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문제 정의
- 예를 들어 대표적인 H2 antagonist라 할 수 있는 cimetidine을 장기 복용할 경우 성호르몬인 안드로겐 수용체를 blocking하여 테스토스테론의 합성을 저해함으로써 에스트라디올의 활성도를 높여 남성에 있어 성기능 장애 및 여성형 유방을 일으킨다는 보고가 있었으며 제산제의 경우에도 위장수축을 저해하거나, 소화를 더디게 하고 변비를 유발할 뿐 아니라 위장 내 산도를 감소시켜 해로운 세균의 증식을 초래하는 등의 여러 부작용들이 꾸준히 보고되고 있다.1) 본 연구에서는 비교적 안전성이 높은 약물인 천연물 중에서 엉겅퀴의 항위염 및 항위궤양 효과에 대한 실험을 실시하였다. 엉겅퀴는 산이나 들에서 자라고 초롱꽃목 국화과에 속하는 여러해살이 풀로 한방명으로는 대계, 소계라고 불리며 학명은 Cirsium japonicum var.
- 특히 엉겅퀴의 silymarin 성분은 항산화 작용이 비타민 E의 10배에 이르며 간기능 회복효과가 있다는 연구보고가 있다.2) 엉겅퀴의 종류는 좁은잎엉겅퀴(Cirsium japonicum var. nakaianum Nakai), 가시엉겅퀴, 흰가시엉겅퀴를 포함하여 15종 이상이 있는데 그 중에서 좁은잎엉겅퀴를 선택하여 자생지에 따른 효능의 차이를 확인하고자 하였다. 엉겅퀴는 경기도 고양시 설문동에 위치한 서울대 약초원과 충청남도 당진 인근 야산에서 채취하여 ethanol추출물과 ethanol추출물의 nhexane fraction, chloroform fraction, butanol fraction, aqueous layer를 계통적으로 나누어 실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 엉겅퀴를 약초원산과 당진산으로 나누어 자생지에 따른 엉겅퀴의 항위염 및 항위궤양 효과를 확인하였다. 먼저 DPPH test에서 약초원과 당진산 엉겅퀴의 chloroform과 butanol fraction에서 모두 free radical 제거 능력이 확인 되었다.
제안 방법
- 20,21) 이러한 보고에 근거하여 엉겅퀴의 70% ethanol extract의 fraction 중에서 동물실험에서 효과가 좋았던 당진산 엉겅퀴 butanol fraction으로 hydrogen peroxide(H2O2)와 superoxide(#)의 소거능을 측정하였다. 그 결과 두 가지 실험에서 농도 의존적으로 소거능이 커지는 것을 확인하였다.
- 30분 후에 HCl·ethanol액(60% ethanol에 150 mM HCl 함유) 1 ml를 경구투여하였고 절식절수하에서 1시간 방치시킨 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하였다.
- 즉, 절식시킨 흰쥐에 시료를 용량별로 경구투여한다. 30분 후에 무수 ethanol(1 ml/100 g)을 경구투여하고 절식절수 하에서 1시간 방치시킨 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하였다. 적출한 위는 선위부 점막 표면을 밖으로 노출시켜 0.
- 6,7) 따라서 자유유리기나 ROM을 제거하는 것이 위점막의 산화적 손상에 대해 보호작용을 발휘하거나 위궤양의 치유를 가속화시키는 방법이 될 수 있다.8) 본 연구에서는 엉겅퀴의 항산화 효과를 확인 하고자 DPPH, reducing power test, hydrogen peroxide (H2O2)와 superoxide(#)의 소거능을 실험을 실시하였다. 또한 위염의 원인 인자인 H.
- pylori균의 생장 억제효과를 확인하기 위해서 Kim 등11) 의 방법으로 실험하였다. Brucella broth(28 g/l)와 bacto agar(2%)를 물에 녹여서 멸균 후 horse serum(7%)을 첨가하여 혼합한 후에 DMSO에 농도 별로 용해시킨 시료를 주입 후 petri dish에 담았다. 여기에 H.
- DPPH를 이용한 항산화 실험 − In vitro에서의 직접적인 free radical scavenging 효과를 측정하고자 DPPH radical제거 활성을 측정하였다.
- 그리고 흰쥐를 이용한 HCl·ethanol, indomethacin 유발 위 손상 실험을 통해 급성과 만성 위염의 예방 효과를 자생지 별로 비교하였다.
- 기타 시약 및 추출 용매는 일급시약 이상을 사용하였다. 기기로는 evaporator(Eyela), pH meter(Orion model 350), clean bench와 CO2 incubator(Johnsam Co.), centrifuge 5810R(eppendorf), microscope(Olympus), UVspectrophotometer(Agilent Technologies Inc., CA, USA), UV-spectrophotometric plate reader(ASYS UVM340) 등을 사용하였다.
- 4 ml를 가한 후 560 nm에서 측정한 흡광도를 S로 한 후 결과 산출에 사용하였다. 또한 대조군으로 시료대신 용매를 사용하여 동일한 과정으로 실험하여 C0 및 C를 얻었고 각 흡광도를 다음 식에 대입하여 superoxide 소거능(%)을 산출하였다.18)
- 8) 본 연구에서는 엉겅퀴의 항산화 효과를 확인 하고자 DPPH, reducing power test, hydrogen peroxide (H2O2)와 superoxide(#)의 소거능을 실험을 실시하였다. 또한 위염의 원인 인자인 H. pyroli균에 대한 항균실험과 MTT assay를 실시하였다. 그리고 흰쥐를 이용한 HCl·ethanol, indomethacin 유발 위 손상 실험을 통해 급성과 만성 위염의 예방 효과를 자생지 별로 비교하였다.
- 5×10-4 M DPPH/ methanol 용액 1ml를 가해 총 5ml를 잘 혼합하였다. 실온에서 30분 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하고 inhibition ratio(%)를 다음의 식에 의하여 계산(AC: 대조군의 흡광도, AS: Sample의 흡광도)한 후 DPPH radical을 50% 제거하는 농도(IC50)를 구하였다. 양성대조약물로 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 엉겅퀴 추출물의 만성 위염에 대한 효과를 알아보고자 indomethacin에 의한 위 손상 실험을 시행하였다. 약초원산과 당진산 엉겅퀴를 300 mg/kg 투여시 위 손상이 각각 15.
- nakaianum Nakai), 가시엉겅퀴, 흰가시엉겅퀴를 포함하여 15종 이상이 있는데 그 중에서 좁은잎엉겅퀴를 선택하여 자생지에 따른 효능의 차이를 확인하고자 하였다. 엉겅퀴는 경기도 고양시 설문동에 위치한 서울대 약초원과 충청남도 당진 인근 야산에서 채취하여 ethanol추출물과 ethanol추출물의 nhexane fraction, chloroform fraction, butanol fraction, aqueous layer를 계통적으로 나누어 실험을 실시하였다.
- Brucella broth(28 g/l)와 bacto agar(2%)를 물에 녹여서 멸균 후 horse serum(7%)을 첨가하여 혼합한 후에 DMSO에 농도 별로 용해시킨 시료를 주입 후 petri dish에 담았다. 여기에 H. pylori균을 도말한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 3일간 배양 한 후 생성된 colony를 계수하였다. 양성대조군으로는 ampicillin을 사용하였다.
- 위암세포주인 SNU638 cell을 1.0×104개씩 96 well plate에 분주한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 각 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 30분 후에 indomethacin 2 ml을 피하주사하고 절식절수 하에서 7시간 방치시킨 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하였다. 적출한 위는 2% formalin 수용액으로 고정한 다음 대만부를 절개하여서 발생된 손상 정도를 손상길이(mm)로 측정하였다. 양성대조약물로 cimetidine과 hydrotalcite를 사용하였다.
- 30분 후에 HCl·ethanol액(60% ethanol에 150 mM HCl 함유) 1 ml를 경구투여하였고 절식절수하에서 1시간 방치시킨 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하였다. 적출한 위는 2% formalin 수용액으로 고정한 다음 대만부를 절개하여서 발생된 손상길이(mm)를 측정하였다. 양성대조약물로 cimetidine과 hydrotalcite를 사용하였다.
- 즉 시료에 메탄올을 가하여 각 농도 별로 조제한 후 4ml씩 시험관에 취한 후 여기에 1.5×10-4 M DPPH/ methanol 용액 1ml를 가해 총 5ml를 잘 혼합하였다.
- 체중 약 200 g 전후의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 ether 마취하에 개복하고 위의 유문부를 결찰하고 검체를 십이지장내로 주입한 뒤 4시간 후에 치사시켜 위를 적출하여 위액을 채취하였다. 채취한 위액은 3000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 위액량, pH 및 산 분비량을 측정하였다. 산도는 phenol red를 지시약으로 하여 0.
- 체중 약 200 g 전후의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 ether 마취하에 개복하고 위의 유문부를 결찰하고 검체를 십이지장내로 주입한 뒤 4시간 후에 치사시켜 위를 적출하여 위액을 채취하였다. 채취한 위액은 3000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 위액량, pH 및 산 분비량을 측정하였다.
- 체중 약 200 g 전후의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 시료를 용량 별로 경구투여하였다. 30분 후에 HCl·ethanol액(60% ethanol에 150 mM HCl 함유) 1 ml를 경구투여하였고 절식절수하에서 1시간 방치시킨 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하였다.
대상 데이터
- Fetal bovine serum, DMEM medium, penicillin/streptomycin, trypsin-EDTA와 RPMI medium 1640은 GIBCO(Invitrogen Inc., NY, USA)에서 구입하였으며, brucella broth, bacto agar, horse serum, ascorbic acid, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), dimethyl sulfoxide(DMSO), MTT agent와 sodium bicarbonate는 Sigma(Sigma-Aldrich Inc., MO, USA)에서 구입하였다. Methanol, HCl, ethanol은 Duksan pure Chemical Co.
- SNU638 cells은 Korean Cell Line Bank(KCRB®)에서 구입하였고 Helicobacter pylori는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다.
- Scheme 1 − Extraction and fractionation of Cirsium japonicum var. nakaianum Nakai from A (the Medical Herb Garden of Seoul National University located at Gayang-dong, Koyang city) and B (a hillock near Dangjin, Chungnam).
- 실험동물은 샘타코(주)에서 구입한 체중 150~200 g의 SpragueDawley(SD)계 웅성 흰쥐 6마리씩을 한 군으로 음성대조군, 시료 투여군 및 양성대조군으로 분류하여 실험하였고, 고형사료 및 물은 충분히 공급하였다.
- pylori균을 도말한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 3일간 배양 한 후 생성된 colony를 계수하였다. 양성대조군으로는 ampicillin을 사용하였다.
- 실온에서 30분 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하고 inhibition ratio(%)를 다음의 식에 의하여 계산(AC: 대조군의 흡광도, AS: Sample의 흡광도)한 후 DPPH radical을 50% 제거하는 농도(IC50)를 구하였다. 양성대조약물로 L-ascorbic acid를 사용하였다.16)
- 적출한 위는 2% formalin 수용액으로 고정한 다음 대만부를 절개하여서 발생된 손상길이(mm)를 측정하였다. 양성대조약물로 cimetidine과 hydrotalcite를 사용하였다.13)
- 엉겅퀴는 2007년 7월 고양시 설문동에 위치한 서울대학교 약초원과 충남 당진지역 인근 야산에서 자생하는 전초를 채취하고 수세후 건조한 것을 세절 하여 시료로 사용하였다. 엉겅퀴는 서울대학교 이은방 교수님의 감수를 받은 후 연구를 수행하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 유의성 검사는 Student's t-test를 사용하였고, p<0.05일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
- 모든 실험결과는 평균±표준오차(mean±S.E.)로 계산하였다.
이론/모형
- H. pylori균의 생장 억제효과를 확인하기 위해서 Kim 등11) 의 방법으로 실험하였다. Brucella broth(28 g/l)와 bacto agar(2%)를 물에 녹여서 멸균 후 horse serum(7%)을 첨가하여 혼합한 후에 DMSO에 농도 별로 용해시킨 시료를 주입 후 petri dish에 담았다.
- 6 ml을 첨가한 후 10분 후에 230 nm에서 흡광도를 측정하였디. 시료의 hydrogen peroxide 소거능(%)은 DPPH test와 같은 방법으로 계산 하였다.
- 체중 약 200 g 전후의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 Kitagawa15)의 방법에 따라 실험하였다. 즉, 절식시킨 흰쥐에 시료를 용량별로 경구투여한다.
성능/효과
- DPPH test를 통해 free radical의 제거능을 측정한 결과 약초 원산과 당진산 엉겅퀴 chloroform fraction의 IC50은 각각 136.2, 82.7 µg/ml이고, butanol fraction은 77.7, 94.6 µg/ml로 free radical 제거 능력이 확인되었다(Table I).
- H. pylori균에 대한 항균실험에서는 colony의 수가 대조군에 비하여 모든 시료에서 농도의존적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, 약초원산과 당진산 엉겅퀴 70% ethanol추출물 100 µg/ml의 농도와 각 fraction 250 µg/ml의 농도에서 colony의 생성이 완전히 억제된 것을 알 수 있었다(Table II).
- Reducing power − Reducing power에서 흡광도 값이 클수록 높은 환원력을 나타내는데 엉겅퀴의 환원력 측정결과 농도 의존적으로 값이 커지는 것을 확인하였다.
- 20,21) 이러한 보고에 근거하여 엉겅퀴의 70% ethanol extract의 fraction 중에서 동물실험에서 효과가 좋았던 당진산 엉겅퀴 butanol fraction으로 hydrogen peroxide(H2O2)와 superoxide(#)의 소거능을 측정하였다. 그 결과 두 가지 실험에서 농도 의존적으로 소거능이 커지는 것을 확인하였다. 특히 hydrogen peroxide 소거능은 엉겅퀴와 positive control인 ascorbic acid 320 µg/ml 농도에서 각각 79.
- 그리고 H. pylori균에 대한 항균실험에서는 70% ethanol추출물 100 µg/ml와 각각의 fraction들 250 µg/ml의 농도에서 약초원산과 당진산 모두 대조군에 비하여 colony의 생성이 완전히 억제되었다.
- 7%의 위손상 억제효과를 나타내었다. 당진산 엉겅퀴의 chloroform fraction 30 mg/kg 투여시 54.5%, butanol fraction 150 mg/kg 투여시 47.7%의 위손상 억제효과를 나타내었다. 양성 대조약물인 hydrotalcite은 control에 비해 73.
- 엉겅퀴 fraction에 대한 결과는 다음과 같다. 대조군에 비해 약초원산 엉겅퀴의 위손상 억제율은 butanol fraction 150 mg/kg 투여시 50.7%, aqueous layer 200 mg/kg 투여시 53.7%의 위손상 억제효과를 나타내었다. 당진산 엉겅퀴의 chloroform fraction 30 mg/kg 투여시 54.
- 이것은 양성 대조군을 사용한 ampicillin 100 µg/ml와 동등한 효과로 엉겅퀴의 우수한 항균작용을 보여주었다. 또한, H. pylori 실험에서 엉겅퀴시료는 모두 농도의존적으로 colony를 감소하였다.
- 엉겅퀴의 HCl·ethanol에 의한 위 손상에 대한 항위염효과 실험에서는 용량 의존적으로 위손상 억제율이 증가함을 알 수 있었으며 약초원 엉겅퀴가 당진산 엉겅퀴보다 급성 위염에 더 효과가 있음을 확인하였다. 만성 위염에 대한 효과를 알아보고자 indomethacin에 의한 위 손상 실험을 시행한 결과 역시 용량에 따라 위손상 억제 효과가 증가함을 알 수 있었으며 당진 엉겅퀴가 약초원 엉겅퀴보다 만성 위염에 더 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라 동물실험에서 효과가 좋았던 엉겅퀴의 btanol fraction으로 실험한 결과 reducing power test에서는 농도의존적 환원력을 확인하였고, superoxide(#)의 소거능 실험에서도 positive control인 L-ascorbic acid 보다는 약하지만 다소 효과를 나타내었다.
- 본 연구에서는 엉겅퀴를 약초원산과 당진산으로 나누어 자생지에 따른 엉겅퀴의 항위염 및 항위궤양 효과를 확인하였다. 먼저 DPPH test에서 약초원과 당진산 엉겅퀴의 chloroform과 butanol fraction에서 모두 free radical 제거 능력이 확인 되었다. 그리고 H.
- 만성 위염에 대한 효과를 알아보고자 indomethacin에 의한 위 손상 실험을 시행한 결과 역시 용량에 따라 위손상 억제 효과가 증가함을 알 수 있었으며 당진 엉겅퀴가 약초원 엉겅퀴보다 만성 위염에 더 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라 동물실험에서 효과가 좋았던 엉겅퀴의 btanol fraction으로 실험한 결과 reducing power test에서는 농도의존적 환원력을 확인하였고, superoxide(#)의 소거능 실험에서도 positive control인 L-ascorbic acid 보다는 약하지만 다소 효과를 나타내었다. 특히 hydrogen peroxide(H2O2) 소거능은 L-ascorbic acid와 유사하게 우수했다.
- 1에 나타내었다. 약초원 엉겅퀴 fraction은 용량에 따른 cell viability의 억제가 크게 나타나지 않았지만 당진 엉겅퀴 중 chloroform fraction은 용량 의존적으로 cell viability를 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 엉겅퀴 추출물의 만성 위염에 대한 효과를 알아보고자 indomethacin에 의한 위 손상 실험을 시행하였다. 약초원산과 당진산 엉겅퀴를 300 mg/kg 투여시 위 손상이 각각 15.2, 50.4%억제율을 보였고 500 mg/kg 투여시에는 각각 31.0, 65.5%로 양성대조약물인 cimetidine 150 mg/kg이 억제한 효과(58.6%)와 비슷한 효과를 나타내었다. 이로써 당진산이 약초원산 보다 만성위염에 더 효과가 있음을 확인하였다.
- 엉겅퀴 butanol fraction 150mg/kg 경구 투여시 약초원 엉겅퀴와 당진 엉겅퀴의 기초위액 분비량은 각각 3.7±2.3 및 2.9±0.6으로 대조군의 4.2±1.2와 비교하였을 때 약간 감소되었음을 확인할 수 있다.
- 엉겅퀴의 HCl·ethanol에 의한 위 손상에 대한 항위염효과 실험에서는 용량 의존적으로 위손상 억제율이 증가함을 알 수 있었으며 약초원 엉겅퀴가 당진산 엉겅퀴보다 급성 위염에 더 효과가 있음을 확인하였다.
- 엉겅퀴의 butanol fraction이 흰쥐의 무수 ethanol 위 손상에 의한 점액 분비량에 미치는 영향을 알아본 결과 약초원과 당진산의 점액분비량을 보면 각각 274.61±39.14, 290.33±48.52으로 control(291.58±15.51)과 유사한 수준으로 점막에서 점액분비가 왕성하게 일어났다.
- 따라서 positive control로 사용한 pyrogallol 100 µg/ml와 ascorbic acid 100 µg/ml보다는 약하나 효과가 다소 있다고 볼 수 있다. 엉겅퀴의 fraction 중에서 동물실험에서 효과가 좋았던 butanol fraction의 reducing power 측정결과 약초원 엉겅퀴와 당진 엉겅퀴 모두 농도 의존적으로 값이 커지는 것을 확인하였다(Table V).
- 2와 비교하였을 때 약간 감소되었음을 확인할 수 있다. 이 실험결과에 의하면 엉겅퀴 butanol fraction은 흰쥐의 위액분비량, pH 및 산분비량에 미치는 영향에는 효과가 거의 없는 것으로 보아 공격인자인 위액에 의한 위 손상 억제 mechanism은 아닐 것으로 생각된다.
- 6%)와 비슷한 효과를 나타내었다. 이로써 당진산이 약초원산 보다 만성위염에 더 효과가 있음을 확인하였다. 엉겅퀴 fraction에 대한 결과는 다음과 같다.
- 3% 억제하였다. 이로써 약초원산이 당진산 엉겅퀴보다 급성 위염에 더 효과가 있음을 확인하였다. 엉겅퀴 fraction 중에서는 당진산 butanol fraction 150 mg/kg이 61.
- Indomethacin 위 손상을 유발시킨 위의 모습은 대조군의 hemorrhage가 나타난 것에 비하여 엉겅퀴 투여군에서는 손상이 현격하게 줄어있다. 즉 엉겅퀴는 유의성 있는 방어효과가 있었으며, 이를 통하여 공격인자인 indomethacin에 의한 위손상에 대해 점액의 분비 증가나 방어 인자의 존재를 추측할 수 있다.
- 특히, 약초원산과 당진산 엉겅퀴 70% ethanol추출물 100 µg/ml의 농도와 각 fraction 250 µg/ml의 농도에서 colony의 생성이 완전히 억제된 것을 알 수 있었다(Table II). 즉, 엉겅퀴의 추출물이 H. pylori의 증식을 억제함으로써 H. pylori의 위궤양 및 위암 기전인 carcinogen에 대한 저항성 저하, mucosal hyperproliferation유발, carcinogenic N-nitroso compound의 증가 및 ascorbic acid의 분비감소 등을 완화하고 2차적인 감염의 증상들을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 생각된다.
- 특히 hydrogen peroxide 소거능은 엉겅퀴와 positive control인 ascorbic acid 320 µg/ml 농도에서 각각 79.2, 83.4%로 유사한 값을 나타내어 당진산 엉겅퀴 butanol fraction의 우수한 소거능을 확인하였다(Table V).
- 특히, 약초원산과 당진산 엉겅퀴 70% ethanol추출물 100 µg/ml의 농도와 각 fraction 250 µg/ml의 농도에서 colony의 생성이 완전히 억제된 것을 알 수 있었다(Table II).
- Control의 점액 증가는 자극에 대한 방어 기전으로 일시적으로 위 점액이 많이 분비된 것으로 생각된다. 하지만 외견상 위 점막을 제거한 후 조직을 관찰하였을 때 엉겅퀴의 butanol fraction에서 control에 비해 위 근육의 손상 정도와 출혈이 억제됨을 확인하였다. Sucralfate의 점액 분비량이 191.
후속연구
- 본 연구를 통하여 엉겅퀴의 자생지에 따른 급성과 만성에서 항 위염 및 항 위궤양의 효과가 다름을 알 수 있었으며 이에 따라 자생지별 엉겅퀴의 효력을 더 연구할 가치가 있음을 알 수 있었다. 또한 실험결과 엉겅퀴의 위염 치료제 개발의 가능성을 확인하였으며 질병 예방 차원에서 기능성 식품의 개발에도 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구를 통하여 엉겅퀴의 자생지에 따른 급성과 만성에서 항 위염 및 항 위궤양의 효과가 다름을 알 수 있었으며 이에 따라 자생지별 엉겅퀴의 효력을 더 연구할 가치가 있음을 알 수 있었다. 또한 실험결과 엉겅퀴의 위염 치료제 개발의 가능성을 확인하였으며 질병 예방 차원에서 기능성 식품의 개발에도 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
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