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문제 정의
- 이러한 근거에 따라 보스웰리아 추출물은 퇴행성 골관절 질환에 유의한 효과가 있을 것으로 사료되나 아직 이에 대한 기전적, 효능적 실험 연구는 미미한 실정이다. 이에 보스웰리아 추출물이 관절 질환에 미치는 효능을 실험적으로 검증하고 향후 기능성식품 소재의 개발을 위한 가능성을 확인하고자, 세포 수준에서 보스웰리아 추출물의 기전검증과 약물로 관절염을 유발한 rat에서 보스웰리아 추출물 섭취 효능을 관찰하여 검증하였다.
- 5-LO 효소는 류코트리엔 생합성 경로에 관여하는 핵심 효소로, 5-LO에 의해 생성된 류코트리엔은 면역조절, 천식, 염증 및 여러 알레르기성 증상에 관여하는 매개물질이다(28). 따라서 류코트리엔 생합성 경로의 핵심인 5-LO 효소의 활성 측정을 통해 보스웰리아 추출물의 효능을 검증하고자 하였다. Primary culture를 통해 얻은 rat의 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유발하고, 앞선 실험 결과에 따라 결정된 보스웰리아 추출물의 적정농도를 처리한 세포에서 5-LO 활성을 측정하였다.
- 또한 이들 cytokine에 의해 생성되는 COX-2 발현과 COX-2에 자극 받아 생성이 촉진되는 PGE2 생성을 확인한 결과 역시 20 μg/mL 농도에서 가장 효과적으로 생성이 억제되어 염증을 조절하는 것으로 나타났다. 특히 보스웰리아의 기능성분으로 알려진 보스웰릭산(boswellic acids)에 의해 억제되는 5-LO의 경우, 염증반응 유발의 핵심인자를 생성하는 효소로 알려져 있으며 이를 직접적으로 저해하는 것으로 알려진 보스웰리아의 효능을 확인하고자 실험을 진행하였다. 실험 결과 염증을 유도한 연골세포에서 보스웰리아 추출물의 처리에 따라 5-LO 활성이 감소하였으며, 이는 곧 보스웰리아 추출물이 염증을 유발 핵심 효소인 5-LO 활성을 효과적으로 억제함으로써 연골세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
제안 방법
- 실험동물에서 분리한 연골세포를 96-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM 배양액에 분주하여 12시간 동안 안정화시킨 후, 보스웰리아 추출물을 농도별로 처리하여 24시간(독성시험) 또는 2시간(H2O2 처리 후 세포재생시험) 동안 배양하였다.
- 3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 20 μL 처리하여 최대 3시간 37℃ incubator에서 배양한 후 배지와 MTT 시약을 제거하고, DMSO 시약 200 μL를 가하여 560 nm에서 ELISA reader(VERSAMAXSL-20, Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였으며 3회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준오차를 구하였다.
- 보스웰리아 추출물(Boswellia serrata extract: Wokvel TM, manufactured by Pharmanza India)은 (주)진용(수원, 한국)으로부터 분말 형태로 공급받아 실험에 사용하였다. 세포 실험을 위한 실험재료의 준비는 분말 형태의 보스웰리아 추출물을 0.2% 에탄올(Merk, Darmstadt, Germany)에 녹여 사용하였으며, 동물실험에 사용된 보스웰리아 식이는 주문 시에 분말 형태로 그대로 첨가하여 사용하도록 하였다.
- 연골 채취를 위한 실험동물은 4~6주령 무게 약 180~200g 정도의 male Sprague-Dawley rat을 경추탈골 하여 70% 알코올로 피부를 소독하여 절개한 후 관절연골을 2~3 mm 정도 크기로 채취하였고 채취한 연골조직은 phosphate buffer saline(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 용액에서 보관하여 clean bench로 옮겼다. 0.1% EDTA-CDMF(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액에 30분씩 2회 incubation 시키고(37℃, 5% CO2), 0.25% trypsin으로 1시간 incubation(37℃, 5% CO2)하였다. 2 mg/mL collagenase type I(Sigma-Aldrich Co.
- 이렇게 해서 얻어진 세포 부유액을 100 µm pore size cell strainer(BD Falcon, Flanklin lakes, NJ, USA)에 여과한 후 1,600 rpm으로 10분간 원심분리 하여 원심분리 된 세포를 Hank's balanced salt solution(Hyclone Laboratories)으로 3회 세척한 후 연골세포를 분리하였다. 분리된 연골세포는 10% FBS(Hyclone Laboratories)와 DMEM(Hyclone Laboratories)에 1% penicillin-streptomycin(Hyclone Laboratories)과 1% L-glutamine(Hyclone Laboratories) 그리고 0.1% gentamycin(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 75T flask에 넣고 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 배양하였다. 이때 2~3일에 한 번씩 배지를 갈아주고 약 4~5일에 계대하였으며 세포의 passage는 5 이하로 사용하였다.
- 측정을 위해 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)의 Prostaglandin E2 Assay kit을 이용하여 R&D Systems의 protocol을 따라서 실험을 하였으며, ELISA reader(VERSAMAXSL-20, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
- PCR을 위한 혼합액 최종 농도는 cDNA 2μL(10~100 ng), 2X iQ SYBR Green supermix 10 μL, forward & reverse primer 각 1 μL(250 nM), H2O 7 μL가 되도록 하였다.
- 실험동물에서 분리한 연골세포를 6-well plate에 5×106 cells/well의 농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM 배양액에 분주하여 12시간 동안 안정화시킨 후, 보스웰리아 추출물을 LPS 또는 H2O2와 함께 연골세포에 2시간 동안 처리한 후 0.25% trypsin-EDTA로 세포를 수집하여 RNeasy extraction kit(QIAGEN, Germantown, MD, USA)로 제조사의 manual에 따라 total RNA를 추출하고 cDNA의 합성을 위해 iScript Select cDNA Synthesis kit(BIO-RAD, Singapore, Singapore)을 이용하여 5 μg의 total RNA에 5× iScript select reaction mix를 4 μL, Oligo(dT) Primer set 2 μL(Table 1), RNA sample 5 μL, Nuclease-Free Water 8 μL를 각각 넣고 마지막에 iScript Reverse Transcriptase 1 μL를 넣어 pipette으로 up & down 하여 골고루 섞어주었다.
- 보스웰리아 추출물의 5-LO 저해 활성을 측정하기 위해 실험동물에서 분리한 연골세포를 96-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM 배양액에 분주하여 12시간 동안 안정화시킨 후 보스웰리아 추출물을 농도별로 처리하고 lipopolysaccharide(Sigma-Aldrich Co.) 50 μg/mL 처리하여 24시간 배양 후에 상층액을 따서 5-LO를 측정하였다.
- ) 50 μg/mL 처리하여 24시간 배양 후에 상층액을 따서 5-LO를 측정하였다. 측정을 위해 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)의 Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay kit을 이용하여 Cayman Chemical의 protocol을 따라서 실험을 하였으며, ELISA reader(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
- 마취시킨 rat의 무릎 주변을 제모하고 골관절염 유발물질인 MIA(Sigma-Aldrich Co.)를 1 mL 주사기로 양쪽 무릎 관절강 내에 50 μL(60 mg/mL)씩 주사하였다.
- 따라서 5~20 μg/mL 농도에서 세포사멸 억제가 가장 효과적으로 나타나는 것을 확인하였으며, 이에 따라 적정농도를 5, 10, 20 μg/mL로 설정하여 실험을 진행하였다.
- 관절염 유발 실험동물 희생 후, 동물에서 분리한 연골세포를 6-well plate에 5×106 cells/well의 농도로 10% FBS 를 첨가한 DMEM 배양액에 분주하여 12시간 동안 안정화시킨 후, 세포를 수거하여 RNA 추출 및 cDNA 합성과정을 거쳐 유전자 발현을 측정하였다.
- 보스웰리아 추출물 제공에 따른 관절염 예방 및 연골보호 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 보스웰리아가 첨가된 식이를 제공하고, 유발 후 3주간 지속적으로 보스웰리아 식이를 제공하며 관찰하였다. 보스웰리아 추출물은 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg 농도로 AIN93G diet에 첨가하여 시료를 제조하였으며 양성대조군으로는 항 관절염 효과가 있는 약물인 Celecoxib(Pfizer, New York, NY, USA)를 사용하였다(17,18).
- 보스웰리아 추출물 제공에 따른 관절염 예방 및 연골보호 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 보스웰리아가 첨가된 식이를 제공하고, 유발 후 3주간 지속적으로 보스웰리아 식이를 제공하며 관찰하였다. 보스웰리아 추출물은 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg 농도로 AIN93G diet에 첨가하여 시료를 제조하였으며 양성대조군으로는 항 관절염 효과가 있는 약물인 Celecoxib(Pfizer, New York, NY, USA)를 사용하였다(17,18). Celecoxib(CLX) 투여군은 존대를 이용하여 주 5회 일정시간에 10 mg/kg으로 경구 투여 하였으며, 식이는 3일에 한 번씩 교환하고 이때 잔여무게(일부 cage 안으로 떨어진 것을 회수)를 측정하여 섭취량을 환산하였다.
- 보스웰리아 추출물은 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg 농도로 AIN93G diet에 첨가하여 시료를 제조하였으며 양성대조군으로는 항 관절염 효과가 있는 약물인 Celecoxib(Pfizer, New York, NY, USA)를 사용하였다(17,18). Celecoxib(CLX) 투여군은 존대를 이용하여 주 5회 일정시간에 10 mg/kg으로 경구 투여 하였으며, 식이는 3일에 한 번씩 교환하고 이때 잔여무게(일부 cage 안으로 떨어진 것을 회수)를 측정하여 섭취량을 환산하였다. 물에 대한 접근은 임의대로 하였으며 음용한 양은 3일에 한 번씩 측정하고 새로운 물로 교환하였다.
- Celecoxib(CLX) 투여군은 존대를 이용하여 주 5회 일정시간에 10 mg/kg으로 경구 투여 하였으며, 식이는 3일에 한 번씩 교환하고 이때 잔여무게(일부 cage 안으로 떨어진 것을 회수)를 측정하여 섭취량을 환산하였다. 물에 대한 접근은 임의대로 하였으며 음용한 양은 3일에 한 번씩 측정하고 새로운 물로 교환하였다.
- )를 1 mL 주사기로 양쪽 무릎 관절강 내에 50 μL(60 mg/mL)씩 주사하였다. MIA 희석 시에는 saline 용액을 사용하고 약물 주사 7일 후에 관절 부위 부종 정도와 실험동물의 걷는 상태를 관찰하여 관절염 유발 확인 후 실험을 진행하였다.
- 본 실험에서는 primary culture를 통해 얻은 rat의 연골세포에 LPS 50 μg/mL 처리하여 염증을 유발하고, 앞선 실험 결과에 따라 결정된 보스웰리아 추출물의 적정농도를 처리한 세포에서 NF-κB 억제 활성을 측정하였다.
- 본 실험에서 연골세포에 LPS를 50 μg/mL 처리하여 염증을 유발하고, 앞선 실험 결과에 따라 결정된 보 스웰리아 추출물의 적정농도를 처리한 세포에서 TNF-α 및 IL-6 생성 억제 활성을 유전자 발현 측정법을 통하여 확인 하였다.
- 이러한 실험 결과에 따라 보스웰리아 추출물이 NF-κB에 의해 조절되는 또 다른 염증인자에 영향을 미칠 것으로 예상되어 추가 실험을 진행하였다.
- 따라서 류코트리엔 생합성 경로의 핵심인 5-LO 효소의 활성 측정을 통해 보스웰리아 추출물의 효능을 검증하고자 하였다. Primary culture를 통해 얻은 rat의 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유발하고, 앞선 실험 결과에 따라 결정된 보스웰리아 추출물의 적정농도를 처리한 세포에서 5-LO 활성을 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상세포(0.
- 또한 COX-2 발현에 따라 생성된 PGE2는 골극(osteophytes)을 형성하여 비정상적인 골 성장 및 통증을 나타내며 이러한 증상은 퇴행성관절염에서 흔히 발생하는 것으로 잘 알려져 있다(33). 본 실험에서는 primary culture를 통해 얻은 rat의 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유발하고, 보스웰리아 추출물의 적정농도를 처리한 세포에서 PGE2 생성 억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 정상세포(49.
- 총 실험기간 5주 동안 매주 2회 식이섭취량과 체중을 측정하였으며, 실험 기간 동안 급여한 물과 식이는 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 하루 한 마리의 섭취량을 계산하여 칼로리로 변환 후 식이섭취 효율로 나타내었다.
- 따라서 collagen type Ⅰ과 Ⅱ의 형성은 연골조직의 상태를 결정하는 중요한 인자이다. 골관절염 유발 동물에서 채취한 연골조직에서 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 유전자 발현을 측정하여 보스웰리아 추출물의 섭취 효능을 평가하였다. 그 결과 보스웰리아 추출물 200 mg/kg 섭취군인 BW200군에서 골관절염 유발 대조군인 sham군에 비해 유의적으로 유전자 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- MMP-3(Stromelysin)은 proteoglycan의 퇴화에 결정적인 역할을 하는 금속단백분해효소로 관절강 내 MMP-3의 증가는 심각한 연골손상과도 연관 지을 수 있으며, MMP-13의 경우 collagen type Ⅱ의 분해효소로 관절연골의 콜라겐 생성 및 재생에 중요한 인자로 알려져 있다(38). MMP-9 역시 퇴행성골관절염에서 발현이 증가하는 주요한 인자로 알려져 있으며, 따라서 MMP3, MMP-9 및 MMP-13을 이화작용인자에 대한 바이오마커로 선정하여 실험을 진행하였다. 본 실험에서의 MMPs 발현 확인 결과, MMP-3의 경우 관절염이 유발된 sham군에서 MMP-3의 발현이 6.
- 먼저 MTT 시험법을 통해 세포 사용 적정농도를 20 μg/mL 이하로 결정하여 연골세포 사멸 억제를 확인하고, 이를 근간으로 골관절염 동물실험 모델에서 골관절염 예방 효과를 확인하였다.
- 본 실험에서는 primary culture된 연골세포 in vitro 실험모델과 MIA로 유발한 골관절염 in vivo 실험모델을 이용하여 보스웰리아 추출물의 골관절염 예방 효과를 확인하였다. 먼저 MTT 시험법을 통해 세포 사용 적정농도를 20 μg/mL 이하로 결정하여 연골세포 사멸 억제를 확인하고, 이를 근간으로 골관절염 동물실험 모델에서 골관절염 예방 효과를 확인하였다.
- 실험 결과 염증을 유도한 연골세포에서 보스웰리아 추출물의 처리에 따라 5-LO 활성이 감소하였으며, 이는 곧 보스웰리아 추출물이 염증을 유발 핵심 효소인 5-LO 활성을 효과적으로 억제함으로써 연골세포 보호 효과를 나타낸 것이다. 세포실험에서의 기전 결과를 바탕으로 골관절염을 유발한 동물모델에서의 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 효과가 나타날 것으로 기대되어 관절염 유발 동물모델에서 보스웰리아 추출물의 효능검증 실험을진행하였으며, 세포실험 결과 및 기존의 연구내용을 참고하여 동물에서 보스웰리아의 섭취 농도를 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 결정하고 AIN-93G diet에 보스웰리아 추출물 분말을 섞어 보스웰리아 diet를 제작하여 실험기간 동안 제공하였다. 골관절염 유발 동물모델을 만들기 위해 SD rat의 관절강에 MIA를 injection 하였으며, 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 관절염 예방 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 제작된 식이를 제공하고 유발 후 3주간 지속적으로 식이 제공 및 관찰하였다.
- 세포실험에서의 기전 결과를 바탕으로 골관절염을 유발한 동물모델에서의 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 효과가 나타날 것으로 기대되어 관절염 유발 동물모델에서 보스웰리아 추출물의 효능검증 실험을진행하였으며, 세포실험 결과 및 기존의 연구내용을 참고하여 동물에서 보스웰리아의 섭취 농도를 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 결정하고 AIN-93G diet에 보스웰리아 추출물 분말을 섞어 보스웰리아 diet를 제작하여 실험기간 동안 제공하였다. 골관절염 유발 동물모델을 만들기 위해 SD rat의 관절강에 MIA를 injection 하였으며, 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 관절염 예방 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 제작된 식이를 제공하고 유발 후 3주간 지속적으로 식이 제공 및 관찰하였다. 연골의 주요 구성 성분인 collagen 및 aggrecan은 골관절염 발병 시 여러 인자에 의해 분해되는 것으로 알려져 있으며, 골관절염 유발 동물모델에서 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 유전자 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 변화를 살펴보았다.
- 골관절염 유발 동물모델을 만들기 위해 SD rat의 관절강에 MIA를 injection 하였으며, 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 관절염 예방 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 제작된 식이를 제공하고 유발 후 3주간 지속적으로 식이 제공 및 관찰하였다. 연골의 주요 구성 성분인 collagen 및 aggrecan은 골관절염 발병 시 여러 인자에 의해 분해되는 것으로 알려져 있으며, 골관절염 유발 동물모델에서 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 유전자 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 변화를 살펴보았다. 그 결과 골관절염 유발 sham군에 비해 보스웰리아 추출물 섭취군에서 유의적으로 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 발현이 증가하였으며, 특히 BW200군에서 CLX 약물대조군과 비슷한 수준으로 발현이 증가하여 관절연골의 보호 효과가 가장 좋은 것으로 확인되었다.
- 그 결과 골관절염 유발 sham군에 비해 보스웰리아 추출물 섭취군에서 유의적으로 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 발현이 증가하였으며, 특히 BW200군에서 CLX 약물대조군과 비슷한 수준으로 발현이 증가하여 관절연골의 보호 효과가 가장 좋은 것으로 확인되었다. 교원질 합성을 억제하고 분해를 촉진시키는 MMPs(MMP-3, MMP-9, MMP-13)의 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 발현 변화를 살펴보았다. 그 결과 앞선 다른 실험 결과와 마찬가지로 보스웰리아 섭취군에서 MMPs 유전자 발현이 유의적으로 낮아졌음을 살펴볼 수 있었다.
- 염증성 매개물질인 prostaglandin E2(PGE2)의 발현 확인을 위해 실험동물에서 분리한 연골세포를 96-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM 배양액에 분주하여 12시간 동안 안정화시킨 후 보스웰리아 추출물을 농도별로 처리하고 lipopolysaccharide(Sigma-Aldrich Co.) 50 μg/mL 처리하여 24시간 배양 후에 상층액을 따서 PGE2를 측정하였다.
- PCR을 위한 혼합액 최종 농도는 cDNA 2μL(10~100 ng), 2X iQ SYBR Green supermix 10 μL, forward & reverse primer 각 1 μL(250 nM), H2O 7 μL가 되도록 하였다. 95℃에서 10분간 hot start 한 후 95℃에서 15초간, 55℃에서 15초, 72℃에서 30초간 40 cycling으로 PCR을 수행한 후 마지막으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃ 15초간 polishing step을 거쳐 PCR 분석을 시행하였다. 반응에 사용한 primer는 Table 1에 제시하였다.
- PCR을 위한 혼합액 최종 농도는 cDNA 2μL(10~100 ng), 2X iQ SYBR Green supermix 10 μL, forward & reverse primer 각 1 μL(250 nM), H2O 7 μL가 되도록 하였다. 95℃에서 10분간 hot start 한 후 95℃에서 15초간, 55℃에서 15초, 72℃에서 30초간 40 cycling으로 PCR을 수행한 후 마지막으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃ 15초간 polishing step을 거쳐 PCR 분석을 시행하였다. 반응에 사용한 primer는 Table 1에 제시하였다.
대상 데이터
- 보스웰리아 추출물(Boswellia serrata extract: Wokvel TM, manufactured by Pharmanza India)은 (주)진용(수원, 한국)으로부터 분말 형태로 공급받아 실험에 사용하였다. 세포 실험을 위한 실험재료의 준비는 분말 형태의 보스웰리아 추출물을 0.
- 연골 채취를 위한 실험동물은 4~6주령 무게 약 180~200g 정도의 male Sprague-Dawley rat을 경추탈골 하여 70% 알코올로 피부를 소독하여 절개한 후 관절연골을 2~3 mm 정도 크기로 채취하였고 채취한 연골조직은 phosphate buffer saline(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 용액에서 보관하여 clean bench로 옮겼다. 0.
- 실험동물은 6주령의 male Sprague-Dawley(SD) rat(대한바이오링크, 충북, 한국)을 군당 8마리씩 총 48마리를 cage에 각각 넣고 일주일 동안 순화시킨 뒤 사용하였다. 사육실의 온도는 25±2℃, 습도 55±10%로 유지하였으며, 명암은 12시간 주기로 하였고 물과 고형사료는 자유롭게 공급하였다.
- 6주령의 male SD rat을 이용하며 Zoletile(cat. No. 06516, Virbac, Carros, France)과 Rumpun(cat. No. 41882, 바이엘코리아, Seoul, Korea)을 2:1 비율로 희석한 후에 복강주사로 마취시켰다. 마취시킨 rat의 무릎 주변을 제모하고 골관절염 유발물질인 MIA(Sigma-Aldrich Co.
- 본 실험에서 동화작용 인자로서 확인한 collagen type Ⅰ은 연골세포뿐만 아니라 일반적으로 인체세포에서 가장 많이 분포하고 있으며, collagen type Ⅱ는 연골조직 단백질의 50%를 차지하고 연골에 분포하고 있는 collagen 종류중 약 85~90%를 차지하고 있는 주요 단백질이다. 따라서 collagen type Ⅰ과 Ⅱ의 형성은 연골조직의 상태를 결정하는 중요한 인자이다.
데이터처리
- 실험군간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성을 Duncan's multiple range test를 이용하여 검증하였으며 5% 이내에서 통계적 유의성을 부여하였다(P<0.05).
- 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며 얻어진 결과는 SPSS 20.0 software(IBM, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)±표준 편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
이론/모형
- 42℃에서 60분, 85℃에서 5분간 반응시킨 후 합성된 cDNA를 PCR 반응에 사용하였다. Real-time PCR 실험 시 사용한 기계는 Step One Real-Time PCR system(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)이며 iQ SYBR Green Supermix(BIO-RAD)의 protocol에 따라 수행하였다. PCR을 위한 혼합액 최종 농도는 cDNA 2μL(10~100 ng), 2X iQ SYBR Green supermix 10 μL, forward & reverse primer 각 1 μL(250 nM), H2O 7 μL가 되도록 하였다.
성능/효과
- 또한5 μg/mL와 10 μg/mL 농도에서 역시 대조군에 비해 각각 71.8%와 68.1%로 세포생존률이 증가하여 대조군에 비해 유의적으로 연골세포 재생 효과가 나타난 것으로 관찰되었다(Fig. 1).
- 따라서 이러한 실험 결과를 바탕으로 보스웰리아 추출물과 H2O2 처리하였으며, H2O2만을 처리한 대조군(60.8%)에 비해 20 μg/mL 농도를 처리한 세포에서 73.1% 수준까지 세포생존률이 증가하여 연골세포 사멸 억제 효과가 나타났음을 확인하였다.
- 골관절염의 경우 연골세포의 사멸 억제와 세포 재생에 초점이 맞추어져 있으며, 단순 염증유발의 경우 LPS로 충분하지만 세포사멸을 유도하기 위해서는 H2O2 처리 후 실험을 진행하는 것이 적절할 것으로 판단되어(21), H2O2 800 μM에서 2시간 처리 후 세포생존률을 확인하였다.
- Primary culture된 연골세포에 대한 보스웰리아 추출물의 적정농도를 결정하기 위해 MTT assay를 수행한 결과, 보스웰리아 추출물 20 μg/mL 이상 농도에서 유의적으로 세포생존률이 감소하여 독성이 나타난 것으로 확인되었다 (data not shown).
- 골관절염의 경우 연골세포의 사멸 억제와 세포 재생에 초점이 맞추어져 있으며, 단순 염증유발의 경우 LPS로 충분하지만 세포사멸을 유도하기 위해서는 H2O2 처리 후 실험을 진행하는 것이 적절할 것으로 판단되어(21), H2O2 800 μM에서 2시간 처리 후 세포생존률을 확인하였다. 그 결과 시험대조군에서 50~68% 정도의 사멸을 나타내는 것으로 확인되었다(data not shown). 따라서 이러한 실험 결과를 바탕으로 보스웰리아 추출물과 H2O2 처리하였으며, H2O2만을 처리한 대조군(60.
- IL-6의 생성을 유전자 발현으로 측정한 결과 역시 보스웰리아 추출물을 처리한 세포에서 유의적으로 IL-6 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 특히 20 μg/mL 농도에서 가장 효과적으로 생성을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 3B).
- TNF-α의 경우, 아무것도 처리하지 않은 정상세포에 비해 LPS를 처리한 세포에서 TNF-α 생성이 2배 증가한 것으로 나타났으며, 특히 10 μg/mL 농도와 20 μg/mL 농도의 보스웰리아 추출물을 처리한 세포에서 유의적으로 TNFα 생성이 낮아진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A).
- 또한 보스웰리아 추출물을 처리한 세포에서 유의적으로 NF-κB 활성이 억제되었으며, 처리한 모든 농도에서 정상군과 비슷한 수준으로 활성이 억제된 것을 확인하였다(Fig. 2).
- 아무것도 처리하지 않은 정상 세포에 비해 LPS를 처리한 세포에서 NF-κB가 1.94배 높게 발현되어 염증 유발에 의한 NF-κB 활성이 증가하였음을 확인하였다.
- 아무것도 처리하지 않은 정상세포(0.14 µmol)에 비해 LPS를 처리한 세포에서 5-LO 활성이 1.01 µmol로 증가하여 염증이 유발되었음을 확인하였고, 보스웰리아 추출물을 함께 처리한 세포에서 5-LO 활성이 유의적으로 감소한 것으로 나타나 보스웰리아 추출물의 5-LO 억제 활성을 확인하였다.
- 특히 10 μg/mL 농도와 20 μg/mL 농도에서 가장 효과적으로 PGE2 생산이 감소된 것을 확인하였다(Fig. 5B).
- COX-2 발현을 측정한 결과, 정상 세포에 비해 LPS를 처리한 세포에서 COX-2 발현이 6배 증가했으며, 보스웰리아 추출물 5-20 μg/mL에서 농도 의존적으로 2배 이상 COX-2의 발현이 감소된 것으로 확인되었다(Fig. 5A).
- 특히 10 μg/mL와 20 μg/mL에서 5-LO 활성이 0.21 µmol로 감소하여 염증반응 억제 효능이 나타난 것을 확인하였다(Fig. 4).
- 본 실험에서는 primary culture를 통해 얻은 rat의 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유발하고, 보스웰리아 추출물의 적정농도를 처리한 세포에서 PGE2 생성 억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 정상세포(49.4 pg/mL)보다 LPS를 처리한 세포에서 154.67 pg/mL로 PGE2 생산이 68% 증가한 것으로 나타났으며, 반면 보스웰리아 추출물을 처리한 세포에서는 PGE2 생산이 45% 이상 감소한 것으로 나타났다. 특히 10 μg/mL 농도와 20 μg/mL 농도에서 가장 효과적으로 PGE2 생산이 감소된 것을 확인하였다(Fig.
- 하루 한 마리의 섭취량을 계산하여 칼로리로 변환 후 식이섭취 효율로 나타내었다. 5주 동안 rat의 몸무게 변화에서는 모든 실험군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 식이섭취 효율의 경우 BW200군에서 효율이 감소한 것으로 나타났으나 그룹 간 유의적인 차이는 없었으며, 이러한 결과로 미루어 볼 때 보스웰리아 추출물의 섭취가 몸무게 증가 및 증상에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하였다(Table 3).
- 골관절염 유발 동물에서 채취한 연골조직에서 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 유전자 발현을 측정하여 보스웰리아 추출물의 섭취 효능을 평가하였다. 그 결과 보스웰리아 추출물 200 mg/kg 섭취군인 BW200군에서 골관절염 유발 대조군인 sham군에 비해 유의적으로 유전자 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Collagen type Ⅰ의 경우 보스웰리아 추출물 섭취군이 sham 군과 통계적 유의성이 나타나지는 않았으나, 양성대조군인 CLX 약물 투여군과 비슷한 수준으로 collagen type Ⅰ 발현이 증가된 것으로 나타났다.
- Collagen type Ⅰ의 경우 보스웰리아 추출물 섭취군이 sham 군과 통계적 유의성이 나타나지는 않았으나, 양성대조군인 CLX 약물 투여군과 비슷한 수준으로 collagen type Ⅰ 발현이 증가된 것으로 나타났다. Collagen type Ⅱ 유전자 발현역시 CLX 약물 투여군과 비슷하게 발현되었으며, 보스웰리아 추출물 섭취에 따라 농도 유의적으로 효과가 나타났다 (Fig. 6A, 6B). 이러한 결과는 비록 collagen type Ⅰ에서 통계적 유의성이 나타나지 않았다 하더라도 연골조직에서는 collagen type Ⅱ가 대부분을 차지하고 있다는 점을 감안할 때 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 골관절염에서의 관절연골 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다.
- 6A, 6B). 이러한 결과는 비록 collagen type Ⅰ에서 통계적 유의성이 나타나지 않았다 하더라도 연골조직에서는 collagen type Ⅱ가 대부분을 차지하고 있다는 점을 감안할 때 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 골관절염에서의 관절연골 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다. Aggrecan은 연골조직에서 대표적으로 합성되는 proteoglycan core protein의 하나로서 aggregation, hyaluronan binding, cell adhesion과 chondrocyte apoptosis에 관여하는 구상 단백질인 G1, G2 그리고 G3로 구성되어 있으며 주로 관절에서 외부의 압력(compressive load)으로부터 저항성을 나타내어 관절을 유지시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다(34,35).
- Aggrecan은 연골조직에서 대표적으로 합성되는 proteoglycan core protein의 하나로서 aggregation, hyaluronan binding, cell adhesion과 chondrocyte apoptosis에 관여하는 구상 단백질인 G1, G2 그리고 G3로 구성되어 있으며 주로 관절에서 외부의 압력(compressive load)으로부터 저항성을 나타내어 관절을 유지시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다(34,35). 실험 결과 sham군을 제외한 모든 실험군에서 유의 적으로 aggrecan 발현이 증가하였고, 특히 BW200군에서 CLX 약물 투여군보다 높은 aggrecan 발현이 나타난 것으로 확인되었다(Fig. 6C).
- MMP-9 역시 퇴행성골관절염에서 발현이 증가하는 주요한 인자로 알려져 있으며, 따라서 MMP3, MMP-9 및 MMP-13을 이화작용인자에 대한 바이오마커로 선정하여 실험을 진행하였다. 본 실험에서의 MMPs 발현 확인 결과, MMP-3의 경우 관절염이 유발된 sham군에서 MMP-3의 발현이 6.5배 증가하여 골관절염의 유발이제대로 된 것으로 확인되었고 CLX 및 보스웰리아 섭취군에서 유의적으로 MMP-3의 발현이 감소한 것으로 나타났다. 특히 BW200군에서 약물 투여 양성대조군인 CLX군과 비슷한 수치로 감소한 것이 확인되었다(Fig.
- H2O2 처리에 따른 산화적 독성으로 연골세포 사멸을 유도한 실험에서 보스웰리아 추출물은 유의적으로 세포사멸을 억제하였으며 이러한 효과는 5~20 μg/mL 사이 농도에서 비교적 높게 나타났다.
- 7A). MMP-9와 MMP-13에서 역시 보스웰리아 섭취군에서 모두 유의적으로 발현이 감소되었으며(Fig. 7B, 7C), 이상의 실험 결과에 따라 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 골관절염에서의 관절 연골 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다. 따라서 보스웰리아 섭취 시 관절염 증상을 완화시키고 연골 보호 및 예방 효능을 지니는 기능성 소재로써 활용가치 및 실용가능성이 있을 것으로 기대할 수 있다.
- 세포실험에서는 골관절염 발병에 따라 관절연골에 영향을 미치는 염증인자에 대한 기전연구를 진행하였으며, 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유도한 후 보스웰리아 추출물의 효과를 확인한 실험 결과 면역과 염증반응을 조절하는 nuclear transcription factor κB(NFκB), 염증관련 cytokine IL-6, TNF-α의 발현이 모두 보스웰리아 추출물 처리 시 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며 특히 20 μg/mL 농도에서 가장 효과가 뚜렷하고 일관되게 확인되었다.
- 또한 이들 cytokine에 의해 생성되는 COX-2 발현과 COX-2에 자극 받아 생성이 촉진되는 PGE2 생성을 확인한 결과 역시 20 μg/mL 농도에서 가장 효과적으로 생성이 억제되어 염증을 조절하는 것으로 나타났다.
- 특히 보스웰리아의 기능성분으로 알려진 보스웰릭산(boswellic acids)에 의해 억제되는 5-LO의 경우, 염증반응 유발의 핵심인자를 생성하는 효소로 알려져 있으며 이를 직접적으로 저해하는 것으로 알려진 보스웰리아의 효능을 확인하고자 실험을 진행하였다. 실험 결과 염증을 유도한 연골세포에서 보스웰리아 추출물의 처리에 따라 5-LO 활성이 감소하였으며, 이는 곧 보스웰리아 추출물이 염증을 유발 핵심 효소인 5-LO 활성을 효과적으로 억제함으로써 연골세포 보호 효과를 나타낸 것이다. 세포실험에서의 기전 결과를 바탕으로 골관절염을 유발한 동물모델에서의 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 효과가 나타날 것으로 기대되어 관절염 유발 동물모델에서 보스웰리아 추출물의 효능검증 실험을진행하였으며, 세포실험 결과 및 기존의 연구내용을 참고하여 동물에서 보스웰리아의 섭취 농도를 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 결정하고 AIN-93G diet에 보스웰리아 추출물 분말을 섞어 보스웰리아 diet를 제작하여 실험기간 동안 제공하였다.
- 연골의 주요 구성 성분인 collagen 및 aggrecan은 골관절염 발병 시 여러 인자에 의해 분해되는 것으로 알려져 있으며, 골관절염 유발 동물모델에서 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 유전자 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 변화를 살펴보았다. 그 결과 골관절염 유발 sham군에 비해 보스웰리아 추출물 섭취군에서 유의적으로 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ 및 aggrecan 발현이 증가하였으며, 특히 BW200군에서 CLX 약물대조군과 비슷한 수준으로 발현이 증가하여 관절연골의 보호 효과가 가장 좋은 것으로 확인되었다. 교원질 합성을 억제하고 분해를 촉진시키는 MMPs(MMP-3, MMP-9, MMP-13)의 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 발현 변화를 살펴보았다.
- 교원질 합성을 억제하고 분해를 촉진시키는 MMPs(MMP-3, MMP-9, MMP-13)의 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 발현 변화를 살펴보았다. 그 결과 앞선 다른 실험 결과와 마찬가지로 보스웰리아 섭취군에서 MMPs 유전자 발현이 유의적으로 낮아졌음을 살펴볼 수 있었다. 특히 BW200군에서 MMPs 발현이 유의적으로 감소하였으며, 관절염에 효과적으로 사용되는 약물인 CLX 투여 양성대조군과 비슷한 수치를 나타내었다.
- 그 결과 앞선 다른 실험 결과와 마찬가지로 보스웰리아 섭취군에서 MMPs 유전자 발현이 유의적으로 낮아졌음을 살펴볼 수 있었다. 특히 BW200군에서 MMPs 발현이 유의적으로 감소하였으며, 관절염에 효과적으로 사용되는 약물인 CLX 투여 양성대조군과 비슷한 수치를 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 보스웰리아 추출물은 골관절염에서 관절연골의 보호 효과가 있으며, 이는 골관절염 발생 시 나타나는 염증발현의 기전적인 측면뿐만 아니라 골관절염 유발 동물에서 섭취 효능까지 모두 일관되게 나타나 골관절염에서의 기능성 소재로써 개발 가능성이 충분할 것으로 생각된다.
- 특히 BW200군에서 MMPs 발현이 유의적으로 감소하였으며, 관절염에 효과적으로 사용되는 약물인 CLX 투여 양성대조군과 비슷한 수치를 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 보스웰리아 추출물은 골관절염에서 관절연골의 보호 효과가 있으며, 이는 골관절염 발생 시 나타나는 염증발현의 기전적인 측면뿐만 아니라 골관절염 유발 동물에서 섭취 효능까지 모두 일관되게 나타나 골관절염에서의 기능성 소재로써 개발 가능성이 충분할 것으로 생각된다. 또한 추후 실험을 통해 골관절염이 유발된 동물에서 보스웰리아 추출물 섭취 시 관절연골의 형태학적인 변화 및 골상태의 분석과 더불어 관절염 유발 동물의 관절연골 및 혈액학적 분석을 진행하여 동물에서 기전적 측면을 보완하고 보스웰리아 추출물 효능에 대한 추가적인 검증을 하고자 한다.
후속연구
- 이러한 실험 결과는 앞서 살펴본 NF-κB와 TNF-α, IL-6와 같은 염증성 cytokines 및 COX-2 억제를 통한 염증발현을 제어하는 것을 의미하기도 한다. 이상의 실험 결과에 따라서 보스웰리아 섭취 시 관절염 증상을 완화시키고 연골 보호와 예방 효능을 지니는 기능성 소재로써 활용가치 및 실용가능성이 있을 것으로 기대할 수 있으며, 저농도에서 보스웰리아 추출물의 효과적인 작용이 기능성 소재로의 활용 및 실용에 더욱 유리하게 작용할 것으로 생각된다.
- 7B, 7C), 이상의 실험 결과에 따라 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 골관절염에서의 관절 연골 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다. 따라서 보스웰리아 섭취 시 관절염 증상을 완화시키고 연골 보호 및 예방 효능을 지니는 기능성 소재로써 활용가치 및 실용가능성이 있을 것으로 기대할 수 있다.
- 이상의 결과를 통하여 보스웰리아 추출물은 골관절염에서 관절연골의 보호 효과가 있으며, 이는 골관절염 발생 시 나타나는 염증발현의 기전적인 측면뿐만 아니라 골관절염 유발 동물에서 섭취 효능까지 모두 일관되게 나타나 골관절염에서의 기능성 소재로써 개발 가능성이 충분할 것으로 생각된다. 또한 추후 실험을 통해 골관절염이 유발된 동물에서 보스웰리아 추출물 섭취 시 관절연골의 형태학적인 변화 및 골상태의 분석과 더불어 관절염 유발 동물의 관절연골 및 혈액학적 분석을 진행하여 동물에서 기전적 측면을 보완하고 보스웰리아 추출물 효능에 대한 추가적인 검증을 하고자 한다.
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