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문제 정의
- . 活血化瘀劑가운데 하나인 疎經活血湯에 관한 실험적 연구로는 김20), 이21)의 消炎 鎭痛에 관한 硏究외에는 보고된 바가 없는 실정으로 이에 저자는 疎經活血湯의 농도에 따라 신경병증성 통증에 어떠한 영향을 미치는가를 실험적으로 규명하기 위하여 L5 spinal nerve 결찰모델에 疎經活血湯 검액 추출물을 경구 투여한 후 통각역치(von Frey filament, Hot plate test) 및 c-fos 단백발현에 미치는 영향을 관찰한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 말초 신경병증성 통증 모델에서 疎經活血湯의 농도별 진통효과를 알아보고자 행동반응평가 및 면역조직화학적 검사를 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 고정된 실험동물로부터 좌골신경(sciatic nerve)이 분지되는 요척수 영역을 분리한 후, 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 후고정을 실시하였다. L4, L5 요척수 부위를 취하여 에탄올을 이용한 탈수(dehydration)과정과 자일렌(xylene)을 이용한 청명(cleaning)과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하였다. 제작된 파라핀 블록(paraffin block)은 미세절단기(Sakura 2040, Japan)을 이용하여 5 ㎛두께로 절단 후 슬라이드를 제작하였다.
- 검액의 구강 투여는 oral zonde needle(Natsume, Japan)을 사용하여, 해당 농도로 3 ㎖씩 1일 1회 3주간 시행하였다.
- 9% NaCl 용액으로 관류 수세하였고, 혈액이 제거된 후에 4% 중성 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류하여 조직 전고정을 실시하였다. 고정된 실험동물로부터 좌골신경(sciatic nerve)이 분지되는 요척수 영역을 분리한 후, 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 후고정을 실시하였다. L4, L5 요척수 부위를 취하여 에탄올을 이용한 탈수(dehydration)과정과 자일렌(xylene)을 이용한 청명(cleaning)과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하였다.
- ) 넣고 바닥에서 35 ㎝ 높게 설치한 후 그 아래에 경사거울을 설치하여 동물의 행동반응을 효과적으로 관찰할 수 있도록 하였다. 기계적 자극은 von Frey filaments(North Coast Medical Inc, USA)를 수직 방향으로 세워 신경 손상을 유발한 우측 발 제 3중족골 부위에 자극하였으며, 1.0, 1.4, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 15.0 및 26.0 g의 bending force를 갖는 von Frey filaments로 각각 5회 자극할 때 적어도 3회 이상 능동적으로 발을 회피하는 반응을 유발하는 최소한의 bending force를 찾아서 기계적 자극에 대한 회피반응 역치(paw withdrawal mechanical threshold: PWT, g)로 하였다21). von Frey filaments의 bending force가 백서 체중의 10%를 초과하면 능동적인 회피반응이 아니라 발과 다리 전체를 수동적으로 밀어올리는 결과를 초래하기 때문에 26.
- 을 이용하였다. 럼푼(Rompun, 바이엘 코리아)과 염산 케타민(Ketamine HCL, 유한양행)을 1:1로 혼합하여 복강내 주사(3 ㎖/㎏)하여 마취시킨 후 요추부위 척추를 따라 정중선을 절개한 후 주위 근육을 젖혀 한쪽의 L5 및 L6 요수신경을 노출시켰다. 이 신경들을 6-0 견사(skil thread)로 묶어 결찰(tight ligation)시킴으로써 손상을 준 다음 근육과 피부를 다시 봉합하였다.
- 말초 신경병증성 통증에 疎經活血湯의 농도별 진통 효과 검정을 위해 신경병증 모델 유발 21일 후 백서를 희생하여 척수를 적출하여 조직절편을 제작한 다음 통증지표물질인 c-fos에 대한 면역조직화학 염색법을 실시하여 각 군의 발현 양상을 비교 관찰하였다. 대조군에서는 면역반응이 비교적 뚜렷하게 관찰되는 반면, 실험군 Ⅰ은 다소 감소된 양상을 보인 보였으나 실험군 Ⅱ와 Ⅲ은 현저히 감소된 양상을 보였고, 특히 실험군 Ⅲ은 면역반응이 거의 보이지 않았다(Fig.
- 박절한 조직절편은 phosphate buffered saline (PBS)으로 여러 번 세척한 후 남아 있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 1 % sodium borohydride로 1시간 처리하였다. 면역조직화학염색을 위한 전처리과정으로 0.3%의 과산화수소용액에 20분간 처리하였다. 다시 PBS로 여러번 세척한 후 Novostain Super ABC Kit (Novocastra Lab.
- 발색을 위해 DAB (Serotec Ltd, BUF021B, UK)에 10분간 적용 후 Mayer's Hematoxyline (Sigma, MHS-32, USA)으로 대조염색(counterstaining)을 실시하였으며, 흐르는 물에 5분간 수세하고 슬라이드 표본을 건조시킨 후 통상의 탈수과정을 거쳐 관찰할 수 있도록 봉입하였다.
- 백서는 바닥이 그물 철망으로 된 아크릴 상자(20 × 25 × 13 cm3) 넣고 바닥에서 35 ㎝ 높게 설치한 후 그 아래에 경사거울을 설치하여 동물의 행동반응을 효과적으로 관찰할 수 있도록 하였다.
- Hematoxyline 용액에 5분간 핵 염색 후 다시 수세하여 Eosin 용액으로 3분간 세포질 염색을 실시하였으며, 알코올 농도 순으로 탈수과정을 거친 후 Xylene을 이용한 청명과정을 거친 다음, 봉입을 실시하였다. 봉입한 조직을 광학현미경(Olympus BX 50, OIympus Optical Co., Japan)을 이용하여 간 조직의 이상 유무를 관찰하였다.
- 발색을 위해 DAB (Serotec Ltd, BUF021B, UK)에 10분간 적용 후 Mayer's Hematoxyline (Sigma, MHS-32, USA)으로 대조염색(counterstaining)을 실시하였으며, 흐르는 물에 5분간 수세하고 슬라이드 표본을 건조시킨 후 통상의 탈수과정을 거쳐 관찰할 수 있도록 봉입하였다. 봉입한 조직을 광학현미경(Olympus BX 50, OIympus Optical Co., Japan)을 이용하여 척수 부위에서 발현된 c-fos를 관찰하였다.
- 실험 종료 후 심장천자를 통해 혈액 3 ㎖를 채혈하여 고속원심분리기로 10분간 3,500 rpm에서 원심분리하여 혈청을 취득 후 AST(asparatate transaminase)와 ALT(alanine transaminase)의 활성도 분석을 위한 시역(ELITECH, Division of SEPPIM SA. France)으로 생화학 분석기(RM 2060-18, Eltec Co., Italy)를 사용하여 측정하였다.
- 실험군 설정은 총 4개 군으로 신경병증성 통증 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군(Con, n=6), 신경병증성 통증 유발 후 검액 100 ㎎/㎏ 구강투여 Ⅰ군(SKWHT-OA1, n=6), 신경병증성 통증 유발 후 검액 300 ㎎/㎏ 구강투여 Ⅱ군(SKWHT-OA2, n=6), 신경병증성 통증 유발 후 검액 500 ㎎/㎏ 구강투여 Ⅲ군(SKWHT-OA3, n=6)으로 체중 대비 저, 중, 고농도로 각각 나누었다(Table 2).
- 실험종료가 되는 21일째에 실험에 사용된 동물을 개복하여 간조직의 손상유무를 관찰하기 위해 통상적인 H&E 염색을 실시하였다.
- 열성 통각과민반응 평가는 Plantar Test®을 사용하였고, 실험동물은 아크릴 상자(20 × 25 × 13 cm3)에 넣어 5분간 안정을 시킨 후 신경 손상을 유발한 우측 발 아래에 적외선 열방사 장치(열원 50 ℃, 족저부 아크릴판 전도열 46 ℃)를 위치시켜 회피반응을 보이기까지의 시간을 0.1초 단위로 측정하여 5분 간격으로 2회 반복회피반응의 잠복기를 구하였다.
- Korea)로 동결 건조시켜 분말로 얻었다. 제조된 疎經活血湯 분말 100, 300, 500 ㎎/㎏을 각각 3차 증류수에 용해하여 1일 1회 주 5회로 총 3주간 동일 시각에 경구 투여하였다.
- 진통 효과 검정을 위한 c-fos 단백질 발현 정도를 관찰하기 위해 면역조직화학 염색을 실시하였다. 박절한 조직절편은 phosphate buffered saline (PBS)으로 여러 번 세척한 후 남아 있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 1 % sodium borohydride로 1시간 처리하였다.
- 통증 유발 21일 후 각 군당 6마리씩을 전신 마취제인 럼푼(Rompun, 바이엘코리아)으로 복강주사(0.6 ㎎/㎏)하여 마취한 후, 심장관류를 통해 0.9% NaCl 용액으로 관류 수세하였고, 혈액이 제거된 후에 4% 중성 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류하여 조직 전고정을 실시하였다. 고정된 실험동물로부터 좌골신경(sciatic nerve)이 분지되는 요척수 영역을 분리한 후, 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 후고정을 실시하였다.
- 실험군 설정은 총 4개 군으로 신경병증성 통증 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군(Con, n=6), 신경병증성 통증 유발 후 검액 100 ㎎/㎏ 구강투여 Ⅰ군(SKWHT-OA1, n=6), 신경병증성 통증 유발 후 검액 300 ㎎/㎏ 구강투여 Ⅱ군(SKWHT-OA2, n=6), 신경병증성 통증 유발 후 검액 500 ㎎/㎏ 구강투여 Ⅲ군(SKWHT-OA3, n=6)으로 체중 대비 저, 중, 고농도로 각각 나누었다(Table 2). 행동반응평가를 위한 통각역치평가(유발 전, 유발 1, 4, 7, 14, 21일 후)와 c-fos 단백 발현(21일 후)을 통한 면역조직 화학 염색을 실시하였고, 실험 종료 후 GPT와 GOT 측정을 실시하였다.
- 1초 단위로 측정하여 5분 간격으로 2회 반복회피반응의 잠복기를 구하였다. 회피반응의 잠복기는 열 자극을 가한 시간부터 회피가 일어나는 시간으로 하였고, 조직 손상 때문에 장치의 cut-off 시간은 30초로 하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 한약재는 시중 건재상에서 구입 정선한 것을 사용하였으며, 처방은 萬病回春에 기록된 疎經活血湯으로 내용과 용량은 다음과 같다(Table 1).
- L4, L5 요척수 부위를 취하여 에탄올을 이용한 탈수(dehydration)과정과 자일렌(xylene)을 이용한 청명(cleaning)과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하였다. 제작된 파라핀 블록(paraffin block)은 미세절단기(Sakura 2040, Japan)을 이용하여 5 ㎛두께로 절단 후 슬라이드를 제작하였다.
- 체중이 약 250±50 g의 Sprague-Dawley계 백서(8주령, 웅성, 대한실험동물)를 항온 항습(실내온도는 25±1℃, 습도 55±10%)이 유지되는 사육실에서 고형사료(삼양주식회사, Korea)와 물을 자유롭게 먹도록 공급하면서, 1주일 이상 사육실 및 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 이용하였다.
데이터처리
- All values are showed mean±S.D. Ⅰ: SKWHT-OA1(100 ㎎/㎏), Ⅱ: SKWHT-OA2(300 ㎎/㎏), Ⅲ: SKWHT-OA3(500 ㎎/㎏), Tested by one-way ANOVA(*: p<0.05, **: p<0.01) and Tukey's multiple range test.
- Tested by one-way ANOVA(*: p<0.05, **: p<0.01) and Tukey's multiple range test.
- Tested by one-way ANOVA(*: p<0.05, **: p<0.01) and Tukey's multiple range test.
- for Windows®을 사용하였다. 각 집단간 행동반응 결과 값의 측정시기에 따른 차이를 확인하기 위하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 시행하였고, 사후검정(post hoc)으로 Tukey`s multiple range test를 실시하였다. 분석 시 유의수준은 α=0.
이론/모형
- 말초신경병증성 통증 모델은 Kim 및 Chung의 방법22)을 이용하였다. 럼푼(Rompun, 바이엘 코리아)과 염산 케타민(Ketamine HCL, 유한양행)을 1:1로 혼합하여 복강내 주사(3 ㎖/㎏)하여 마취시킨 후 요추부위 척추를 따라 정중선을 절개한 후 주위 근육을 젖혀 한쪽의 L5 및 L6 요수신경을 노출시켰다.
성능/효과
- . 疎經活血湯 투여 21일 후에 각 군에 대한 척수후각에서의 통증지표 물질인 c-fos 단백발현을 비교 관찰 한 결과, 대조군에 비해 실험군 Ⅱ, Ⅲ군에서 면역반응이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 특히, 대조군에 비해 SKWHT-OA3(500 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅲ에서 가장 많은 감소를 관찰할 수 있었는데, 이는 말초신경 손상에 의한 발생하는 통증 전달 물질인 c-fos의 발현이 가장 많이 감소한 결과로, 기계적 및 열적 통각 역치 검사와 일치하는 결과이다.
- 통증지표 물질인 c-fos의 면역조직화학적 검사 결과, 다소 감소된 양상을 보이는 저농도(100 ㎖/㎏) 투여Ⅰ군에 비해 중농도(300 ㎖/㎏) 투여Ⅱ군과 고농도(500 ㎖/㎏) 투여Ⅲ군에서는 현저히 감소된 양상을 보였고, 특히 고농도 투여군에서는 면역반응이 거의 보이지 않았다. 疎經活血湯 투여로 인한 간 손상 여부 판단을 위해 간 효소치인 AST와 ALT 측정 결과, 아무런 약물 처치를 하지 않은 대조군과 비교 시 유의한 차이를 보이지 않았고, 간조직의 형태학적 검사 결과에서도 정상소견을 보였다.
- 疎經活血湯의 농도별 구강 투여 21일 후 간조직에 미치는 형태학적 변화를 살펴본 결과, 대조군 및 각 실험군 모두에서 간조직 중심정맥을 중심으로 간세포삭(hepatic cell cord)이 잘 배열되어 있고, 문맥역(portal area)을 중심으로 한 전형적인 간 소엽구조가 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 疎經活血湯 투여가 간을 손상시키지 않았음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 말초 신경병증성 통증에 疎經活血湯의 농도별 진통 효과 검정을 위해 신경병증 모델 유발 21일 후 백서를 희생하여 척수를 적출하여 조직절편을 제작한 다음 통증지표물질인 c-fos에 대한 면역조직화학 염색법을 실시하여 각 군의 발현 양상을 비교 관찰하였다. 대조군에서는 면역반응이 비교적 뚜렷하게 관찰되는 반면, 실험군 Ⅰ은 다소 감소된 양상을 보인 보였으나 실험군 Ⅱ와 Ⅲ은 현저히 감소된 양상을 보였고, 특히 실험군 Ⅲ은 면역반응이 거의 보이지 않았다(Fig. 3)
- 疎經活血湯의 농도별 구강 투여 21일 후 간조직에 미치는 형태학적 변화를 살펴본 결과, 대조군 및 각 실험군 모두에서 간조직 중심정맥을 중심으로 간세포삭(hepatic cell cord)이 잘 배열되어 있고, 문맥역(portal area)을 중심으로 한 전형적인 간 소엽구조가 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 疎經活血湯 투여가 간을 손상시키지 않았음을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 이러한 이질통, 통각과민 등의 통증과 관련된 증상을 중(300 ㎖/㎏), 고농도(500 ㎖/㎏)의 疎經活血湯 투여 시 진통효과가 있음을 규명할 수 있었다. 또한, 간조직이 손상되었는지 살펴보기 위하여 각 실험군의 혈청 GPT, GOT 수치를 알아본 결과, 대조군 및 실험군 모두 疎經活血湯 투여로 인한 손상이 없는 것으로 나타났고, 간조직의 형태학적 소견 상 중심정맥을 중심으로 간세포삭(hepatic cell cord)의 배열과 문맥역(portal area)을 중심으로 소엽구조가 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 또한, 열적 통각 역치 측정에서도 유발 4일과 21일에서 유의한 차이를 나타냈고, 유발 14일에서는 대조군에 비해 SKWHT-OA3(500 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅲ에서 유의한 차이를 나타냈고(p<0.05), 유발 21일에서는 대조군에 비해 SKWHT-OA2(300 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅱ(p<0.05)와 SKWHT-OA3(500 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅲ(p<0.05)에서 각각 유의한 차이를 나타냈다.
- 말초 신경병증성 통증 모델에서 기계적, 열적 자극에 따른 통각과민반응 결과, 중농도(300 ㎖/㎏) 투여Ⅱ군은 유발 21일째에, 고농도(500 ㎖/㎏) 투여Ⅲ군은 유발 14일째부터 유의한 효과를 나타냈으며, 고농도 투여군에서 가장 강한 진통효과를 나타냈다. 통증지표 물질인 c-fos의 면역조직화학적 검사 결과, 다소 감소된 양상을 보이는 저농도(100 ㎖/㎏) 투여Ⅰ군에 비해 중농도(300 ㎖/㎏) 투여Ⅱ군과 고농도(500 ㎖/㎏) 투여Ⅲ군에서는 현저히 감소된 양상을 보였고, 특히 고농도 투여군에서는 면역반응이 거의 보이지 않았다.
- 먼저, 기계적 통각 역치 측정에서는 유발 14일과 21일에서 유의한 차이를 나타냈고, 유발 14일에서는 말초신경병증성 통증유발 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군에 비해 SKWHT-OA3(500 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅲ에서 유의한 차이를 나타냈고(p<0.05), 유발 21일에서는 대조군에 비해 SKWHT-OA2(300 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅱ(p<0.05)와 SKWHT-OA3(500 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅲ(p<0.01)에서 각각 유의한 차이를 나타냈다.
- 간 효소치인 AST와 ALT는 간세포에 다량 존재하는 효소로 간 손상시 세포 외로 다량 유출되어 혈액에 증가됨으로서 간 손상의 지표로 이용되는 효소이다. 실험 종료 후 획득한 혈청 분석결과, AST와 ALT에서 모두 대조군에 비해 각 실험군이 다소 증가하는 경향을 보였으나 유의한 차이는 보이지 않아 간에 손상을 미치지 않았음을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 말초신경 손상으로 인한 신경병증성 통증에 중(300 ㎖/㎏), 고농도(500 ㎖/㎏)의 疎經活血湯 투여 시 강력한 진통효과를 발휘하였고, 고농도 투여는 더욱 강하며, 지속적인 진통 작용이 있는 것으로 생각된다. 이는 약물의 특성 상 經을 疎開하고 通理하며, 滯血과 瘀血을 풀고 活氣 및 行血을 시키며 風濕을 驅逐함으로서 疎經, 活血, 行濕하는 効能이 있는 것으로 생각된다.
- 진통 효과 검정을 위하여 기계적 자극에 따른 통각과민반응에 대한 일원 분산분석에서 말초 신경병증성 통증 유발 전, 유발 1, 3, 7일 후까지는 모든 군 간 차이가 없었으나, 유발 14일(p<0.05)과 유발 21일(p<0.01)에서 각각 군간 차이를 나타내었다.
- 진통 효과 검정을 위하여 열적 자극에 따른 통각과민반응에 대한 일원 분산분석에서 말초 신경병증성 통증 유발 전, 유발 1, 3, 7일 후까지는 모든 군 간 차이가 없었으나, 유발 14일(p<0.05)과 유발 21일(p<0.01)에서 각각 군간 차이를 나타내었다.
- 말초 신경병증성 통증 모델에서 기계적, 열적 자극에 따른 통각과민반응 결과, 중농도(300 ㎖/㎏) 투여Ⅱ군은 유발 21일째에, 고농도(500 ㎖/㎏) 투여Ⅲ군은 유발 14일째부터 유의한 효과를 나타냈으며, 고농도 투여군에서 가장 강한 진통효과를 나타냈다. 통증지표 물질인 c-fos의 면역조직화학적 검사 결과, 다소 감소된 양상을 보이는 저농도(100 ㎖/㎏) 투여Ⅰ군에 비해 중농도(300 ㎖/㎏) 투여Ⅱ군과 고농도(500 ㎖/㎏) 투여Ⅲ군에서는 현저히 감소된 양상을 보였고, 특히 고농도 투여군에서는 면역반응이 거의 보이지 않았다. 疎經活血湯 투여로 인한 간 손상 여부 판단을 위해 간 효소치인 AST와 ALT 측정 결과, 아무런 약물 처치를 하지 않은 대조군과 비교 시 유의한 차이를 보이지 않았고, 간조직의 형태학적 검사 결과에서도 정상소견을 보였다.
- 疎經活血湯 투여 21일 후에 각 군에 대한 척수후각에서의 통증지표 물질인 c-fos 단백발현을 비교 관찰 한 결과, 대조군에 비해 실험군 Ⅱ, Ⅲ군에서 면역반응이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 특히, 대조군에 비해 SKWHT-OA3(500 ㎖/㎏)을 투여한 실험군 Ⅲ에서 가장 많은 감소를 관찰할 수 있었는데, 이는 말초신경 손상에 의한 발생하는 통증 전달 물질인 c-fos의 발현이 가장 많이 감소한 결과로, 기계적 및 열적 통각 역치 검사와 일치하는 결과이다. 이러한 이질통, 통각과민 등의 통증과 관련된 증상을 중(300 ㎖/㎏), 고농도(500 ㎖/㎏)의 疎經活血湯 투여 시 진통효과가 있음을 규명할 수 있었다.
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