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문제 정의
- 生肌 등의 효능이 있어 痛經, 經閉, 胃脘痛, 風濕痺痛, 腸癰, 瘡癰久潰不斂 등의 병증을 치료하는 것으로 알려져 있으며1) 실험적으로 면역조절효과2,3), 세포고사 유도효과4,5) 등 다양한 효능이 있는 것6-9)으로 보고되고 있다. 본 논문에서 혈관염 발생에 중요한 역할을 하는 부착 단백 질인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현에 대한 乳香 추출물의 효과를 조사하였다.
- 乳香에 의한 VCAM-1의 발현 억제는 단백질뿐만 아니라 mRNA 수준에서도 나타났다. 본 실험의 결과로 乳香을 혈관염의 치료제로서 개발하는데 실험적 기초를 마련하였다 할 수 있으며 앞으로 혈관내피세포에서 DNA 수준에서의 乳香 추출물의 효과를 밝히고자 한다.
- 본 연구에서는 인체 내피세포(HUVEC)에서 세포 부착 분자의 생성에 대한 乳香 추출물(EO, extract of Olibanum)의 유의성있는 결과를 얻었기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 200 ㎍/㎖ 농도의 EO를 HUVEC 세포에 24시간 전처리한다음 6시간 TNF-α로 자극하고, 이들 세포로부터 mRNA를 분리하여 EO가 ICAM-1 및 VCAM-1 mRNA 발현에 미치는 효과를 RT-PCR 방법으로 조사하였다.
- 5 ㎍ RNA를 취하여 70℃에서 불활성화 시킨 다음 1X 1st strand buffer, 0.5 mM dNTP, 15 ㎍/μL Oligo(dT), 10 U/μL reverse transcriptase 및 2 U/μL RNase inhibitor와 혼합하여 42℃에서 40분 동안 reverse transcription(RT)을 수행하여 cDNA를 합성하고 다시 70℃에서 10분 동안 불활성화 시켰다.
- 0, 110 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, PMSF 100 ㎍/㎖)으로 용혈시킨 다음 원심분리하여 단백질을 얻었다. Bradford 분석방법을 이용하여 정량한 다음 60 ㎍을 취하여 동량의 sample buffer (125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol) 혼합한 다음 100℃에서 5분 동안 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 1.
- EO를 농도별로 HUVEC 세포에 24시간 전처리한 다음 TNF-α로 자극하고 24시간 후에 이들 세포를 ICAM-1 및 VCAM-1 항체로 각각 표지하여 세포부착분자들의 발현을 FACS 방법으로 조사하였다.
- HUVEC 세포에서 乳香 물 추출물 (EO)의 세포독성을 조사하였다. EO을 최소 50 ㎍/㎖에서 최대 200 ㎍/㎖까지 처리한 다음 24시간 후에 이들 세포를 CV 로 염색하여 세포독성 및 세포수를 확인하였다. Fig.
- HUVEC 세포 표면 부착 분자 (ICAM-1, VCAM-1)의 발현을 ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) kit를 이용하여 분석하였다. 모든 분석과정은 지침서의 순서에 따라 수행하였다.
- HUVEC 세포를 well당 1×105 개가 되도록 계측하여 4-well에 seeding한 다음 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하였다.
- HUVEC 세포에서 乳香 물 추출물 (EO)의 세포독성을 조사하였다. EO을 최소 50 ㎍/㎖에서 최대 200 ㎍/㎖까지 처리한 다음 24시간 후에 이들 세포를 CV 로 염색하여 세포독성 및 세포수를 확인하였다.
- ICAM-1 및 VCAM-1 유전자 발현을 확인하기 위하여 RT로부터 만든 cDNA를 1X PCR buffer, 0.2 mM dNTP, PCR primer 및 0.03 U/μL Taq Polymerase를 혼합하여 polymerase chain reaction (PCR, GeneAmp RNA PCR kit, erkin-Elmer Corp., Weiterstadt, Germany)을 시켜 분석하였다.
- PCR 수행시 온도 및 시간은 94℃/1 min (1cycle); 94℃/ 1 min, 57℃/40 sec, 70℃/ 40 sec (27 cycles); 72℃/7 min이었고 각각 primer는 ICAM-1 : sense 5‘-TGA AGG CCA CCC CAG AGG ACA AC-3’, antisense 5’ATT ATG ACT GCG GCT GCT GCT ACC-3’, VCAM-1 : sense 5’-CCC TTG ACC GGC TGG AGA TT-3’, antisense 5’-CTG GGG GCA ACA TTG ACA TAA AGT G-3’ 및 GAPDH sense 5‘-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3’, antisense 5’-GTT GTC ATG GAT GAC CTT GG-3’이었다. PCR 후 얻어진 생성물을 0.5 ㎍/㎖ EtBr (ethidium bromide)이 포함된 1.5% agarose gel 상에서 전기영동하여 각각 발현된 유전자의 band를 확인하였다.
- ICAM-1과 VCAM-1 및 β-actin에 대한 1차 항체 (primary antibody)를 3% skim milk/TBS-T에서 1:1,000 으로 희석하여 membrane과 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고 세척한 다음anti-mouse or goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 이차 항체(secondary antibody)를 1% skim milk/TBS-T에서 1:5,000으로 희석하여 membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 세척한다음 ECL reagent (ECL, Amersham, Buckinghamshire, England)로 발색시킨 다음 X-ray film에 감광시키는 방법으로 분석하였다.
- 8, 4% SDS 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol) 혼합한 다음 100℃에서 5분 동안 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 1.2% acrylamide gel에서 전기영동을 수행한 다음 nitrocellulose membrane (Amersharm Pharmacia 사)으로 전위시키고 5% skim milk/TBS-T로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. ICAM-1과 VCAM-1 및 β-actin에 대한 1차 항체 (primary antibody)를 3% skim milk/TBS-T에서 1:1,000 으로 희석하여 membrane과 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고 세척한 다음anti-mouse or goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 이차 항체(secondary antibody)를 1% skim milk/TBS-T에서 1:5,000으로 희석하여 membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시킨다.
- 자극 처리 후 70% Ethanol로 세포를 고정한 다음 PBS로 세척하고 SRB를 처리하여 상온에서 10분 동안 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 다시 PBS로 세척한 다음 형광현미경을 이용하여 조사하였다 (PALM, Microlaser Technologies, Bernried, Germany).
대상 데이터
- ICAM-1 및 VCAM-1 ELISA Kit는 R&D 사로부터 구입하여 사용하였다.
- 배양배지 (RPMI 1640), antibiotic/antimycotic 및 Trypsin-EDTA는 Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. SRB (Sulforrhodamine B)는 Molecular Probe 사(Willow Creek Re., OR, USA)로부터 그리고 FBS(fetal bovine serum)는 U.S. Bio-Technologies 사로부터 구입하여 사용하였다. TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) cytokine은 R&D(Minneapolis, MN, USA) 사로부터 구입하였고 ICAM-1(intracellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) cytokine은 R&D(Minneapolis, MN, USA) 사로부터 구입하였고 ICAM-1(intracellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Sodium bicarbonate 및 기본 시약들은 Sigma 사 (St. Louis, Missouri, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 모든 세포배양 용기 및 튜브는 Falcon 사 (Becton Dikinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) cytokine은 R&D(Minneapolis, MN, USA) 사로부터 구입하였고 ICAM-1(intracellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Louis, Missouri, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 모든 세포배양 용기 및 튜브는 Falcon 사 (Becton Dikinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. ICAM-1 및 VCAM-1 ELISA Kit는 R&D 사로부터 구입하여 사용하였다.
- 배양배지 (RPMI 1640), antibiotic/antimycotic 및 Trypsin-EDTA는 Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. SRB (Sulforrhodamine B)는 Molecular Probe 사(Willow Creek Re.
- 본 연구에 사용된 乳香은 원광대학교 익산 한방병원에서 구입하여 사용하였다. 유향 100 g과 3차 증류수 0.
- 인체 배꼽정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells ; HUVEC)를 Clonetics 사 (Cambrex Bio Science Rockland, USA)로부터 구입하여 10% FBS, antibiotic/antimycotic (100 U/㎖ penicillin, 25 ㎍/㎖ amphotericin D, 100 ㎍/㎖ streptomycin) 및 sodium bicarbonate가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 95% 공기, 5% CO2, 습기가 충분한 37℃의 대기로 배양하였다. 세포는 10 cm 배양접시에 2×106 개가 되도록 2-3일에 한 번씩 분주하여 배양하였다.
- 전체 RNA를 Trizol reagent (Gibco/BRL)를 이용하여 분리하고 Gene Quant (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)로 정량하였다. 5 ㎍ RNA를 취하여 70℃에서 불활성화 시킨 다음 1X 1st strand buffer, 0.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±S.D.로 표시하였으며 유의성 검정은 student's t-test에 의하였으며 p 값이 0.05 이하인 것만 유의성이 있는 것으로 하였다.
이론/모형
- EO를 농도별로 HUVEC 세포에 24시간 전처리한 다음 12시간 TNF-α로 자극하고, 이들 세포로부터 단백질을 분리하여 ICAM-1 및 VCAM-1 단백질 생성 정도를 Western blot 방법으로 조사하였다.
성능/효과
- 200 ㎍/㎖의 乳香 추출물을 24시간 혈관 내피세포(HUVEC)에 처리하였으나 어떤 독성도 관찰되지 않았으며 혈관내피세포의 ICAM-1 발현을 억제시키지 못했지만, VCAM-1 발현을 농도 및 전처리 시간 의존적으로 억제시켰다. 또한 乳香 추출물은 VCAM-1 단백질의 발현을 억제시켰으나 ICAM-1 발현억제에는 효과가 없었다.
- 2에 보인 결과와 같이 EO는 ICAM-1발현에 큰 변화를 주지 못했지만 VCAM-1 발현을 유의하게 감소시켰다. VCAM-1 발현 억제효과는 EO의 농도에 의존하고(Fig. 2B), EO의 전처리 시간에 의존함을 알 수 있었다(Fig. 3). EO의 VCAM-1 최대 억제효과는 농도 200 ㎍/㎖과 24시간 전처리 실험에서 관찰되었다.
- 본 실험에서 乳香 추출물은 TNF-α에 의하여 증가한 VCAM-1의 발현을 유의하게 억제하였다.
- 이상의 실험결과로부터 乳香은 혈관 내피세포의 염증성 VCAM-1 유전자 발현을 저해시켜 항염증 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
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