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문제 정의
- 그러나 한약재를 피부에 적용하기 위한 효능, 효과를 검증하는 연구는 다양하게 이루어지고 있으나 전통 한약탕제인 생약복합제제의 약효에 대한 연구와 기능성 소재 및 화장품 산업의 응용에 대한 추출물의 안전성에 대한 연구가 진행되어 있지 않은 실정이다. 따라서 전통적인 한약탕제로서 항산화, 항균에 효능이 있는 것으로 보고된 단삼사물탕과 삼황사심탕의 추출물을 피부에 적용할 경우 안전한가 여부를 평가하기 위하여 안전성 시험을 실시하였다.
- 따라서 전통적인 한약탕제로서 항산화, 항균에 효능이 있는 것으로 보고된 단삼사물탕과 삼황사심탕의 추출물을 화장품의 원료로 사용될 수 있도록 하기 위해서는 단회투여독성 및 피부에 대한 안전성이 확보되어야 한다. 본 시험에서는 단삼사물탕과 삼황사심탕을 피부에 적용할 경우 안전한가 여부를 평가하는 것이 목적이며, 이미 보고된 단회투여독성12) 외에 피부일차자극, 안점막자극, 피부감작성 유발여부에 대해 보고하고자 하였다.
제안 방법
- 안검사를 통해 각막 손상 등 안구에 이상이 없는 동물을 선별한 후, 임상 및 체중 증가 등에 이상이 없으며 상태가 양호한 건강한 동물을 군 분리 당일의 체중과 주령을 기초하여 무작위 법으로 각 군의 평균체중이 균등하도록 군을 구성하였다. 각 물질당 4 리씩 할당하여 오른쪽 눈엔 시험물질을 점안하고, 왼쪽 눈의 경우 2마리는 세척군, 2마리는 무처치 대조안으로 사용하였다. 시험물질 1%를 안구당 0.
- 본 실험에 사용한 단삼사물탕과 삼황사심탕은 동의보감에 수록된 내용에 준하여 조제하였으며, 시료로 사용된 약재는 경북 영천 소재의 옴니허브(주)에서 구입하여 물로 세척하여 음건 후 사용하였다. 단삼사물탕은 숙지황(6 g), 백작약(6 g), 천궁(6 g), 당귀(6 g), 단삼(16 g)을 구성비로, 삼황사심탕은 대황(42.8 g), 황련(28.6 g), 황금(28.6 g)을 구성비로 개량한 다음 시료 중량 대비 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 동안 교반 추출하고, 추출 후 상등액과 침전물을 분리하였으며, 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물을 여과, 농축하여 동결건조한 후 10% 에탄올에 녹여 각 시험에 사용하였다.
- 동물은 온도 23±3℃, 습도 50±10%, 환기회수 15회/hr, 조도 150～300Lux, 명암주기 12시간(오전 8시～오후 8시)으로 조절되는 환경에서 사육하였다.
- 본 시험에서 1차 감작은 제모된 기니픽의 견갑 간부에 시험물질, Freund's complete adjuvant (FCA) 및 FCA와 시험물질 혼합물을 2열로 0.1 mL 씩 피내주사 하였다.
- 제모한 부위는 2×2 cm 크기의 4부위를 확보한 후, 척추를 중심으로 왼쪽은 시험물질 적용부위, 오른쪽은 대조물질(10% 에탄올) 적용 부위로 하였으며, 각 적용 부위는 각각 찰과 부위와 비찰과 부위를 두어 실험을 실시하였다. 시험물질당 4 리의 토끼를 할당하였으며, 각 1% 농도로 조제하여 각 부위당 0.5 mL씩 도포한 후 24시간 폐쇄첩포하였다. 시험물질 적용부위는 24시간째와 72시간째에 관찰을 하며 피부 반응의 평가는 「의약품등의 독성시험기준」 (식품의약품안전청 고시 제2009-116호)13)의 “피부반응의 평가기준”에 따라 평점으로 평가하였다.
- 안검사를 통해 각막 손상 등 안구에 이상이 없는 동물을 선별한 후, 임상 및 체중 증가 등에 이상이 없으며 상태가 양호한 건강한 동물을 군 분리 당일의 체중과 주령을 기초하여 무작위 법으로 각 군의 평균체중이 균등하도록 군을 구성하였다. 각 물질당 4 리씩 할당하여 오른쪽 눈엔 시험물질을 점안하고, 왼쪽 눈의 경우 2마리는 세척군, 2마리는 무처치 대조안으로 사용하였다.
- 적용부위는 시험물질 점안 후 1시간, 24시간, 48시간, 72시간째와 4일, 7일째에 관찰을 하였고 안점막 반응의 평가는 「의약품등의 독성시험기준」의 “안구 병변의 등급”에 따라 평점으로 평가하였다.
- 제모한 부위는 2×2 cm 크기의 4부위를 확보한 후, 척추를 중심으로 왼쪽은 시험물질 적용부위, 오른쪽은 대조물질(10% 에탄올) 적용 부위로 하였으며, 각 적용 부위는 각각 찰과 부위와 비찰과 부위를 두어 실험을 실시하였다.
- 5 cm의 패치테이프로 덮은 뒤 48시간 동안 폐쇄첩포하였다. 첩포 10일 후 피부 1차 자극에서 자극이 관찰되지 않은 농도로 24시간 폐쇄첩포하여 피부 홍반, 부종을 관찰하였다. 관찰 결과 양성율이 29% 이상인 경우 sensitizer로 판정하였다.
- 한방처방제인 단삼사물탕과 삼황사심탕을 피부적용제로의 활용을 위해, 에탄올로 추출하여 감압농축한 후 동결건조시켜서 10% 에탄올에 녹여, 피부관련 안전성 평가를 실시 하였다. 시험 결과 1%의 단삼사물탕 및 삼황사심탕은, 피부 적용물질의 경우 요구되는 안전성 평가 항목인 피부일차자극시험, 안점막자극시험 및 피부감작성시험에서 모두 무자극 범주로 평가되어, 본 시험물질은 1%의 농도에서 피부에 적용하는 화장품의 원료로 사용 가능하리라 판단된다.
대상 데이터
- 시험 전기간동안 사료(Purina Korea)와 음수는 자유급식시켰으며, 사료의 오염성적서는 년 2회씩 정기적으로 구입처에서 받아 시험에 영향을 줄 오염원이 없음을 확인하였다. 모든 실험동물은 일주일간 검역 및 적응기간을 갖고 이 기간동안 체중증가 및 일반 증상에 이상이 없는 건강한 동물만 실험에 사용하였다.
- 본 시험에는 단삼사물탕과 삼황사심탕 각각을 에탄올로 추출하여 감압농축한 후 동결건조시켜서 10% 에탄올에 녹여 시험 물질로 사용하였다. 1%의 단삼사물탕 및 삼황사심탕으로 안전성 시험을 하는 기간동안 시험물질에 기인한 체중변화, 임상증상, 폐사 등은 관찰되지 않았다.
- 본 시험에서 사용한 동물(마우스, 토끼 및 기니픽)은 샘타코 바이오코리아에서 구입하였다. 동물은 온도 23±3℃, 습도 50±10%, 환기회수 15회/hr, 조도 150～300Lux, 명암주기 12시간(오전 8시～오후 8시)으로 조절되는 환경에서 사육하였다.
- 본 실험에 사용한 단삼사물탕과 삼황사심탕은 동의보감에 수록된 내용에 준하여 조제하였으며, 시료로 사용된 약재는 경북 영천 소재의 옴니허브(주)에서 구입하여 물로 세척하여 음건 후 사용하였다. 단삼사물탕은 숙지황(6 g), 백작약(6 g), 천궁(6 g), 당귀(6 g), 단삼(16 g)을 구성비로, 삼황사심탕은 대황(42.
- 토끼(New Zealand White rabbit)의 등부위 털을 가로세로 약 10 cm 정도의 크기로 제모하여 피부의 상태가 양호한 8마리의 토끼를 실험에 사용하였다. 제모한 부위는 2×2 cm 크기의 4부위를 확보한 후, 척추를 중심으로 왼쪽은 시험물질 적용부위, 오른쪽은 대조물질(10% 에탄올) 적용 부위로 하였으며, 각 적용 부위는 각각 찰과 부위와 비찰과 부위를 두어 실험을 실시하였다.
이론/모형
- 시험물질 적용부위는 24시간째와 72시간째에 관찰을 하며 피부 반응의 평가는 「의약품등의 독성시험기준」 (식품의약품안전청 고시 제2009-116호)13)의 “피부반응의 평가기준”에 따라 평점으로 평가하였다. 결과에 대한 자극성의 정도판정은 일반적으로 많이 이용되는 Draize15)의 Primary Irritation Index(P.I.I.)의 산출 방법에 따랐다.
- 본 시험에 사용된 모든 시험방법은 「의약품등의 독성시험 기준」 (식품의약품안전청 고시 제2009-116호)13), 「기능성화장품 등의 심사에 관한 규정」 (식품의약품안전청 고시 제2009-166호)14) 및 「비임상시험관리기준」 에 준하여 실시하였다. 본 연구는 계명대학교 동물실험윤리위원회 원칙에 맞게 수행하였다.
- 시험물질 적용부위는 24시간째와 72시간째에 관찰을 하며 피부 반응의 평가는 「의약품등의 독성시험기준」 (식품의약품안전청 고시 제2009-116호)13)의 “피부반응의 평가기준”에 따라 평점으로 평가하였다.
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6. 피부감작성 시험
시험물질에 대한 피부감작성 여부를 군당 암수 5마리의 Hartley Albino guinea pig (250～300 g)을 이용하여 Guinea Pig Maximization Test (GPMT)법에 따라 실시하였다16). 감작성 시험전 암수 각각 1마리를 이용, 피부 1차 자극 시험을 실시하여 challenge 농도에서 피부자극이 없음을 미리 확인하였다.
성능/효과
- . 감작성 시험전 암수 각각 1마리를 이용, 피부 1차 자극 시험을 실시하여 challenge 농도에서 피부자극이 없음을 미리 확인하였다. 본 시험에서 1차 감작은 제모된 기니픽의 견갑 간부에 시험물질, Freund's complete adjuvant (FCA) 및 FCA와 시험물질 혼합물을 2열로 0.
- 첩포 10일 후 피부 1차 자극에서 자극이 관찰되지 않은 농도로 24시간 폐쇄첩포하여 피부 홍반, 부종을 관찰하였다. 관찰 결과 양성율이 29% 이상인 경우 sensitizer로 판정하였다.
- 단삼사물탕과 삼황사심탕의 에탄올 추출물을 감압농축하여 동결건조한 시료를 10% 에탄올에 1%되게 녹여 본 실험에 시험 물질로 사용한 결과 시험기간 동안 시험물질에 기인한 체중변화, 임상증상, 폐사 등은 관찰되지 않았으며(data not shown), 피부 1차 자극 결과 판정표에 준하여 홍반, 가피형성 및 부종형성을 관찰한 결과(Table 1, 2), 피부 1차 자극 지수는 단삼사물탕의 경우 0.06, 삼황사심탕의 경우 0.19로 무자극 범위에 속하는 수치를 나타내었다. 삼황사심탕의 경우는 24시간째에 일부 처치부위에서 약한 황색이 잔존하였으나 자극과는 무관하였다.
- GPMT에 의한 피부감작성시험 결과에서도 전혀 알러지가 관찰되지 않았다. 따라서 이상의 시험결과 단삼사물탕과 삼황사심탕은 피부에 적용될 경우 요구되는 모든 안전성 시험에서 매우 안전하다고 판단되며, 1%의 농도에서 화장품의 원료로 적용가능하리라 생각된다.
- 시험기간 동안 시험물질에 기인한 체중변화, 임상증상, 폐사 등은 관찰되지 않았으며(data not shown), 1%의 단삼사물탕과 삼황사심탕을 안구 점막에 투여한 후 일정기간 각막의 혼탁과 그 범위, 홍채의 반응, 결막의 발적, 부종, 배출물 정도의 자극 유무를 관찰한 결과(Table 3, 4) 단삼사물탕의 적용부위에서 비세안과 세안군의 경우 1시간째 약한 결막 발적이 관찰되었으나 24시간 이후에는 아무런 증상도 관찰되지 않았다. 삼황사심탕의 적용부위에서 나타난 약한 결막 발적은 비세안군의 경우 24시간 이후, 세안군의 경우 48시간 이후에는 정상적으로 회복되었다. 단삼사물탕과 삼황사심탕 처리구 모두에서 Acute Ocular Irritation (A.
- 한방처방제인 단삼사물탕과 삼황사심탕을 피부적용제로의 활용을 위해, 에탄올로 추출하여 감압농축한 후 동결건조시켜서 10% 에탄올에 녹여, 피부관련 안전성 평가를 실시 하였다. 시험 결과 1%의 단삼사물탕 및 삼황사심탕은, 피부 적용물질의 경우 요구되는 안전성 평가 항목인 피부일차자극시험, 안점막자극시험 및 피부감작성시험에서 모두 무자극 범주로 평가되어, 본 시험물질은 1%의 농도에서 피부에 적용하는 화장품의 원료로 사용 가능하리라 판단된다.
- 동물은 온도 23±3℃, 습도 50±10%, 환기회수 15회/hr, 조도 150～300Lux, 명암주기 12시간(오전 8시～오후 8시)으로 조절되는 환경에서 사육하였다. 시험 전기간동안 사료(Purina Korea)와 음수는 자유급식시켰으며, 사료의 오염성적서는 년 2회씩 정기적으로 구입처에서 받아 시험에 영향을 줄 오염원이 없음을 확인하였다. 모든 실험동물은 일주일간 검역 및 적응기간을 갖고 이 기간동안 체중증가 및 일반 증상에 이상이 없는 건강한 동물만 실험에 사용하였다.
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2. 안점막 자극시험
시험기간 동안 시험물질에 기인한 체중변화, 임상증상, 폐사 등은 관찰되지 않았으며(data not shown), 1%의 단삼사물탕과 삼황사심탕을 안구 점막에 투여한 후 일정기간 각막의 혼탁과 그 범위, 홍채의 반응, 결막의 발적, 부종, 배출물 정도의 자극 유무를 관찰한 결과(Table 3, 4) 단삼사물탕의 적용부위에서 비세안과 세안군의 경우 1시간째 약한 결막 발적이 관찰되었으나 24시간 이후에는 아무런 증상도 관찰되지 않았다. 삼황사심탕의 적용부위에서 나타난 약한 결막 발적은 비세안군의 경우 24시간 이후, 세안군의 경우 48시간 이후에는 정상적으로 회복되었다.
- 삼황사심탕의 경우는 24시간째에 일부 처치부위에서 약한 황색이 잔존하였으나 자극과는 무관하였다. 시험물질 및 용매 처지부위 중 찰과부위에서 24시간째에 일부 약한 홍반이 관찰되었으나 이는 물리적 자극에 의한 일시적인 자극으로 판단되며, 곧바로 정상으로 회복됨이 관찰되었다.
- 1%의 단삼사물탕 및 삼황사심탕으로 안전성 시험을 하는 기간동안 시험물질에 기인한 체중변화, 임상증상, 폐사 등은 관찰되지 않았다. 시험물질을 도포한 후 홍반, 가피형성 및 부종형성을 관찰한 결과 피부 1차 자극지수가 단삼사물탕 0.06, 삼황사심탕 0.19로서 무자극 범위에 해당되었다. 안점막시험에서도 단삼사물탕과 삼황사심탕에 A.
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