[논문]A549 인체폐암세포의 증식에 미치는 신령버섯 추출물의 영향에 관한 연구

최우영; 박철; 이재윤; 김기영; 박영민; 정영기; 이원호; 최영현

doi:10.3746/jkfn.2004.33.8.1237

A549 인체폐암세포의 증식에 미치는 신령버섯 추출물의 영향에 관한 연구
Anti-proliferative Effects of Water Extract of Agaricus blazei Murill in Human Lung Cancer Cell Line A549 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.33 no.8, 2004년, pp.1237 - 1245

최우영 (동의대학교 한의과대학 생화학교실, 부산대학교 생물학과) , 박철 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 이재윤 ((주)청원농산) , 김기영 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 박영민 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 정영기 (동의대학교 미생물학과) , 이원호 (부산대학교 생물학과) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실)

초록
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브라질 기원인 신령 버섯 (A. blazei murill)은 강력한 항암 및 면역강화 작용을 가진 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 신령버섯 수용성 추출물(water extracted A. blazei Murill, WEAB)이 A549 인체 폐암세포 증식에 미치는 영향을 조사하였으며, 증식억제와 연관된 기전 해석을 시도하였다. WEAB가 처리된 A549 세포는 처리 농도 의존적으로 생존율이 감소되었으며, WEAB 처리는 암세포의 다양한 형태적 변형을 유발하였다. Flow cytometry 분석 결과로서 WEAB 처리에 의한 A549 폐암세포의 증식억제는 세포주기 G2/M arrest 및 apoptosis 유발과 직접적으로 연관성이 있음을 알 수 있었다. WEAB가 처리된 암세포에서 전사 및 번역 수준에서 cyclin A 발현의 감소 및 Cdk inhibitor p21 발현의 증가 현상이 관찰되었으나, cyclin B1, Cdk2, Cdc2, Wee1, Cdc25c 및 p53 등의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 못하였다. 또한 WEAB의 처리는 COX-2 선택적 발현 저하를 유발하였으나, telomere 조절 관련 유전자들의 발현에는 큰 영향을 주지 못하였다. 이상의 결과는 신령버섯 추출물이 강력한 항암 및 암 예방 효능의 잠재력을 가지고 있음을 의미하며, 이에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Agaricus blazei Murill is a medicinal mushroom native to Brazil. It used to be a source of antitumor and immunoactive compounds and considered a health food in many countries. In the present study, it was examined the effects of water extract of A. blazei (WEAB) on the growth of human lung carcinoma cell line A549 in order to investigate the anti-proliferative mechanism by WEAB. Treatment of A549 cells to WEAB resulted in the growth inhibition, morphological change and induction of apoptotic cell death in a dose-dependent manner as measured by MTT assay and flow cytometric analysis. Flow cytometric analysis revealed that WEAB caused G2/M phase arrest of the cell cycle, which was associated with a down-regulation of cyclin A in both transcriptional and translational levels. WEAB treatment induced a marked up-regulation of cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor p21, however, the levels of Cdk2, Cdc2, Wee1, Cdc25C and p53 expression were remained unchanged in WEAB treated cells. In addition, WEAB treatment inhibited the levels of cyclooxygenase (COX)-2 mRNA and protein without alteration of COX-l expression. Taken together, these findings suggest that WEAB may be a potential chemotherapeutic agent for the control of human lung carcinorma cells and further studies will be needed to identify the active compounds that confer the anti-cancer activity of WEAB. Once such compounds are identified, the mechanisms by which they exert their effects can begin to be characterized.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

특히 Cdk2는 cyclin A와 결합하여 G2기 진행에 중요한 역할을 하고, Cdc2는 cyclin Bl과 결합하여 핵 막의 histone Hl과 lamin의인산화에 의 해 kinase 활성 이 증가하여 핵 막의 붕괴 및 chro- mosome의 재배열을 유발시켜 M기의 진행을 유도한다(18, 22, 23). 따라서 G2/M기 조절과 관련된 cyclin A 및 cyclin Bl 과 선택적으로 결합을 하는 Cdk2 및 Cdc2의 발현에 미치는 WEAB의 영향을 조사하였다. Fig.
또한 (30乂-2의 과발현에 의해 암조직에서의 혈관신생 및 전이능이 높아지고 apoptosis를 막는다는 점과 C0X-2 저 해 제 에 의 한 angiogenesis-^- 종양형 성 의 억 제등의 결과에서 이 유전자의 선택적 조절에 의한 암 예방전략이 대두되고 있다(35). 따라서 본 연구에서는 WEAB 처리에의한 A549 인체 폐암세포의 증식억제가 COX-2의 선택적 발현 억제와 관련이 있는지의 여부를 조사하였다. 상기에서와 동일 조건에서 얻어진 암세포들을 대상으로 COX-1 및 COX- 2의 발현에 미치는 VEAB의 영향을 조사한 결과, Fig.
본 연구에서는 아직까지 정확한 항암기전 해석이 이루어지고 있지 않은 신령버섯 추출물의 암세포 증식억제 기전 해석을 위하여 인체 암세포의 증식에 미치는 신령버섯 수용성 추출물(water extracted A. blazei Murill, WEAB)의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 인체 폐암세포 A549의 성장에 미치는 'WEAB의 영 향을 조사하였으며 , 암세포의 세포주기 분포도에 미치는 WEAB의 영향 및 몇 가지 중요한 세포주기 조절인자의 발현에 미치는 WEAB의 영향을 조사하였디.
况azei murill)은 강력한 항암및 면역강화 작용을 가진 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는신령 버섯 수용성 추출물(water extracted A. blazei Murill, WEAB)이 A549 인체 폐암세포 증식에 미치는 영향을 조사하였으며, 증식억제와 연관된 기전 해석을 시도하였다. WE- AB가 처리된 A549 세포는 처리 농도 의존적으로 생존율이 감소되었으며, 처리는 암세포의 다양한 형태적 변형을 유발하였다.
또한 telomere의 손실은 p53의 발현과 세포주기 교란에도 관여를 하는 것으로 알려져 있다(41). 이러한 중요성을 고려 하여 WEAB의 처 리 에 의한 폐 암세 포의 증식 억 제 가 폐 암세포 염색체 말단에 존재하는 telomere의 조절과 연관된 유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는지를 조사하였다. 그러나 Fig.

제안 방법

5 x 10, 개/ml丄의 정도로 분주하고 24시 간 동안 안정화시 킨 후 WEAB를 배지 에희 석 하여 1 〜5 mg/mL의 각각의 농도로 처 리 한 후 48시 간 동안 배양시켰다. 48시간 후에 위상차 현미경을 이용하여 200 배의 배율로 세포 형태를 비교하였다
8 mL 로 부유시키고 DNA intercalating dye인 propidium iodide (PI, concentration, 50 }ig/mL; Sigma)와 10 knuit의 RNase (Sigma)를 처리하여 암실(4°C)에서 1시간 동안 염색과정을 거 쳤다. PBS로 두 번 수세 과정을 거친 후, 부유액을 만들고, 35 Um pore size의 nylon mesh에 부유액 을 pipette으로 통과시 켜 단일세포로 분리 시 킨 후 flow cytometry(Becton Dick inson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT(Becton Dickinson) program을 - 용하여 분석하였다.
분리 된 gel을 nitro cellulose membrane(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의 해 2〜3시간 가량 전이시 켰다. 그 후 membrane의 비 특이적 단백질에 대한 blocking을 위해 10% skin milk를 함유한 PBS-T(0.1% Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 1시간 처리하고 PBST로 15분(5 분씩 나누어 3번)정도 수세하였다. 준비된 membrane에 각각의 항체를 처리하여 4°C에서 1시간 이상 반응시킨 다음 PBS-T로 수회 수세과정을 거쳤다.
그 후, 처리된 1차 항체에 대응하는 2차 항체 (PBS-T로 1 : 1000으로 희 석 하여 사용)를 처리하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS-T로 10분간 3번, 5분간 3번의 washing을 하고 enhanced chemilumin- oesence(ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arling ton Heights, IL, USA)을 처리한 다음 암실에서 Kodak X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.
다음은 WEAB 처 리 에 따른 A549 암세포의 처 리 농도 의존적인 증식 억제와 연관된 암세포의 전체적인 형태 변화를알아보기 위하여 WEAB를 각 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. Fig.
알 수 있었다. 따라서 WEAB 처리에 따른 암세포 증식억제기전 해석을 위하여 G2/M기의 조절과 관련이 있는 cyclin A와 cyclin B1 의 발현에 미치는 WEAB의 영향을 먼저 조사하였다(22, 23). 이를 위하여 해당 유전자의 primer 및 항체를 이용하여 RT-PCR 및 Western blot 분석으로 전사및 번역 수준에서의 발현 변화를 조사하였다.
세포주기조절의 관점에서 암세포는 세포주기의 비정상화에 기인된질병으로 정의될 수 있으며, 특정 시기의 세포주기 억제는 세포주기 조절 양성 인자의 발현 저 하 또는 음성 조절 인자의과발현에 의 한 것으로 요약될 수 있다. 따라서 WEAB의 처리 에 의 한 인체 폐 암세포의 생존율 감소에 따른 증식 억 제가 세포주기 진행과 어떤 연관성이 있는지를 먼저 조사하였다. 이를 위하여 각 농도별로 雄AB를 48시간 처리한 후 PI 염색 후 flow cytometry 분석을 실시하였으며, 각 시기별 histogram의 빈도를 Table 2에 나타내었다.
비록 대부분의 DNA damaging agent에 의한 세포주기 G2/M arrest 유발에는 p21 이 많이 관여하는 것으로 알려져 있지만, p27도 G2/M기 조절에 있어서 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다(29, 31-34). 따라서 WEAB의 처리에 의한 인체 폐 암세포의 G2/M arrest 유발에 종양 억 제 유전자 P53 및 p21 그리고 p27과 같은 Cdk inhibitor 들의 관련 여부를 조사하였으며 그 결과는 Fig. 5에 나타낸 바와 같다. Fig.
분리 된 RNA를 spectrometer를 이용하여 정 량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse tran- scriptase(RT)를 이용하여 2 Rg의 RNA에서 ss cDNAf- 합성 하였다. 만들어 진 RT product(template cDNA) 에 2.5 mM dNTP, 10 x buffer, DEPC water, premixed primer(Geno- Tech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)로 증폭하였다(Table 1). 이때 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자를 housekeeping gene으로서 internal control로 사용하였다.
, Carlsbad, CA, USA)를 4°C에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 분리 하였다. 분리 된 RNA를 spectrometer를 이용하여 정 량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse tran- scriptase(RT)를 이용하여 2 Rg의 RNA에서 ss cDNAf- 합성 하였다. 만들어 진 RT product(template cDNA) 에 2.
, Gaithersburg, MD, US A) 을 섞어서 loading 한 후 100 V에서 전기 영동하였다. 분리가 끝난 gel을 ethidium bro- mide(EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하고 Picture works photo enhancer program을 이 용하여 촬영하였다.
5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride(PMSF), 5 mM dithiothreitol(DTT)]를 첨가하여 4 °C에서 30분간 반응시 킨 후, 14, 000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용 방법 에 따라 정 량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, US A) 를 섞 어 서 sample 을 완성 한 후, 분석하고자 하는 단백질의 분자량에 따라서 각각 다른 %의 sodium dodecyl sulphate(SDS)-polyacrylamide gel에서 전기 영 동법 을 이 용하여 분리 하였다. 분리 된 gel을 nitro cellulose membrane(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의 해 2〜3시간 가량 전이시 켰다.
세 포 배 양용 6 well plate에 인 체 폐 암세 포를 6 x 10, 개/mL 로 분주하고 24시 간 동안 안정 화시 킨 다음 WEAB를 배 지 에희석 하여 각 well 당 1 ~5 mg/mL의 농도로 처 리 한 후 48시간 동안 배 양하였다. 48시 간 후 배지 를 제 거 하고 tetrazolium bromide salt(MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA)를 0.
Louis, Mo, USA)。] 함유된 PBS로 두번에서 세 번 가량 수세과정을 거친 후 다시 수 분간 원심분리하였다. 세포 침전물에 1% BSA가 들어간 PBS 0.8 mL 로 부유시키고 DNA intercalating dye인 propidium iodide (PI, concentration, 50 }ig/mL; Sigma)와 10 knuit의 RNase (Sigma)를 처리하여 암실(4°C)에서 1시간 동안 염색과정을 거 쳤다. PBS로 두 번 수세 과정을 거친 후, 부유액을 만들고, 35 Um pore size의 nylon mesh에 부유액 을 pipette으로 통과시 켜 단일세포로 분리 시 킨 후 flow cytometry(Becton Dick inson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT(Becton Dickinson) program을 - 용하여 분석하였다.
그 후 생화학 및 분자생물학적 실험방법들의 성장과 더불어 1983년 세포주기조절의 양성 인자라 할 수 있는 cyclin 및 이들과 복합체를 이루는 cyclin-dependent kinase(Cdk) 들이 동정되 었으며, 많은 선행 연구자들은 cyclin/Ckd 복합체의 형성과 연관된 인산화 및 단백질 분해 과정 등의 연구를 통해서 이들이 전 세포주기 에 걸쳐 매우 다양하게 존재한다는 것을 발견해 내었다(10, 11, 13). 세포가 G1 기로 접어들면서 D-type cyclin의 발현이 증가되 어 Cdk4 및 Cdk6와 복합체를 형성하면서 G1 기 조절을 담당하며(14, 15), G1 기 후반에는 cyclin E, S기를 포함한 G2/M기 진행은 cyclin A의 발현에 따른 cyclin B의 발현 이 증가되 어 각각 Cdk2 및 Cdc2 등과의 결합을 이루어서 각 세포주기 진행이 원활하게 수행되도록 한다(14T7). 그리고 Cdks는 다양한 세포증식 억 제 신호들에 의해 유도되는 Cdk inhibitor에 의하여 그 활성 이 억제될 수 있는데, 현재까지 밝혀진 Cdk inhibitor는 두 가지의 family 로 분류(INK4 및 CIP/KIP family)되고 있다(18, 19).
A549 인체 폐암세포는 생명공학연구소任国IBB, Daejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위 해 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 10%의 우태 아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL)과 1%의 peni- cillin-streptomycin(Gibco BRL) 등이 포함된 배지 를 사용하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였고, 배지는매 48시 간마다 교환해주었고, 세포수의 증식 에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA, Gibco BRL)를 처 리 하여 세 포를 부유시킨 다음 적정한 수의 세포를 분주하여 재배양하였다.
. 아울러 최근 중요성이 재확인되고 있는 염증발현 및 세포의 성장 조절에 중요한 조절인자인 cyclooxygenase(COX)의 발현과 세포분열 가능 횟수 조절에 결정적으로 기여하는 염색체 말단의 telomere 길이 조절관련 유전자 산물의 발현에 미치는 WEAB의 영향들을 조사하였다.
따라서 WEAB의 처리 에 의 한 인체 폐 암세포의 생존율 감소에 따른 증식 억 제가 세포주기 진행과 어떤 연관성이 있는지를 먼저 조사하였다. 이를 위하여 각 농도별로 雄AB를 48시간 처리한 후 PI 염색 후 flow cytometry 분석을 실시하였으며, 각 시기별 histogram의 빈도를 Table 2에 나타내었다.
blazei Murill, WEAB)의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 인체 폐암세포 A549의 성장에 미치는 'WEAB의 영 향을 조사하였으며 , 암세포의 세포주기 분포도에 미치는 WEAB의 영향 및 몇 가지 중요한 세포주기 조절인자의 발현에 미치는 WEAB의 영향을 조사하였디..
따라서 WEAB 처리에 따른 암세포 증식억제기전 해석을 위하여 G2/M기의 조절과 관련이 있는 cyclin A와 cyclin B1 의 발현에 미치는 WEAB의 영향을 먼저 조사하였다(22, 23). 이를 위하여 해당 유전자의 primer 및 항체를 이용하여 RT-PCR 및 Western blot 분석으로 전사및 번역 수준에서의 발현 변화를 조사하였다. Fig.

대상 데이터

45 Jim의 여 과지를 이 용하여 부유 성 분을 걸 러낸 후 수용성 분(water extrac ted A blazei Murill, WEAB)을 동결 건 조하여 사용하였다. A549 인체 폐암세포는 생명공학연구소任国IBB, Daejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위 해 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 10%의 우태 아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL)과 1%의 peni- cillin-streptomycin(Gibco BRL) 등이 포함된 배지 를 사용하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였고, 배지는매 48시 간마다 교환해주었고, 세포수의 증식 에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
본 실 험 에 사용된 신 령 버 섯 (Agaricus blazei MurilD은 김해시 소재 청 원농산에서 제공받았으며 , 100 g을 1, 000 mL의 증류수에 3시간 이상 끓인 후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심분리시 켜 침 전물을 제거하였다. 이를 다시 0.

데이터처리

5 mg/ mL 농도가 되 게 성 장배 지 로 희 석 하여 2 mL씩 분주하고 3시간 동안 COz incubator에서 배 양시 킨 다음 MTT 시 약을 깨끗하게 제거 하고 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco)를 ] mL씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well에 200 11L씩 옮겨서 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3번의 측정 값을 평 균값과 표준 오차를 Microsoft Excel pro- gram을 이용하여 분석하여 그래프로 나타내었다.

성능/효과

Fig. 2에서 나타난 바와 같이 WEAB의 처리농도가 증가할수록 세 포의 밀도가 감소되 면서 길고 분지 를 형 상하는 듯한 den- didte-like한 구조로 바뀌었으며, 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 증가함을 알 수 있었다. 이는 인체 폐암 세포에 WEAB의 처리 농도 의존적인 형태적 변화와 밀도의 감소는 WEAB 처리에 따른 생존율 감소와 성장 억제에 부합되는 결과였다.
WE- AB가 처리된 A549 세포는 처리 농도 의존적으로 생존율이 감소되었으며, 처리는 암세포의 다양한 형태적 변형을 유발하였다. Flow cytometry 분석 결과로서 WEAB 처 리에 의한 A549 폐암세포의 증식 억제는 세포주기 G2/M arrest 및 apoptosis 유발과 직접적으로 연관성이 있음을 알 수 있었다. WEAB가 처리된 암세포에서 전사 및 번역 수준에서 cyclin A 발현의 감소 및 Cdk inhibitor p21 발현의 증가 현상이 관찰되 었으나, cyclin Bl, Cdk2, Cdc2, Weel, Cdc25C 및 p53 등의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 못하였다.
Table 2의 결과에서 알 수 있듯이 WEAB가 처리되지 않은 정상 배지에서 배양된 세포의 경우 G1 기에 해당되는 빈도는 약 65.3% 정도였으며, S기 및 G2/M기 에 해당되는 세포의 빈도는 각각 17% 및 15.5% 정도였다. 그리고 apoptosis 의 빈도를 의 미하는 sub-Gl기 에 해당되는 빈도는 2.
6% 정도였다. 그러나 WEAB의 처리 농도가 증가할수록 G1 기 에해당되는 세포의 빈도는 매우 감소되었으며, G2/M기 및 sub-Gl기에 해당되는 빈도는 상대적으로 증가되었음을 알 수 있었다. 그리고 sub-Gl기를 제외한 나머지 세포군을 고려해 볼 때, WEAB 처리 농도의 증가에 따른 암세포의 증식억제는 S기의 부분적 증가 및 특히 G2/M arrest와 직접적 인연 관성이 있음을 알 수 있었다.
그러나 WEAB의 처리 농도가 증가할수록 G1 기 에해당되는 세포의 빈도는 매우 감소되었으며, G2/M기 및 sub-Gl기에 해당되는 빈도는 상대적으로 증가되었음을 알 수 있었다. 그리고 sub-Gl기를 제외한 나머지 세포군을 고려해 볼 때, WEAB 처리 농도의 증가에 따른 암세포의 증식억제는 S기의 부분적 증가 및 특히 G2/M arrest와 직접적 인연 관성이 있음을 알 수 있었다. 또한 3 mg/mL 처리군에서 apoptosis가 유발된 세 포의 빈도는 정 상 배 지 에 서 자란 세 포들에 비 하여 약 7배 정도 증가되 었으며 , 5 mg/mL 처 리 군에서는 약 10배 정도 증가되어 WEAB 처리에 따른 암세포의증식 억제는 apoptosis 유발과도 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
6에서 알 수 있듯이 COX-1 은 전사수준과 단백질 발현 양쪽에서 변화가 없었지 만 COX-2는 전사수준과 단백질 발현 모두에서 WEAB의 처리의 농도 의존적으로 그 발현의 양이 점차 감소하였다. 따라서 WEAB 처리에 의한 암세포의 증식억제에는 C0X-2의 선택적 발현 억제와 연관된 세포주기 교란 및 apoptosis의 유발과의 연관성을 알 수 있었으며, 이로 인한 prostagladins의 합성 저 해 작용이 있을 것으로 예상된다.
그 결과 Cdc2의 불활성화로 세至는 G2기 에서 M기로 진행할 수 없다고 알려져 있다(9, 24). 따라서 Weel과 Cdc25c의 발현 에 미 치 는 WEAB의 영 향을 조사해 본 결과는 Fig. 4C와 같으며 , Cdc25C가 WEAB 처 리 농도 의 존적 으로 약간 증가하였지 만 있듯이 두 유전자 산물의 발현에 WEAB의 처리가 큰 영향을 주지 못하였음을 알 수 있었다.
그리고 세포주기 분석의 결과, 고농도의 WEAB 처리군에서 S기에 속하는 빈도도 상대적으로 다소 증가되 었으나 S기의 진행 에 중요한 cy clin E(16, 17)의 발현에는 WEAB7} 큰 영향을 미치지 못하였다. 따라서 세포주기 양성 조절인자인 cyclin의 발현조절의측면 에서 WEAB 처 리 에 의 한 A549 세 포의 증식 억 제 는 cy- clinA의 선택적 발현 억제와 연관성이 있음을 알 수 있었다.
그리고 sub-Gl기를 제외한 나머지 세포군을 고려해 볼 때, WEAB 처리 농도의 증가에 따른 암세포의 증식억제는 S기의 부분적 증가 및 특히 G2/M arrest와 직접적 인연 관성이 있음을 알 수 있었다. 또한 3 mg/mL 처리군에서 apoptosis가 유발된 세 포의 빈도는 정 상 배 지 에 서 자란 세 포들에 비 하여 약 7배 정도 증가되 었으며 , 5 mg/mL 처 리 군에서는 약 10배 정도 증가되어 WEAB 처리에 따른 암세포의증식 억제는 apoptosis 유발과도 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 WEAB 처리에의한 A549 인체 폐암세포의 증식억제가 COX-2의 선택적 발현 억제와 관련이 있는지의 여부를 조사하였다. 상기에서와 동일 조건에서 얻어진 암세포들을 대상으로 COX-1 및 COX- 2의 발현에 미치는 VEAB의 영향을 조사한 결과, Fig. 6에서 알 수 있듯이 COX-1 은 전사수준과 단백질 발현 양쪽에서 변화가 없었지 만 COX-2는 전사수준과 단백질 발현 모두에서 WEAB의 처리의 농도 의존적으로 그 발현의 양이 점차 감소하였다. 따라서 WEAB 처리에 의한 암세포의 증식억제에는 C0X-2의 선택적 발현 억제와 연관된 세포주기 교란 및 apoptosis의 유발과의 연관성을 알 수 있었으며, 이로 인한 prostagladins의 합성 저 해 작용이 있을 것으로 예상된다.
이상의 결과에서 A549 인체 폐암세포의 증식억제는 G2/ M arrest와 연관된 apoptosis 유발과 직접적 인 관련이 있음을 알 수 있었다. 따라서 WEAB 처리에 따른 암세포 증식억제기전 해석을 위하여 G2/M기의 조절과 관련이 있는 cyclin A와 cyclin B1 의 발현에 미치는 WEAB의 영향을 먼저 조사하였다(22, 23).
이상의 결과에서 신령버섯 수용액 추출물의 A549 인체 폐암 세포에 대한 증식 억제 효과는 세포주기 G2/M arrest를 통한 apoptosis 유발에 의한 것이었으며, 암세포의 증식 억제에는 cyclin A의 발현 감소, Cdk inhibitor p21 의 발현 증가 및 COX-2의 선택적 저해 작용 등이 관여함을 알 수 있었다. 따라서 신령 버섯 추출물의 항암기전을 완전히 이 해하기 위 해서 는 추출물 각 조성 성 분에 관한 보다 추가적 인 연구가 이루어져야 할 것이며, 신령버섯은 새로운 항암 및 암예방 식의 약 소재로서의 개발 가능성이 매우 높을 것으로 생각된다.
1에서 나타낸 바와 같다. 정상배지 에서 배양된 세포들에 비 하여 WEAB 처 리 농도가 증가함에 따라 세포의 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었는더], 2 mg/mL 처리 군에서 생존율이 이 미 50% 정도로 감소되 었으며 최고 농도인 5 mg/ mL에서는 20% 정도까지 저하되었다. 즉 WEAB가 적정 농도 이상 처리된 배지에서 자란 암세포는 WEAB 처리농도 의존적으로 세포증식이 강하게 억제되었음을 알 수 있었다.
정상배지 에서 배양된 세포들에 비 하여 WEAB 처 리 농도가 증가함에 따라 세포의 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었는더], 2 mg/mL 처리 군에서 생존율이 이 미 50% 정도로 감소되 었으며 최고 농도인 5 mg/ mL에서는 20% 정도까지 저하되었다. 즉 WEAB가 적정 농도 이상 처리된 배지에서 자란 암세포는 WEAB 처리농도 의존적으로 세포증식이 강하게 억제되었음을 알 수 있었다. 이 러 한 생존율 저 하 경 향성 은 trypan blue 염 색 에 의 한 결과와도 유사하였다(데이타 미제시).

후속연구

따라서 신령 버섯 추출물의 항암기전을 완전히 이 해하기 위 해서 는 추출물 각 조성 성 분에 관한 보다 추가적 인 연구가 이루어져야 할 것이며, 신령버섯은 새로운 항암 및 암예방 식의 약 소재로서의 개발 가능성이 매우 높을 것으로 생각된다.
니 곤}, hTERT 의 promoter 영 역의 조절인자에 해당하는 c-myc과 Spl 등 (39, 40, 42)의 발현에도 큰 변화가 없었다. 따라서, WEAB의 처리에 의해 인체 폐암세포의 telomere 조절인자에는 큰 영향을 끼치지 않는다고 할 수 있지만, 좀 더 심도 깊은 연구가필요할 것으로 사료된다.
또한 WE- AB의 처리는 COX-2 선택적 발현 저하를 유발하였으나, telomere 조절 관련 유전자들의 발현에는 큰 영향을 주지 못하였다. 이상의 결과는 신령버섯 추출물이 강력한 항암 및 암예방 효능의 잠재력을 가지고 있음을 의미하며, 이 에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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