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문제 정의
- 본 연구에서는 수소화물생성-유도결합플라스마 질량분석법으로 게르마늄과 셀레늄을 동시 정량하기 위해 에너지 밀도가 높은 mini torch를 사용하여 수소화물의 생성을 위한 환원조건, 산의 종류 및 농도의 영향, 시료의 회화방법의 차이 등을 연구하여, 게르마늄과 셀레늄의 분석 시 최적조건을 찾고 그 결과를 토대로 상추의 분석에 적용하여 식물체내의 게르마늄과 셀레늄의 동시정량 시 신속하고 정확한 분석 방법을 제시하고자한다.
- 본 연구에서는 식물체 내의 게르마늄과 셀레늄의 정확하고 신속한 분석 방법을 제시하고자 우리나라 전역에서 재배되고 있는 대표 식물인 상추(Lactuca sative L.)를 시료로 하여 분석하였다. 상추는 식용뿐만 아니라 한방에서는 와거(경엽)와 와거자(종자)라하여 약용으로도 이용해 왔으며 음종, 하형에 대하여 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다.
제안 방법
- ICPMS의 최적측정 조건을 찾기 위해 Li, In, Bi의 이온세기를 측정하여 RF power를 결정한 후 7Li, 115In, 209Bi와 Ar의 polyatomic 이온의 간섭현상이 많이 발생하는 질량수 52와 54에서의 background를 측정하여 sample cone과 mini torch의 최적 거리를 결정하였다.
- 검량선용 표준용액은 시판되는 게르마늄과 셀레늄의 ICPMS용 표준용액(Accustandard, 10 μg/mL)을 단계적으로 분취하여 1% HNO3 용액으로 희석하여 각각 100 μg/L의 2차 표준용액을 제조하고 5, 10, 20, 40 mL를 분취하여 100 mL 용량플라스크에 넣고 1% HNO3로 희석하여 5, 10, 20, 40 ng/mL로 제조하여 검량선용 표준용액으로 사용하였다.
- 게르마늄과 셀레늄의 분석 시 사용되는 수소화물생성장치에 환원제로 사용되는 NaBH4와 NaOH의 최적농도 조건을 구하였다. 유도결합플라스마를 이용하여 분석에 응용한 B.
- 게르마늄의 경우 10 μg/L의 게르마늄 표준용액을 제조한 후 3 M의 HCl을 사용하고 NaBH4를 0.1%에서 1%까지 변화시키면서 게르마늄을 분석하여 NaBH4의 최적농도를 찾았다.
- 게르마늄의 경우 10 μg/L의 게르마늄 표준용액을 제조한 후 NaBH4는 0.4%로 고정하였으며 안정제로 사용되는 NaOH는 0.5%로 농도를 고정하여 HNO3, HClO4, H2SO4, HCl을 각각 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 M로 제조하여 게르마늄의 농도를 측정하여 최적조건을 구하였다.
- 또한 Sampling cone과 torch의 거리를 결정한 후 carrier gas 유량의 최적조건을 측정하였다. 기기조건은 Table 1과 같다.
- 생성된 수소화물은 아르곤 가스에 의하여 mini torch로 도입되어 이온화되고 이온화된 게르마늄과 셀레늄은 sample cone을 통하여 이온렌즈를 거친 후 질량분리부에서 분리되어 전자증폭검출기에서 검출하여 정량하였다. 사용되는 기기의 최적 분석조건, 환원제의 농도, 산종류와 농도 등을 실험하였다.
- 분석에 사용한 시료는 XXX에서 양액 재배된 상추를 이용하였다. 상추는 파종 후 1개월간 기른 후 Yamazaki 상추 전용 배양액을 사용하여 4주간 양액재배를 실시한 후 셀레늄은 Na2SeO4(Sigma Co. U.S.A)를 Se의 공급원으로 사용하여 Se의 농도를 2 mg/L를 처리하였고, 게르마늄은 수용성 GeO2(Aldrich Co. U.S.A)를 Ge의 공급원으로 Ge의 농도를 2 mg/L로 한 후 1주일 간 재배 후 수확하여 사용하였다. 수확된 상추는 물로 씻은 후 건조기에서 70 ℃로 48시간 건조한 후 200mesh의 크기로 분쇄 한 후 사용하였다.
- 게르마늄과 셀레늄의 분석은 수소화물생성장치를 이용하여 환원제, 산, 시료를 연동펌프에 의해 반응기에 도입한 후, 아르곤 가스를 주입하여 시료중의 게르마늄과 셀레늄의 수소화물을 생성시킨다. 생성된 수소화물은 아르곤 가스에 의하여 mini torch로 도입되어 이온화되고 이온화된 게르마늄과 셀레늄은 sample cone을 통하여 이온렌즈를 거친 후 질량분리부에서 분리되어 전자증폭검출기에서 검출하여 정량하였다. 사용되는 기기의 최적 분석조건, 환원제의 농도, 산종류와 농도 등을 실험하였다.
- 셀레늄의 경우 80Se이 동위원소체 비율이 가장 많지만, 플라스마에서 발생된 40Ar40Ar, 32S16O3의 이온 spectrum이 나타나고 80Kr의 동위원소가 존재하여 분석에는 사용이 제한되어야 하므로, 간섭이온이 적고 동위원소체 비율이 높은 78Se을 사용하여 분석하였다.
- 셀레늄의 경우도 게르마늄의 경우와 같은 방법으로 실험하여 산의 종류와 농도별로 셀레늄의 농도를 측정하여 최적조건을 구하였다.
- 셀레늄의 경우에는 게르마늄과 같은 방법으로 10 μg/L의 셀레늄 표준용액을 제조한 후 3 M의 HCl을 사용하여 NaBH4를 0.1%부터 1%까지 변화시키면서 셀레늄을 분석하여 NaBH4의 최적농도를 찾았고, 이때 안정제로는 0.5%의 NaOH를 각각의 NaBH4 용액에 첨가하여 분석하였다.
- 수소화물 생성장치의 반응시약인 NaBH4는 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1%를 각각 1 L씩 제조하였고 안정제로는 NaOH를 0.1%에서 1%까지 제조하여 사용하였다. 제조된 NaBH4용액은 Knechel10 등이 보고한 방법을 사용하여 0.
- 수소화물생성장치를 이용하여 게르마늄과 셀레늄의 분석에 사용되는 산 종류와 농도에 따른 최적조건에 대하여 실험하였다.
- 수소화물생성장치에 사용하는 산을 HCl 3M로 고정하고 HVG-ICPMS를 이용한 게르마늄과 셀레늄의 분석에 일반적으로 사용되는 NaBH4와 NaOH의 농도의 영향을 측정하여 Fig. 3에 나타냈다. Se는 NaBH4와 NaOH 모두 0.
- 식물체 중에 포함되어 있는 항산화제로서 주목받고 있는 게르마늄과 셀레늄의 극미량 분석에 있어서의 재현성 있는 분석방법을 제시하고자 수소화물생성장치와 유도결합플라스마질량분석기를 이용하여 분석하였다.
- 유도결합플라스마질량분석기에 일반적으로 사용되는 torch 대신 에너지 밀도를 높여 이온 간섭, 분자이온 생성 등의 간섭현상을 줄일 수 있는 mini torch를 사용하여 산 종류와 농도의 영향, 수소화물의 생성을 위한 환원조건, 시료 전처리 방법의 차이 등 다양한 조건하에서 상추 중의 게르마늄과 셀레늄을 분석하였으며, 분석의 정확성을 평가하기 위하여 회수율 검증과 셀레늄의 표준시료인 SRM-1547, 1570a을 분석하여 기준값과 비교함으로서 분석의 정확성을 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 다시 5 mL의 산을 첨가한 후 시계접시를 덮은 채 서서히 가열하여 hot plate 표면온도를 150 ℃로 유지하면서 백연이 발생할 때까지 농축시킨 후 실온까지 방냉 하여, 완전히 식은 후 1% HNO3를 이용하여 비커 벽을 닦는 후 100 mL 용량플라스크에 넣는다. 이 과정을 반복하여 100 mL 용량플라스크의 눈금까지 묽혀 게르마늄과 셀레늄의 분석용 시료 용액으로 하였으며 표준시료도 같은 방법으로 처리하여 농도를 측정하였다. 실험방법을 Fig.
대상 데이터
- 게르마늄과 셀레늄의 분석에 사용한 질량수는 72Ge과 78Se을 선택하여 분석하였다. 일반적으로 게르마늄은 74Ge가 동위원소체 비율이 36.
- 본 연구에서 사용한 시약은 Extra Pure 급의 NaBH4 (Aldrich, U.S.A), NaOH (Aldrich, U.S.A)을 사용하였으며, HNO3(70%, MB급, 동우화인켐), HCl(40%, 동우화인캠), H2O2(30%, 동우화인캠), H2SO4(98%, 동우화인켐)은 전자급 사용하였으며, HClO4 (70%, Aldrich)는 ICPMS 분석용 시약을 사용하였다. 이중 HCl은 시약 순도에 따른 수소화물생성량을 보기 위하여, AR (35% Junsei, Japan), GR (36~37%, Merck, Germany)를 사용하였다.
- 분석에 사용한 시료는 XXX에서 양액 재배된 상추를 이용하였다. 상추는 파종 후 1개월간 기른 후 Yamazaki 상추 전용 배양액을 사용하여 4주간 양액재배를 실시한 후 셀레늄은 Na2SeO4(Sigma Co.
- 사용한 기기는 mini torch를 장착한 유도결합플라스마 질량분석기(ICPMS, ICPM-8500, Shimadzu, Japan)로 spray chamber는 외부벽과 내부벽 내에 냉각수를 순환시킬 수 있도록 고안된 것을 사용하여, 2 ℃의 냉각수를 순환시켜 사용하였다. Nebulizer (GE, Australia)는 가압분무식을 사용하였으며 가스유량은 0.
- 산은 HNO3, H2SO4, HClO4, HCl를 각각 초순수로 단계별로 희석하여 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 M로 제조하여 사용하였다.
- 시료를 회화하기 위한 단일 산으로는 HNO3을 혼합산으로는 HNO3와 H2O2, H2SO4, HClO4를 각각 3:1로 혼합하여 HNO3-H2O2, HNO3-H2SO4, HNO3-HClO4를 제조하여 사용하였다.
- 5%의 NaOH를 각각의 NaBH4 용액에 첨가하여 분석하였다. 실험에 사용한 NaBH4와 NaOH는 데시케이터에 보관하였고 분석 직전에 제조하여 사용하였다.
- A)을 사용하였으며, HNO3(70%, MB급, 동우화인켐), HCl(40%, 동우화인캠), H2O2(30%, 동우화인캠), H2SO4(98%, 동우화인켐)은 전자급 사용하였으며, HClO4 (70%, Aldrich)는 ICPMS 분석용 시약을 사용하였다. 이중 HCl은 시약 순도에 따른 수소화물생성량을 보기 위하여, AR (35% Junsei, Japan), GR (36~37%, Merck, Germany)를 사용하였다.
- 전처리에 사용한 산(Acid)중 단일산은 HNO3을 사용하였으며, 혼합산으로는 HNO3-HClO4 (3:1), HNO3-H2O2(3:1), HNO3-H2SO4 (3:1)을 사용하였다. 건조기에서 건조된 시료를 각각 0.
데이터처리
- 또한, 분석의 정확성을 평가하기 위하여 표준시료 SRM-1547, 1570a (NIST U.S.A)를 사용하여 비교 분석 하였다.
- 이상의 결과를 바탕으로 분석방법의 정확성을 평가하기 위하여 셀레늄 표준물질인 SRM-1547과 1570a (NIST, U.S)를 분석한 후 참고 값과 비교 검증하였다. 표준시료의 분석결과는 Table 3에 나타냈다.
이론/모형
- 사용한 기기는 mini torch를 장착한 유도결합플라스마 질량분석기(ICPMS, ICPM-8500, Shimadzu, Japan)로 spray chamber는 외부벽과 내부벽 내에 냉각수를 순환시킬 수 있도록 고안된 것을 사용하여, 2 ℃의 냉각수를 순환시켜 사용하였다. Nebulizer (GE, Australia)는 가압분무식을 사용하였으며 가스유량은 0.4~1.0 L/min로 조정하여 사용하였다.
- 최근 수소화물생성법으로 원자화 시킨 후 유도결합플라스마방출분광법(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES)을 이용한 분석도 수행되고 있으나 검출한계면에서 분석능력이 떨어지는 것이 현실이다. 따라서 식물체 시료 중 극미량 금속원소를 분석하기 위해 질량분석법을 이용하여야 한다. 유도결합플라스마질량분석법(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)은 무기원소 분석을 위한 중요한 분석법으로 대부분 원소들의 동시분석 능력이 우수하고 넓은 선형농도범위를 갖으며 분해능이 높다.
- 제조된 NaBH4용액은 Knechel10 등이 보고한 방법을 사용하여 0.45 μm membrane filter로 여과하였다.
성능/효과
- H2SO4를 이용할 경우 게르마늄과 셀레늄의 검량선을 작성 할 때 H2SO4 자체의 이온세기로 인하여 검량선의 바탕용액 자체가 높게 평가되어 기울기가 눕는 현상이 나타나 결과값이 높게 평가되는 현상이 나타났다.
- 2에 나타냈다. HCl은 다른 산 종류와는 달리 환원성이 높은 산으로 HNO3, HClO4, H2SO4 보다는 수소화물을 생성시키는 데 적합한 것으로 나타났다. 분석시의 농도는 게르마늄의 경우 0.
- HNO3 단독으로 처리한 경우 산화력이 다른 혼합산 보다 떨어져 상추 분해 시 유기물이 완전히 분해가 되지 않아 2, 3회 반복하여 분해를 해야 하는 번거로움이 나타났으며, 분해 후 ICPMS를 이용하여 분석한 결과도 다른 산에 비하여 낮게 평가되어 상추 등의 식물체를 분해하는데 적합하지 않는 것으로 나타났다.
- Mini torch가 장착된 유도결합플라스마질량분석기의 polyatomic 이온과 2차방전의 이온을 효과적으로 제거하기 위한 mini torch와 sampling cone과의 거리는 5.0mm 였으며, carrier gas의 유량은 0.6 L/min로 나타났다. Mini torch의 사용은 기존에 사용 중인 torch와 비교하여 산화물의 생성비율과 2차 방전 효과를 줄일 수 있었으며, Ar 가스 소비량이 일반 torch의 절반으로 경제적으로도 이점이 있었다.
- 6 L/min로 나타났다. Mini torch의 사용은 기존에 사용 중인 torch와 비교하여 산화물의 생성비율과 2차 방전 효과를 줄일 수 있었으며, Ar 가스 소비량이 일반 torch의 절반으로 경제적으로도 이점이 있었다.
- 3에 나타냈다. Se는 NaBH4와 NaOH 모두 0.4~0.6% 농도범위에서 가장 좋은 세기를 보였으며, Ge는 NaBH4와 NaOH가 각각 0.8~1.0%와 0.4~0.6% 농도범위에서 가장 좋은 결과를 보였다.
- 건조된 상추를 HNO3와 HClO4를 이용한 습식회화 후 mini torch가 장착된 수소화물-유도결합플라스마질량분석기를 사용하여 게르마늄과 셀레늄을 분석한 결과 회수율은 각각 98.2%, 98.5%로 나타났으며, SRM-1547, 1570a 셀레늄 표준시료를 분석하여 참고값과 비교한 결과 정확도는 98.3%, 101.6%로 식물체중 극미량의 게르마늄과 셀레늄의 분석에 mini torch를 장착한 수소화물-유도결합플라스마질량분석법이 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 5 M, 셀레늄은 3 M 이었다. 게르마늄과 셀레늄의 동시정량에는 3 M의 HCl을 사용하는 것이 mini torch 유도결합 플라스마질량분석기를 사용하는데 최적의 분석조건임을 알 수 있었다.
- 게르마늄의 결과값은 2.3 μg/g으로 HNO3로 처리 하였을 때와 같은 경향이 나타났으며, 셀레늄의 경우 7.0 μg/g으로 HNO3보다는 약간 높은 결과가 나왔다.
- 시료 전처리 방법에서 나타난 결과와 회수율을 Table 2에 나타냈다. 게르마늄의 경우 HNO3 단독사용 할 경우 33.5%, HNO3-H2O2 및 HNO3-H2SO4은 각각 41.3%, 69.2%의 회수율을 나타냈고, HNO3-HClO4가 98.2%로 회수율이 가장 높게 나타났다. 셀레늄의 경우 HNO3 43.
- 본 연구에서는 게르마늄과 셀레늄을 ICPMS로 분석할 때 간섭현상을 최소화하기 위하여 Montaser16 등이 고안한 mini torch system을 이용하여, sampling cone과 torch의 거리를 변화시키면서 확인한 결과 거리가 3.0 mm 일때 가장 높은 intensity를 나타냈으며, 그 이상으로 갈수록 감소하는 경향이 나타났다.
- 는 유기물질이나 환원성 물질과는 환원제로 작용하여, 특히 지질(脂質, fat)를 포함하는 시료의 분해에 적합하다고 알려져 있으며, Ti, V, Cr, W 등과는 착물을 형성하여 이들을 포함하는 시료의 전처리에 많이 사용이 되고 있다. 본 연구에서는 상추를 회화시킬 때 게르마늄 및 셀레늄의 Ge(VI), Se(VI) 화합물을 4가 화합물로 변화시키고자 H2O2를 처리하였으나, 환원제로서 작용을 하지 못하는 것을 알 수 있었으며, 이 결과는 H2O2가 HNO3 등과의 반응 시 H2O2보다 산화력이 강한 산과는 강력한 산화제로 작용한다는 결과를 나타냈다.18
- HCl은 다른 산 종류와는 달리 환원성이 높은 산으로 HNO3, HClO4, H2SO4 보다는 수소화물을 생성시키는 데 적합한 것으로 나타났다. 분석시의 농도는 게르마늄의 경우 0.5M의 농도가 가장 알맞은 농도로 나타났으나 ICPMS를 이용한 분석에서는 셀레늄과의 동시 정량을 실시하여야 하므로 3M의 HCl을 사용하는 것이 HVG mini torch ICPMS를 이용한 분석 시 최적의 농도 조건으로 나타났다.
- 2%로 회수율이 가장 높게 나타났다. 셀레늄의 경우 HNO3 43.8%, HNO3-H2O2 52.5%, HNO3-H2SO4 76.3%, HNO3-HClO4가 98.5% 로 게르마늄 보다는 높은 회수율의 경향을 보였으며, 게르마늄의 경우와 같이 HNO3-HClO4에서 가장 우수한 회수율이 나타났다.
- 수소화물생성장치를 이용하여 수소화물을 생성시킬 때 알맞은 산은 높은 산성에서 환원성을 갖는 HCl으로 나타났으며, HCl의 농도는 게르마늄은 0.5 M, 셀레늄은 3 M 이었다. 게르마늄과 셀레늄의 동시정량에는 3 M의 HCl을 사용하는 것이 mini torch 유도결합 플라스마질량분석기를 사용하는데 최적의 분석조건임을 알 수 있었다.
- 수소화물생성장치와 mini torch 유도결합플라스마 질량분석기를 이용한 게르마늄과 셀레늄의 동시정량에서 수소화물 생성 시 환원제로 사용되는 NaBH4의 최적농도는 0.4%로 나타났으며, 안정제로 사용되는 NaOH 농도는 0.4%를 사용하는 것이 최적조건으로 나타났다.
- 시료 전처리에 HNO3와 HNO3-H2O2은 유기물이 완전히 분해되지 않는 것으로 확인되었으며, HNO3-H2SO4는 전처리에 시간이 많이 소비되고 유도결합플라스마질량분석기 사용 시 polyatomic 이온과 2차 방전이온을 생성하는 것으로 나타나, HNO3-HClO4를 이용하는 것이 상추 등의 식물체의 분해에 가장 적합한 처리 방법으로 제안할 수 있다.
- 이러한 결과를 토대로 HVG mini torch ICPMS를 이용하여 게르마늄과 셀레늄의 동시정량 분석에는 HNO3-HClO4를 이용한 시료 전처리방법으로 제안할 수 있다.
- 이상의 각 회화방법의 장단점의 결과를 토대로 상추 중의 휘발성 원소인 게르마늄과 셀레늄의 전처리 방법은 성분의 손실이 적고 시간소요가 적은 습식회화법이 가장 알맞은 것으로 나타나 시료의 분해에는 습식회화방법을 적용하였다.
- 이상의 결과에서 HVG-ICPMS를 이용하여 상추중의 게르마늄과 셀레늄의 동시정량 분석에 시료 전처리는 HNO3-HClO4를 이용하고 ICPMS 이용 시 Cl의 간섭현상을 피하기 위해서는 수소화물생성장치를 이용하는 이 분석의 최적조건 임을 알 수 있었다.
후속연구
- 이러한 결과를 토대로 ICPMS의 분석에 H2SO4을 사용하는 것은 poly atomic ion의 형성으로 인한 Spectral 간섭으로 인하여 분석에 영향을 끼칠 수 있어 사용을 피해야 할 것으로 사료된다.
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