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문제 정의
- 9-14) 한편, 흰민들레 추출물을 대상으로 한 화장품 소재 가능성에 대한 최근의 연구에서 다른 생리활성과는 다르게 피부미백과 관련된 tyrosinase 저해활성이 에탄올 추출물보다 열수 추출물에서 더 높은 것으로 밝히고 있다.15) 따라서 본 연구에서는 우리나라 각지에서 자생하는 흰민들레 열수 추출물과 그 용매별 분획물의 tyrosinase 저해 활성을 비롯한 항산화 활성과 nitric oxide 생성 억제 활성, 세포독성 등을 조사하여 천연물 유래 기능성 소재, 특히 피부 관련 제품 원료로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
가설 설정
- 3)Values are mean±SD (n=6).
제안 방법
- 1% naphtyl-ethylendiamine dihydrochloride(in H2O)를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켜 micro-plate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 시료액 대신 PBS를 가하여 측정하였으며, 표준물질로 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 동일한 방법으로 측정한 흡광도를 바탕으로 작성한 검량선을 이용하여 NO 생성량을 산출하였다.19)
- DPPH radical 소거능 측정 − 흰민들레 열수 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다.
- PBS에 5 mg/ml의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 µl씩 가하고, 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다.
- Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법을 변형하여 측정하였다.
- 배지를 제거한 후, 각 well에 100 µl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 본 연구에서는 흰민들레 열수추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성과 tyrosinase 저해 활성, 그리고 nitric oxide 생성 억제 활성, 세포독성 등을 조사하였다. 흰민들레 열수 추출물의 ethyl acetate 분획에서 polyphenol과 flavonoid 함량이 168.
- 18) Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 µl와 200 µM DPPH 용액 180 µl를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 methanol을 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 소거능을 산출하였으며, 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도(SC50)를 추가적으로 계산 하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였다.
- 즉 480 µg/ml의 농도에서 열수추출물과 chloroform 분획, 그리고 ethyl acetate 분획에서 60% 이하의 세포생존율을 나타냄으로써 nitric oxide 생성 억제 활성에서는 240 µg/ml의 농도 이하에서만 측정 하였다.
- 총 flavonoid 함량 측정 − 페놀성 화합물중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- 추출 및 분획 − 건조된 흰민들레 시료 200 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 증류수 3 l를 추출 용매로 하여 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다.
- 추출 및 분획 − 건조된 흰민들레 시료 200 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 증류수 3 l를 추출 용매로 하여 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과 및 동결건조를 실시하여 분말화된 추출물 69 g(수율 34.5%)을 얻었으며, 이중 50 g을 증류수 1 l에 분산시킨 후 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate, butanol을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4°C 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였는데, hexane, chloroform, ethylacetate, butanol 및 aqueous 분획의 수율은 각각 0.
- 표준물질로 tannic acid를 0~500 µg/ml 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물의 함량을 mg/g tannic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- 재료 − 본 실험에 사용한 흰민들레(T. coreanum)는 2010년 6월 전라남도 영광 지역에 자생하는 것을 채집한 것으로 수세 후 50°C에서 건조시킨 후 4°C 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.
- 통계분석 − 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차(mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0을 이용하였다.
이론/모형
- MTT assay에 의한 세포독성 측정 − 흰민들레 추출물 및 분획물의 세포에 대한 독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다.
- 총 polyphenol 함량 측정 − Folin-Denis법을 이용하여 열수 추출물 및 분획물의 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 특히 각질형성세포에 존재하는 melanin의 양상에 따라 피부색이나 색소침착여부가 좌우되므로 melanin 생성과정에 관여하는 효소인 tyrosinase를 저해하는 활성이 중요하게 다뤄지고 있다.1) 인간과 같은 생체에서는 호흡과 에너지 생성 등 다양한 생명 유지 활동의 결과로 다양한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 특히, 인체의 피부는 대부분의 시간을 공기 중의 산소와 접촉하고 있고 자외선 등 외부적인 위험에 노출됨으로써 활성산소종의 유도에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다.
- 30 µg/ml 농도에서 추출물 및 분획물이 LPS를 처리하지 않은 대조군의 NO 생성량 이하로 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 120 µg/ml 농도에서는 그 억제 활성이 높아지는 것으로 나타나 농도의존적인 NO 생성 억제활성을 보였다.
- 2,3) 이러한 ROS는 염증 반응시 면역 반응으로 인해 생성이 증가되는 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)과 함께 생성되기도 한다.4) 염증 반응의 조절은 매우 복잡한 것으로 알려져 있으며, 염증 과정 중에는 많은 양의 nitric oxide(NO), 염증유도 cytokine류 등이 생성된다.5)
- 50%의 radical을 소거하는데 필요한 시료 농도를 나타내는 SC50에서 열수추출물이나 chloroform 분획, aqueous 분획은 실험이 실시된 농도 범위에서 산출할 수 없을 정도로 낮은 소거능을 가진 것으로 확인되었으나 ethyl acetate 분획과 butanol 분획이 각각 64.65 µg/ml와 277.42µg/ml로 나타났다.
- officinale) 등의 지상부를 건조한 것으로 열을 내리고 해독과 이뇨에 효과가 있으며, 염증이나 종기를 낫게 하며, 간과 담낭질환에 효과가 있다고 알려져 있다.6) 흰민들레(T. coreanum)는 우리나라 각 지역에 자라는 재래종으로 노랑민들레(T. mongolicum)와 비슷하지만 꽃이 흰색인 것이 특징이다. 민들레의 부위 중 잎과 꽃을 포함한 지상부의 경우 hydroxycinnamic acid와 같은 페놀성 화합물과 비타민 C, tocopherol 등 비타민류가 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 뿌리에는 taraxasterol 등 많은 식물성 스테로이드 화합물과 chlorogenic acid, caffeic acid 등의 phenolic 화합물을 함유하고 있는 것으로 보고되고 있다.
- DPPH radical 소거능 − 흰민들레 열수 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능 측정 결과에서 열수추출물에서는 거의 나타나지 않았던 radical 소거능이 ethyl acetate 분획과 butanol 분획에 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다(Table II).
- 92 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. DPPH radical 소거능 측정 결과, 흰민들레 열수추출물에서는 거의 나타나지 않았던 radical 소거능이 ethyl acetate 분획과 butanol 분획에 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. Tyrosinase 저해 활성에서 ethyl acetate 분획의 저해 활성이 가장 높은 수준으로 확인되었으며, 50%의 저해율을 가지는데 필요한 시료농도를 나타내는 IC50에서 positive control로 사용된 ascorbic acid에 크게 뒤지지 않는 242.
- Tyrosinase 저해 활성에서 ethyl acetate 분획의 저해 활성이 가장 높은 수준으로 확인되었으며, 50%의 저해율을 가지는데 필요한 시료농도를 나타내는 IC50에서 positive control로 사용된 ascorbic acid에 크게 뒤지지 않는 242.94 µg/ml의 수치를 나타내었다.
- 한편, LPS 처리하여 NO 생성 억제 활성을 측정한 농도에서의 세포생존율을 동시에 측정한 결과에서 aqueous 분획을 제외한 열수추출물, chloroform 분획, ethyl acetate 분획, butanol 분획의 세포생존율이 저농도보다 고농도에서 높게 나타나 각 시료가 염증 유발 조건하에서 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. 결과적으로 흰민들레 열수추출물의 ethyl acetate와 butanol 분획 등이 항산화 및 tyrosinase 저해활성, 그리고 염증반응과 관련된 NO 생성 억제활성이 뛰어난 것으로 나타났으며, 이를 바탕으로 한 피부 관련 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다.
- 92 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. 다음으로는 butanol 분획에서 각각 83.77 mg/g과 25.78 mg/g으로 나타나 ethyl acetate 분획과 butanol 분획이 열수추출물보다 활성물질의 함량이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. Polyphenol 화합물은 식물의 대표적인 2차 대사산물로 hydroxyl기를 가지는 방향족 화합물로서 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 특히 항산화 활성은 페놀성 화합물의 종류나 함량이 미치는 영향이 큰 것으로 알려져 있다.
- 또한 960 µg/ml 농도에서 chloroform 분획과 열수 추출물에서 상당한 수준의 독성이 있을 수 있음을 확인할 수 있었으며, butanol 분획이 전반적으로 양호한 세포생존율을 가지는 것으로 나타났다.
- 총 polyphenol 및 flavonoid 함량 − 흰민들레 열수추출물과 분획물의 총 polyphenol과 flavonoid 함량 측정 결과를 Table I에 나타내었다. 열수추출물의 polyphenol과 flavonoid 함량이 65.42 mg/g과 19.83 mg/g으로 측정되었으며, 분획물 중에서는 ethyl acetate 분획에서 polyphenol과 flavonoid 함량이 168.23 mg/g과 31.92 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. 다음으로는 butanol 분획에서 각각 83.
- 30 µg/ml 농도에서 추출물 및 분획물이 LPS를 처리하지 않은 대조군의 NO 생성량 이하로 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 120 µg/ml 농도에서는 그 억제 활성이 높아지는 것으로 나타나 농도의존적인 NO 생성 억제활성을 보였다. 특히 ethyl acetate 분획과 chloroform 분획, 그리고 butanol 분획의 NO 생성 억제활성이 다른 시료에 비해 높은 수준임을 확인하였다. 한편, LPS 처리하여 NO 생성 억제 활성을 측정한 농도에서의 세포생존율을 동시에 측정한 결과에서 Fig.
- 특히 실험이 실시된 가장 낮은 농도인 50 µg/ml에서 ethyl acetate 분획은 다른 분획이나 추출물보다 월등히 높은 45.35%의 소거능을 나타내었다.
- 특히, 50%의 저해율을 가지는데 필요한 시료농도를 나타내는 IC50에서 positive control로 사용된 ascorbic acid의 166.77 µg/ml에 크게 뒤지지 않는 242.94 µg/ml의 수치를 나타내 ethyl acetate 분획이 tyrosinase의 저해제로서 가능성이 높음을 알 수 있었다.
- 특히 ethyl acetate 분획과 chloroform 분획, 그리고 butanol 분획의 NO 생성 억제활성이 다른 시료에 비해 높은 수준임을 확인하였다. 한편, LPS 처리하여 NO 생성 억제 활성을 측정한 농도에서의 세포생존율을 동시에 측정한 결과에서 Fig. 2에서 보는 바와 같이 aqueous 분획을 제외한 열수추출물, chloroform 분획, ethyl acetate 분획, butanol 분획의 세포생존율이 저농도보다 고농도에서 높게 나타나 각 시료가 염증 유발 조건하에서 세포를 보호하는 효과가 있음을 짐작케 하였다.
- 특히 ethyl acetate 분획과 chloroform 분획, 그리고 butanol 분획의 NO 생성 억제활성이 다른 시료에 비해 높은 수준임을 확인하였다. 한편, LPS 처리하여 NO 생성 억제 활성을 측정한 농도에서의 세포생존율을 동시에 측정한 결과에서 aqueous 분획을 제외한 열수추출물, chloroform 분획, ethyl acetate 분획, butanol 분획의 세포생존율이 저농도보다 고농도에서 높게 나타나 각 시료가 염증 유발 조건하에서 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. 결과적으로 흰민들레 열수추출물의 ethyl acetate와 butanol 분획 등이 항산화 및 tyrosinase 저해활성, 그리고 염증반응과 관련된 NO 생성 억제활성이 뛰어난 것으로 나타났으며, 이를 바탕으로 한 피부 관련 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 흰민들레 열수추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성과 tyrosinase 저해 활성, 그리고 nitric oxide 생성 억제 활성, 세포독성 등을 조사하였다. 흰민들레 열수 추출물의 ethyl acetate 분획에서 polyphenol과 flavonoid 함량이 168.23 mg/g과 31.92 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. DPPH radical 소거능 측정 결과, 흰민들레 열수추출물에서는 거의 나타나지 않았던 radical 소거능이 ethyl acetate 분획과 butanol 분획에 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
- 94 µg/ml의 수치를 나타내었다. 흰민들레 열수추출물과 분획물의 NO 생성량을 측정한 결과, 추출물 및 분획물에서 농도의존적인 NO 생성 억제활성을 보였다. 특히 ethyl acetate 분획과 chloroform 분획, 그리고 butanol 분획의 NO 생성 억제활성이 다른 시료에 비해 높은 수준임을 확인하였다.
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