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문제 정의
- 그러나 황련과 금은화를 발효하였을 때 나타나는 유해균에 대한 효과는 아직 연구가 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 항염작용이 있다고 알려져 있는 대표적인 한약재인 황련과 금은화를 선택하여 실험을 진행함으로써 발효 한약재 활용이 유해균 억제에 유효하다는 사실을 입증하고, 임상에서의 활용 가능성에 대해 고찰해보고자 한다.
- 이번 연구에서는 항염작용이 우수하다고 알려져 있는 대표적인 한약재인 금은화, 황련을 발효하여 유해균 억제 효과에 대한 실험을 진행하면서 발효 한약의 임상적 효과에 대하여 입증하고자 하였다.
제안 방법
- 20% 시료 추출물을 각 균주의 액체배지와 1:1로 혼합하여 최종 농도가 10%가 되도록 한 후 각 균주를 2×107 CFU/mL이 되도록 접종하여 24시간 배양한 뒤 각 균주의 적합 agar plate에 도말하여 24시간 후에 확인하여 유해균 저해효과를 생균수 측정을 통하여 확인하였다.
- 항균작용이 우수하다고 알려져 있는 황련과 금은화의 유해균 억제 효과를 확인하기 위하여 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides로 발효한 발효추출물을 유해균 배지에 접종하여 24시간 동안 배양하였고 agar plate에 배양액을 도말하여 24시간 후에 생균수를 측정하였다. 각각의 균주로 발효한 한약추출물 100 ㎕의 sample을 Neutrient broth 900 ㎕에 넣고 10배수로 연속 희석한 뒤 결과의 유의성을 높이기 위해 집락수가 500미만으로 확인되는 희석 배수에서 배지당 2회씩 집락수를 측정하였다. 본 실험에서는 106 , 107의 배수에서 집락수를 측정하였고 두 개 배수의 산술 평균을 구하여 원래 용액에 함유된 세균수를 산출하였다.
- 황련의 유해균 생육 저해효과를 확인하기 위하여 각각의 균주로 발효된 한약재 추출물을 유해균 배지에 배양한 후 생균수를 측정한 결과는 Table 2~3과 같다. 대조군에서는 유해균만을 배양시킨 배지의 생균수를 측정하였고, x는 발효과정을 거치지 않은 한약재를 첨가한 배지의 생균수이며 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesentero- ides 각각의 균주로 발효시킨 발효추출물을 배양하여 각각의 생균수를 측정하였다. 발효 황련은 Staphylo- coccus aureus에 대해 특히 더 강한 항균작용이 나타난다는 것을 확인할수 있었다.
- 2ml만 도말하여 집락수를 측정하였기 때문에 생균수를 CFU/mL로 환산하려면 1mL 기준이 되어야 하기에 생균수는 집락수 측정값에 5배에 해당하는 값으로 환산되었다. 대조군에서는 유해균만을 배양시킨 배지의 생균수를 측정하였고, 시료 및 스타터 첨가를 제외한 모든 조건은 실험군과 동일하게 하여 실험하였다.
- 발효 금은화 황련의 유해균 억제 효과를 확인하기 위하여 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides로 발효한 한약재 추출물을 시료로 이용하여 유해균 생육 저해 효과에 대해 실험하였고 생균수를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 각각의 균주로 발효한 한약추출물 100 ㎕의 sample을 Neutrient broth 900 ㎕에 넣고 10배수로 연속 희석한 뒤 결과의 유의성을 높이기 위해 집락수가 500미만으로 확인되는 희석 배수에서 배지당 2회씩 집락수를 측정하였다. 본 실험에서는 106 , 107의 배수에서 집락수를 측정하였고 두 개 배수의 산술 평균을 구하여 원래 용액에 함유된 세균수를 산출하였다. 각각의 plate에 배양액 0.
- 시료의 추출물은 auto- clave를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균 시킨 후 실온에서 충분히 식히고 각 시료에 각각의 균주 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides를 2×107 CFU/mL이 되도록 접종하여 Table 1에 제시한 조건에서 24시간 동안 발효한 뒤 autoclave를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균 시킨 후 3000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액을 실험에 이용하였다.
- 항균작용이 우수하다고 알려져 있는 황련과 금은화의 유해균 억제 효과를 확인하기 위하여 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides로 발효한 발효추출물을 유해균 배지에 접종하여 24시간 동안 배양하였고 agar plate에 배양액을 도말하여 24시간 후에 생균수를 측정하였다. 각각의 균주로 발효한 한약추출물 100 ㎕의 sample을 Neutrient broth 900 ㎕에 넣고 10배수로 연속 희석한 뒤 결과의 유의성을 높이기 위해 집락수가 500미만으로 확인되는 희석 배수에서 배지당 2회씩 집락수를 측정하였다.
대상 데이터
- 한약재 및 발효 한약재가 유해균 억제에 미치는 영향을 살펴보기 위해 본 실험에서는 Salmonella spp., Staphylococcus aureus 2종을 셀바이오텍에서 분양 받아 사용하였다. 각 균주는 2회 계대배양 후 사용하였다.
- 발효에 사용된 균주는 한국미생물 보존센터로부터 분양받은 Lactobacillus brevis (KCCM 40399), 셀바이오텍에서 분양받은 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides를 이용하였다. 스타터 배양액은 autoclave를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균한 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco)에 Lactobacilli MRS agar plate에서 균주에 따라 최적의 조건에서 배양한 균주를 1회 접종한 뒤 최적 조건에서 배양하여 스타터로 사용하였다.
- 본 실험에서는 황련, 금은화 추출물, 2가지 한약재를 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides 각각의 균주로 발효한 발효추출물을 시료로 이용하여 총 8개의 시료로 실험하였다. 한약재의 추출은 250mL 비커에 한약재 분말 30g에 Lactobacilli MRS broth 150mL을 첨가하여 실온 (15~20℃)에서 30분간 sonication한 뒤, shaking water bath를 이용하여 70℃, 70 rpm의 조건에서 3시간 동안 열수 추출하였다.
- 황련 (Coptidis rhizoma), 금은화 (Lonicerae Flos) 분말은 동국대학교 일산병원으로부터 제공받아 밀봉한 후 暗所에서 보관하여 사용하였다.
성능/효과
- 2. 황련의 Staphylococcus aureus에 대한 균 생육 저해율은 황련 추출물을 포함하여 3가지 발효추출물 전부 100%로 확인 되었으며 균주에 대하여 완전한 억제반응이 나타났다는 것을 확인할 수 있었다.
- 4. 금은화의 Staphylococcus aureus에 대한 균 생육 억제율은 32.43%로 확인되었으며 본 실험에서는 Salmonella spp.에 대한 항균 효과(45.
- Staphylococcus aureus에 대한 생육억제 작용도 금 은화, 황련 각각의 균주에서 유효한 것으로 나타났으며 금은화의 경우 Lactobacillus plantarum이 금은화와 배양되었을 때 균의 성장이 가장 강하게 억제되는 경향을 나타내었다. 황련의 경우 3종류의 균주 전체에서 균의 성장이 완전히 억제되었다.
- Staphylococcus aureus 균주에 대한 황련의 항균력을 알아보기 위한 실험의 결과는 Table 3과 같다. 균 생육 저해율은 모든 군에서 100%로 확인되 었으며 황련 추출물을 포함하여 3가지 발효추출물과 배양된 균주 전체에 대하여 완전한 억제반응을 관찰할 수 있었다.
- 균주에 대한 금은화의 항균력을 알아보기 위한 실험의 결과는 Table 5와 같다. 균 생육 저해율이 98.04%로 확인되었던 황련과는 대조적으로 발효과정을 거치지 않은 금은화 추출물의 균 생육 저해율은 45.1%로 나타났으며 발효추출물로 배양한 균주의 균 생육 저해율을 비교했을때 Lactobacillus brevis (82.5%)보다 Lactobacillus plantarum (100%), Leuconostoc mesenteroides (99.04%)의 유해균 생육 억제 효과가 우수하게 나타났으며 Lactobacillus plantarum으로 발효했을 때 생균수가 전혀 관찰되지 않아 특히 강한 항균 효과가 발현될 수 있다는 것도 확인 할 수 있었다.
- 금은화의 장내 유해균 생육 저해효과를 확인하기 위하여 황련과 동일한 방법으로 실험이 진행되 었으며 각각의 균주로 발효된 한약재 추출물을 유해균 배지에 배양한 후 생균수를 측정한 결과는 Table 4~5와 같다. 금은화의 경우 Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum와 발효했을때 Lactobacillus brevis를 사용하였을 때에 비해 유해균 억제 효과가 훨씬 강하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 두 가지 유해균을 비교했을 때 나타나는 유해균 저해효과의 차이를 Figure 2에 표기하였다.
- 균주에 대한 황련의 항균력을 알아보기 위한 실험의 결과는 Table 2와 같다. 대조군에서 확인되는 생균수와 비교했을 때 x군의 균 생육 저해율은 98.04%로 발효과정을 거치지 않은 황련추출물 자체만으로도 유해균 생육 억제 효과가 우수하다는 것을 알 수 있으며 균 생육 저해율을 비교해 보았을 때 Lactobacillus brevis (94%), Lactobacillus plantarum (97.9%)을 이용한 발효추출물과 배양한 균주보다 오히려 더 큰 유해균 억제 효과가 발현될 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 Leuconostoc mesenteroides (99.
- 9%)을 이용한 발효추출물과 배양한 균주보다 오히려 더 큰 유해균 억제 효과가 발현될 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 Leuconostoc mesenteroides (99.96%)로 발효했을 때 특히 강한 항균 효과가 나타났다는 것도 관찰되었다.
- 1%)보다 미약한 것으로 확인되었다. 반면, Lactobacillus plantarum (100%), Leuconostoc mesenteroides (99.99%)를 사용한 발효추출물을 배양한 배지에서 균의 증식이 거의 나타나지 않았기에 유해균 억제 효과가 매우 강력할 수 있을 것으로 확인 되었으나 Lactobacillus brevis (24.78%)와 배양된 금은화 추출물은 발효되지 않은 상태의 금은화보다 오히려 낮은 유해균 증식 억제 효과가 관찰되었다.
- 1%)보다 미약한 것으로 확인되었다. 반면, Lactobacillus plantarum 에서 100%, Leuconostoc mesenteroides에서 99.99%가 확인되었고 Lactobacillus brevis에서 24.78%가 확인되어 발효 금은화의 유해균 억제 효과는 균주의 종류에 따라 차이가 있음을 알 수 있었다.
- 대조군에서는 유해균만을 배양시킨 배지의 생균수를 측정하였고, x는 발효과정을 거치지 않은 한약재를 첨가한 배지의 생균수이며 Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesentero- ides 각각의 균주로 발효시킨 발효추출물을 배양하여 각각의 생균수를 측정하였다. 발효 황련은 Staphylo- coccus aureus에 대해 특히 더 강한 항균작용이 나타난다는 것을 확인할수 있었다. 두 가지 유해균을 비교했을 때 나타나는 유해균 저해효과의 차이는 Figure 1에 표기하였다.
- Salmonella spp.에 대하여 3종류의 유산균과 발효한 한약재의 생육 저해 효과는 금은화, 황련 각각의 균주에서 모두 유효한 것으로 나타났으며 금은화의 경우 Lactobacillus plantarum이 금은화와 배양되었을 때 균의 성장이 가장 강하게 억제되는 경향을 나타내었다. 황련의 경우 Leuconostoc mesenteroides가 황련과 배양되었을 때 균의 성장이 가장 강하게 억제되는 경향을 나타내었다.
- 금은화의 Salmonella spp.에 대한 균 생육 저해율은 45.1%로 나타났으며 발효추출물로 배양한 균주의균 생육 저해율을 비교했을 때 Lactobacillus brevis 에서 82.5%, Lactobacillus plantarum에서 100%, Leuconostoc mesenteroides에서 99.04%로 확인 되었으며 Lactobacillus plantarum으로 발효했을 때 생균수가 전혀 관찰되지 않아 항균 효과가 우수할 수 있다는 것도 확인 할 수 있었다.
- 황련의 Salmonella spp.에 대한 균 생육 저해율은 98.04%로 발효과정을 거치지 않은 황련추출물 자체만으로도 유해균 생육 억제 효과가 우수할 수 있다는 것을 알 수 있으며 발효했을 때 균 생육 저해율이 Lactobacillus brevis에서 94%, Lactobacillus plantarum에서 97.9%, Leuconostoc mesenteroides에서 99.96%로 확인되어 발효 황련의 유해균 억제 효과의 유효성을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과로 발효 금은화 황련이 활용이 유해균 억제에 유효하다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 황련의 경우 3종류의 균주 전체에서 균의 성장이 완전히 억제되었다. 특히 대조군에서도 균수가 전혀 관찰되지 않아 황련이 Staphylococcus aureus에 대하여 특히 강력한 생육 저해효과를 나타낸다는 사실을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 기존에 한약재제의 장내 유해균 억제효과에 대한 연구가 진행된 바 있으나 발효 한약재의 유효성에 대한 연구는 미미하였으며 특정 유해균에 대한 생균 억제 효과가 한약성분과 유산균 특성에 따라 달라질 수 있기에 유산균 발효 기전이 한약 성분에 어떠한 약리학적 기전 변화를 야기시키는 지에 대한 연구가 추후 필요할 것으로 사료된다. 또한 probiotic의 다양성을 만족시키는 표준화된 발효 과정에 대한 후속연구도 필요하다고 본다.
- 기존에 한약재제의 장내 유해균 억제효과에 대한 연구가 진행된 바 있으나 발효 한약재의 유효성에 대한 연구는 미미하였으며 특정 유해균에 대한 생균 억제 효과가 한약성분과 유산균 특성에 따라 달라질 수 있기에 유산균 발효 기전이 한약 성분에 어떠한 약리학적 기전 변화를 야기시키는 지에 대한 연구가 추후 필요할 것으로 사료된다. 또한 probiotic의 다양성을 만족시키는 표준화된 발효 과정에 대한 후속연구도 필요하다고 본다.
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