로 치환된 돌연변이를 만들었을 때에도 얼음 결합 능력이 현저히 떨어지는 것을 관찰하였다. 이 결과들은 예측한 얼음 결합 부위 아미노산(Gln9, Asn14, Ala16, Thr18 and Gln44)들이 실제로 얼음 결합에 중요한 역할을 한다는 사실을 뒷받침하고 있다(Jia et al.
- 그리고 analytical ultracentrifugation과 모델링 결과에 의하면 hyperactive Type I AFP는 짧은 kinked loop으로 이어진 두개의 α-helix로 이루어져 있으며 alanine rich region에 의한 side-by-side dimer를 이루는 것으로 예측된다. 그리고 Type I AFP가 얼음결정의 C축에 결합하여 전형적인 hexagonal bipyramidal 모양의 얼음 결정을 만드는 것과 달리 hyperactive Type I AFP는 lemon 형태의 다른 모양의 얼음 결정을 만드는 것으로 알려졌다. 이는 hyperactive Type I AFP의 얼음 결정과의 결합부위가 Type I AFP와는 달리 얼음결정의 여러 면에 결합하여 더 효과적으로 얼음결정의 성장을 억제하는 것으로 생각된다(Patel and Graether 2010).
- 삼차 구조 모델링 결과에 의하면 이 단백질은 곤충에서 발견되어지는 Insect AFP와 유사하게 전체적으로 left-handed β-helix 구조를 가질 것으로 예상된다.
- X 위치에는 주로 alanine 또는 glycine이 위치하고 굵은 글씨의 Thr과 Asn이 얼음결정과의 직접적인 상호 작용에 중요하다고 예측된다. 실험적으로 이 두 아미노산을 Tyr으로 치환된 돌연변이체를 만들어서 TH 활성을 비교했을 때 wid-type MpAFP 보다 현저히 낮은 활성을 나타내는 것을 관찰하였다. 이 단백질은 RTX (repeats-in-toxin) family 단백질과 아미노산 서열 유사성을 가지는데, RTX family 단백질들은 Gram-negative gammaproteobacteria에서 발견되는 secreted virulence factor 들이다.
- Type III AFP와 얼음 결정의 결합 기작에 대한 여러 가지 가설이 있지만 가장 널리 믿어지는 가설은 Type III AFP의 납작한 형태의 Thr18 잔기가 위치한 부위가 얼음 결정의 prism plane에 딱맞게 결합하여 다른 물 분자의 접근을 막아 얼음결정의 성장을 방해한다는 것이다. 얼음결합부위로 예측되어진 주위의 아미노산들을(Gln9, Asn14, Ala16, Thr18 and Gln44) 다른 성질의 아미노산들로 치환하였을 때 현저하게 낮아진 TH 값과 달라진 얼음 결정 모양을 관찰할 수 있었다. 특히 Thr18을 Asn으로 바꾼 돌연 변이 단백질은 천연형 단백질에 비해 약 10%의 TH 값을 보였다.
- 특히 Thr18을 Asn으로 바꾼 돌연 변이 단백질은 천연형 단백질에 비해 약 10%의 TH 값을 보였다. 예상 얼음결합 부위의 가운데에 위치하는 Ala16 아미노산을 더 큰 side chain을 가지는 다른 아미노산으로 치환을 했을 때도 steric hindrance 때문에 얼음결합이 저해되는 것을 확인하였다. 그리고 Asn14를 짧은 길이의 Ser으로 치환된 돌연변이를 만들었을 때에도 얼음 결합 능력이 현저히 떨어지는 것을 관찰하였다.
- 1998년 Science지에 발표된 결과에 의하면 당근으로 부터 새로운 plant AFP를 찾아서 그 cDNA를 담배 식물에 발현시켜 형질 전환된 저온 저항성 담배 식물을 제조하였다. 형질 전환된 담배 식물로 부터의 추출물은 발현된 당근의 AFP를 가지고 있고 RI와 TH 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이 결과는 다른 작물에도 plant AFP의 유전자를 도입하여 추운 환경에서도 작물이 잘 자랄 수 있는 형질 전환된 식물을 만들 수 있다는 가능성을 제시한다 (Worrall et al.
후속연구
- 하지만 다양한 생물체들로 부터 AFP들이 새롭게 발견되어 지고 이들의 type을 결정하는데 에는 기존의 grouping에 한계가 있다. 따라서 이 들의 정확한 grouping 및 분자수준에서의 작용 기작을 설명하기 위해서는 AFP에 대한 더 많은 구조적인 연구가 필요하다. 뿐만 아니라, AFP의 구조분석은 AFP 가 어떤 단백질로 부터 진화되어 왔는지를 밝히는데 유용하고 더 나아가 고해상도 삼차 구조 정보는 Antifreeze activity가 향상된 기능개선형 AFP의 제작과 이를 이용한 산업화에 도움을 줄 수 있다.
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