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문제 정의
- 11,12) 이에 수반하는 연구의 일환으로 본 연구에서는 우선 18β-GA의 암세포에 대한 효능을 조사하였다.
- 본 실험에서는 일차적으로 18β-GA의 A549에 대한 세포독성 효과를 검색하였다.
- 본 연구에서는 이와 같은 목적을 염두에 두고 약물접촉시간의 효과를 조사하였는데, 이미 언급하였듯이 약물 접촉연장이 암세포의 살해효과를 증진하므로 이를 바탕으로 하여 18β-GA를 포집한 리포솜제형에 대한 효과를 연구조사 중에 있다.
- 이에 본 연구에서는 A549(human lung adenocarcinoma) 암세포를 nude mice에 접종하는 소위 이종이식(xenograft transfer) 방법으로 생쥐의 생체에서 형성된 종양에 대한 18β-GA의 항암효과를 검색하였다.
제안 방법
- 실험조작 과정은 다음과 같다. 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 RPMI 1640 배지에 배양한 A549 암세포를 수집해서 serumfree RPMI로 세척하고, 이어서 DPBS로 2번 더 세척하였다. Trypan blue exclusion 방법으로 세포생존율이 90% 이상임을 확인하고, 8주령의 암컷 nude mice(Balb/c nu/nu)의 복부 측면 (lateral abdomen) 부위에 A549 암세포를(3×106 cells/200 µl/ mouse) 피하로 주사하였다(Day 0).
- 18β-GA 치료는 3일 간격으로 총 4회 투여하였다(Day 1, 4, 7, 10).
- 18β-GA의 A549 암세포에 대한 세포독성효과를 비교하기 위해서 임상에 사용되는 기존의 항암제인 doxorubicin을 선택하여 그 효과를 비교하였다.
- 18β-GA의 동물모델에서 항종양효과를 확인하기 위하여, 암컷 nude mice(Balb/c nu/nu)에 A549 암세포를 피하로 주사한 후, 18β-GA(1 mg/time/mouse) 또는 doxorubicin(50 µg/time/ mouse)을 복강으로 3일 간격으로 총 4회 투여한 다음에 종양의 크기를 음성대조군의 생쥐그룹에서 형성된 종양의 크기와 비교 하였다.
- 22) 종양의 크기는 caliper(Mitutoyo, Japan)를 사용하여 길이(Length, L)와 너비(Width, W)를 3일에 한 번씩 측정하였고, 종양의 부피(mm3)는 L×W2/2으로 계산하여 각 실험군 별로 평균을 내었다.
- A549에 대한 18β-GA의 효과는 음성대조군(18β-GA로 처리되지 않은 A549)의 흡광도를 100%로 기준하여 상대적인 세포생존율(%)로 평가하였다.
- Trypan blue exclusion 방법으로 세포생존율이 90% 이상임을 확인하고, 8주령의 암컷 nude mice(Balb/c nu/nu)의 복부 측면 (lateral abdomen) 부위에 A549 암세포를(3×106 cells/200 µl/ mouse) 피하로 주사하였다(Day 0).
- 감초의 주성분인 glycyrrhizin의 비당부인 18β-GA의 A549 암세포 증식에 대한 효과를 먼저 검색하였다.
- 구입된 생쥐는 멸균된 filter-top cage에서 멸균된 물과 사료를 자유롭게 먹게 하고, 온도 20±2℃, 습도 50±10%의 실험실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험하였다.
- 그리고 다양한 18β-GA 농도 하에서 생성된 이 성분의 세포독성효과를 비교 분석하여 LD 50 을 산출하였다.
- A549는 인간 세포이기 때문에 종(species)이 다른 생쥐에게 이식하여 암종양을 형성하는 소위 이종이식(xenograft transfer) 방법은 타 연구 자의 연구에서 제시된 방법을 사용하였다. 기초실험에서 암종양 은 nude mice의 복부 측면에 A549 암세포를 1회 주입 하였다. 주입 후 대략 5~6일 후에 암종양이 형성되었고, 약물치료가 없는 경우에 외관으로 종양의 중심부에 혈관이 집중되며, 출혈과 함께 농(pus)이 분비되는 것을 알 수 있었다(data not shown).
- 동일한 투여경로 및 투여회수에 따라 음성대조군 생쥐그룹에는 DPBS를 주입하였고 양성대조군 생쥐그룹에는 doxorubicin(Sigma)을 60 µg/mouse 농도로 투여하였다.
- 또한 본 연구에서는 18β-GA의 항암효과를 임상에서 사용하는 기존의 항암제인 doxorubicin의 항암효과와 비교하였다.
- 또한, 18β-GA 내의 균의 오염 가능성을 조사하기 위해 blood agar 배지를 사용하여 검색한 후에 본 실험에 사용하였다.
- 먼저, 약물(18β-GA)과 암세포간의 상호접촉의 지속성(sustainability)에 따른 효능을 규명하기 위해서, 동일 용량에서 18β-GA를 A549 암세포에 투여 한 후에 처리기간의 차이에 따른 이 성분의 세포독성효과의 유효성 차이점을 조사하였다.
- 배양한 A549 암세포에 다양한 농도(12.5, 25, 50, 100, 150, 200, 및 250 µM)의 18β-GA를 첨가하고 37℃-5% CO2 배양기에서 48시간 추가 배양한 다음에 CCK-8 용액을 각 well에 10 µl씩 넣고 동일한 배양조건에서 3시간 추가 배양하였다.
- 사용한 18β-GA 농도는 12.5, 25, 50, 100, 150, 200, 250 µM 이었고, A549 증식억제효과는 이 성분으로 48시간 또는 72시간 처리한 다음에 CCK-8 용액을 사용하여 측정하였다.
- 상기와 같은 연구결과를 분석하여 본 연구의 목적인 18β-GA 의 항종양효과를 동물모델을 사용하여 검색하였다.
- A549(Human Lung carcinoma)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul)에서 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 기본배지에 10% heat-inactivated Fetal Bovine Serum(FBS; welGENE Inc, Seoul), 1% penicillin/streptomycin(Sigma)을 첨가하여 사용하였으며, 세포수효 측정은 Trypan blue 용액과 혼합한 후에 hemocytometer(Marienfeld, Germany)를 사용하여 측정하였다. 본 실험에서는 95% 이상의 생존율이 있는 경우에만 사용하였다.
- 이 결과를 동일한 측정조 건에서 산출된 기존의 항암제인 doxorubicin(=Adriamycin)의 세포독성효과와 비교하여 18β-GA의 유효성 정도를 평가하였다.
- 이 방법을 적용하여 A549 암세포의 생사 여부를 측정하여 18β-GA의 효과를 검색하였다.
- 이 실험에서는 Fig. 2에서 사용한 18βGA의 농도보다 더 세분하여 doxorubicin 1 µM 농도 시의 A549에 대한 세포독성효과와 비교하였다.
- 이 평가결과를 바탕으로 하여 상기에 언급한 바와 같이 A549 암세포로 형성된 종양에 18β-GA의 in-vivo 항종양효과(antitumor effect)를 검색하였다.
- 타 실험에서는 18β-GA의 농도를 20 µM씩 세분하여 이때의 A549에 대한 세포독성효과를 1 µM의 doxorubicin 농도로 처리된 A549 증식억제효과와 비교하여, 현재 임상에 사용하는 항암제인 doxorubicin과의 효능정도를 분석평가 하였다. 이를 위한 실험방법 및 분석은 상기에 기술한 동일한 방법을 사용하였으며 이때의 약물의 처리기간은 72시간을 선택하였다.
- 이에 본 연구에서는 폐렴 암세포인 A549를 이용하여 이종이식으로 형성된 암종양에 대한 18β-GA의 항암효과를 검색하였다.
- 주입 후 대략 5~6일 후에 암종양이 형성되었고, 약물치료가 없는 경우에 외관으로 종양의 중심부에 혈관이 집중되며, 출혈과 함께 농(pus)이 분비되는 것을 알 수 있었다(data not shown). 이와 같은 암종양 형성의 가능성을 먼저 타진하고 본 실험을 수행하였다. 18β-GA을 A549 암세포 주입 후 24시간 이후부터 3 일 간격으로 복강내로 총 4회 투여하였는데, 실험결과 음성대조 군에 비교해서 종양의 크기는 감소되었다.
- 이와 같이 A549 암세포를 이종이식하고 24시간 후에 18β-GA(1 mg/mouse)를 복강으로 주사 하였다.
- 타 실험에서는 18β-GA의 농도를 20 µM씩 세분하여 이때의 A549에 대한 세포독성효과를 1 µM의 doxorubicin 농도로 처리된 A549 증식억제효과와 비교하여, 현재 임상에 사용하는 항암제인 doxorubicin과의 효능정도를 분석평가 하였다.
- 한편, 18β-GA에 endotoxin 오염 가능성을 확인하기 위해서 LAL(Limulus Ameobocyte Lysate) 시험 Kit을 Sigma에서 구입하여 18β-GA를 실험에 사용하기 전에 검색하였다.
대상 데이터
- 18β-GA는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용하기 위해서 DPBS(Dulbecco's phosphate saline solution; Sigma)에 용해한 다음에 여과멸균(pore size=0.2 µm; Sartorius Stedim Biotech., Germany)하여 사용하였다.
- A549(Human Lung carcinoma)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul)에서 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 기본배지에 10% heat-inactivated Fetal Bovine Serum(FBS; welGENE Inc, Seoul), 1% penicillin/streptomycin(Sigma)을 첨가하여 사용하였으며, 세포수효 측정은 Trypan blue 용액과 혼합한 후에 hemocytometer(Marienfeld, Germany)를 사용하여 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 생쥐는 대략 6~7 주령의 nude mice(Balb/c nu/nu; Orient Inc.-Charles River Lab, Seoul)를 사용하였다. 구입된 생쥐는 멸균된 filter-top cage에서 멸균된 물과 사료를 자유롭게 먹게 하고, 온도 20±2℃, 습도 50±10%의 실험실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험하였다.
- 이 방법을 적용하여 A549 암세포의 생사 여부를 측정하여 18β-GA의 효과를 검색하였다. 실험방법은, 상기 언급한 배양조건에서 배양한 A-549(human lung carcinoma cell line)를 원심분리방법으로 세척하고 적정한 수효의 세포수가 되도록 serum free RPMI culture medium(welGENE Inc)로 희석하여 준비하였다. 준비된 A549 암세포를 96-well flat bottom plate(Falcon, Becton Dickinson, NJ, USA)에 각각 1×104 cells/ well이 되도록 분주한 후에 37℃, 5%-CO2 배양기에서 48시간 또는 72시간 배양하였다.
데이터처리
- 각 군간의 유의성 검증은 Student's t-test를 사용하였고 값이 5% 미만일 때에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 실험결과는 평균±표준오차(Mean±S.E.)로 계산하였다.
이론/모형
- 18β-GA의 항종양효과를 확인하기 위하여 타 연구자가 제시한 방법을 20,21) 사용하여 조사하였다.
- 본 연구실의 기 연구에서 10,17-19) 세포독성을 측정하는 방법을 사용하여, 18β-GA의 A549 암세포에 대한 세포독성효과는 CCK-8(Cell Counting Kit-8, Dojindo Lab., Japan) assay 방법을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 18β-GA을 A549 암세포 주입 후 24시간 이후부터 3 일 간격으로 복강내로 총 4회 투여하였는데, 실험결과 음성대조 군에 비교해서 종양의 크기는 감소되었다.
- Results showed that the compound inhibited proliferation of the cancer cells, and that the inhibitory activity appeared to be more efficient when the 18β-GA treatment was prolonged.
- 각 경우의 LD 50을 비교해보면 거의 100 µM 정도의 차이가 있어서 A549 암세 포와 18β-GA간의 상호작용기간이 길수록 세포독성효과가 증진됨을 알 수가 있다.
- 결론적으로, 양성 및 음성 대조군그룹의 생쥐들과 18βGA로 처리된 생쥐그룹과 상대적으로 평가해 볼 때, 이 감초 성분은 A549에 기인된 암종양에 대해서 항종양효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 끝으로, 본 연구의 결과를 종합해 보면, 한 가지 제안점은 18βGA를 기존의 항암제와 병용하는 소위 병용요법(combination)으로 적용해 볼 수 있다는 것이다.
- 분석결과, 18β-GA 또는 doxorubicin을 3회 투여하고 하루 후인 Day 8에 종양의 크기를 음성대조군의 경우와 비교해 볼때, 각각 53%, 42%의 종양의 크기가 감소되었으며(P<0.05), 마지막(4회) 약물을 투여하고 7일 후인 Day 15일에도 상기의 종양 크기 감소율과 유사한 비율로 종양형성의 억제효과가 검색되었다.
- 실험결과에서 18β-GA로 48시간 처리한 경우, 50 µM까지의 저농도에서는 거의 세포독성효과가 없는 반면에 100 µM에서 150 µM의 범주에서는 약 20% 정도의 세포독성효과가 있었고 200 µM과 250 µM의 농도에서는 각각 63%와 82%의 세포독성효과가 검색되었다(Fig. 2A).
- 이 결과를 고찰해볼 때, 18β-GA 의 세포독성효과는 48시간 처리(48 hrs-treatment) 보다는 72시간 처리 시 월등하게 효과적임을 알 수가 있다.
- 이 결과를 분석하면 LD50은 약 180 µM로 측정되었다.
- 이 실험결과, 기존의 항암 제인 doxorubicin의 항암효과와 비교해 볼 때, 1 µM doxorubicin 의 항암효과는 대략 82%의 A549 암세포의 증식을 억제하였는데, 이 억제효과는 효과는 18β-GA의 140 µM에서 160 µM 범주의 농도에 속하는 것으로 검색되었다(Fig. 3).
- 이 실험결과를 음미해보면 암세포에 대한 약물(18β-GA) 접촉기간이 연장될수록 세포독성효과, 즉 항암효과가 더 유효함을 알 수 있었다.
- 이 연구결과의 주요점은 18β-GA의 농도 조절에 따라서 T lymphoctye의 증식억제효과가 있고, 초기 면역력 발현에 의한 CD4+T helper cell 분화에 따른 Th1과 Th2 면역반응 유도성의 조절이 가능하다는 것이다.
- 이때의 두 약물의 비교는 대략 16배 차이인데, 이 평가를 in-vitro 상에서 두 약물이 동등한 효능을 발현하기 위해서 150배(주: 72시간 약물처리로 기준) 정도의 차이점(Fig. 3 참조)이 생기는 결과와 비교해보면 거의 1/10 수준으로 감소가 되어서 18β-GA의 생체내의 약물흡수 율이 매우 우수한 것으로 사료된다.
- 이때의 실험의 결과를 음미해보면, 본 실험이 비록 in-vitro 상에서의 결과이지만 대략 150 µM 용량의 18β-GA의 세포독성효과가 1 µM 용량의 doxorubicin과 유사하다.
- 이로보아 각 관찰일자에서 18β-GA는 doxorubicin에 비해서 더높은 항종양억제 효과가 있음을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 일예로, 두 경우에서 200 µM의 18β-GA를 기준으로 하여 음성대조군 18β-GA로 처리되지 않은 그룹-과 비교하면 통계적으로도 유의성(P<0.05)이 있음을 알 수 있었다.
- 기초실험에서 암종양 은 nude mice의 복부 측면에 A549 암세포를 1회 주입 하였다. 주입 후 대략 5~6일 후에 암종양이 형성되었고, 약물치료가 없는 경우에 외관으로 종양의 중심부에 혈관이 집중되며, 출혈과 함께 농(pus)이 분비되는 것을 알 수 있었다(data not shown). 이와 같은 암종양 형성의 가능성을 먼저 타진하고 본 실험을 수행하였다.
- 즉, 60 µg/ dose에서 doxorubicin의 항종양효과는 1 mg 18β-GA/dose의 항종양효과보다 낮은 것으로 검색되어서 용량적으로 두 약물을 비견해보면 4배 용량의 18β-GA가 doxorubicin의 항종양효과보다는 다소 우세한 것으로 평가되었다.
후속연구
- 그래서 새로운 성분의 발견도 중요하겠으나, 이미 규명된 성분의 난치병에 대한 효과를 규명하는 연구도 이에 못지않게 중요한 것으로 인식된다. 이런 관점에서 본 연구실에서는, 동양의학에서 빈도가 높게 사용되고 있는 감초(Glycyrrhizae Radix, A Family of Leguminosae)에 대해 집중적인 연구를 진행해 오고있다.
- 이를 달리 표현하면 doxorubicin 이 18β-GA보다 150배 정도의 효과가 있는 것으로 평가될 수도 있겠다. 하지만 이는 단순히 용량만을 산술적으로 비교한 것으 로, 이 실험방법이 in-vivo 상에서 수행되었다는 점을 고려할 때, 이는 체내투여 시에 항상 염두에 두어야 할 약물투과성이 전혀 반영되지 않은 것이기 때문에 두 약물간의 항암효과를 비교 평가하기에는 다소 무리가 있다고 사료된다. 하지만, 적어도 doxorubicin이 18β-GA보다 항암효과가 우수하다는 점을 간과할 수는 없을 것이다.
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