본 연구에서는 서울, 경기, 강원도, 충남 지역의 벼를 수집하여 쌀겨와 현미에서의 $B.$$cereus$ group을 분리하였으며, 분포분석을 통해 작물의 오염 정도를 알아보았고, biofilm 형성시 특성을 연구하였다. $B.$$cereus$는 총 26개의 시료 가운데 쌀에서 34.6%, 쌀겨에서 50.0%로 가장 높은 분포도를 나타냈으며, $B.$$thuringiensis$는 쌀에서 3.9%, 쌀겨에서 23%의 분포를 보였다. 분리된 균주의 biofilm 형성 능력 실험에서는 시간이 지남에 따라 biofilm 형성 정도가 증가하였으며, 표준 균주에 비해 분리 균주가 biofilm 형성 능력이 높은 것으로 나타났다. 또한 biofilm이 형성된 $B.$$cereus$의 경우 항생제와 항균제 처리에 따른 최소저해농도는 부유 세균에 비해 대체적으로 높은 내성을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 서울, 경기, 강원도, 충남 지역의 벼를 수집하여 쌀겨와 현미에서의 $B.$$cereus$ group을 분리하였으며, 분포분석을 통해 작물의 오염 정도를 알아보았고, biofilm 형성시 특성을 연구하였다. $B.$$cereus$는 총 26개의 시료 가운데 쌀에서 34.6%, 쌀겨에서 50.0%로 가장 높은 분포도를 나타냈으며, $B.$$thuringiensis$는 쌀에서 3.9%, 쌀겨에서 23%의 분포를 보였다. 분리된 균주의 biofilm 형성 능력 실험에서는 시간이 지남에 따라 biofilm 형성 정도가 증가하였으며, 표준 균주에 비해 분리 균주가 biofilm 형성 능력이 높은 것으로 나타났다. 또한 biofilm이 형성된 $B.$$cereus$의 경우 항생제와 항균제 처리에 따른 최소저해농도는 부유 세균에 비해 대체적으로 높은 내성을 나타내는 것으로 확인되었다.
$Bacillus$$cereus$ is widely distributed on various foods and is known to cause clinical infections, food poisoning toxin induced diarrhea and vomiting. In this study, $B.$$cereus$ group detected and analyzed rice, rice bran, and biofilm characterization...
$Bacillus$$cereus$ is widely distributed on various foods and is known to cause clinical infections, food poisoning toxin induced diarrhea and vomiting. In this study, $B.$$cereus$ group detected and analyzed rice, rice bran, and biofilm characterization of $B.$$cereus$ confirmed. $B.$$cereus$ was identified in approximately 34.6% of brown rice and 50.0% of rice bran. $B.$$thuringiensis$ was detected in 3.9% of brown rice and 23% of rice bran, and $B.$$mycoides$ was isolated from rice bran. The microtiter plate assay detected differences in biofilm-forming ability among $B.$$cereus$ group isolates. Biofilm of $B.$$cereus$ seemed to increase the MIC values of antimicrobial agent and antibiotic compounds compared with planktonic cells. Therefore, sufficient attention should be given to good manufacturing practice and good agriculture practice to avoid contamination of $B.$$cereus$ group raw material including rice.
$Bacillus$$cereus$ is widely distributed on various foods and is known to cause clinical infections, food poisoning toxin induced diarrhea and vomiting. In this study, $B.$$cereus$ group detected and analyzed rice, rice bran, and biofilm characterization of $B.$$cereus$ confirmed. $B.$$cereus$ was identified in approximately 34.6% of brown rice and 50.0% of rice bran. $B.$$thuringiensis$ was detected in 3.9% of brown rice and 23% of rice bran, and $B.$$mycoides$ was isolated from rice bran. The microtiter plate assay detected differences in biofilm-forming ability among $B.$$cereus$ group isolates. Biofilm of $B.$$cereus$ seemed to increase the MIC values of antimicrobial agent and antibiotic compounds compared with planktonic cells. Therefore, sufficient attention should be given to good manufacturing practice and good agriculture practice to avoid contamination of $B.$$cereus$ group raw material including rice.
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문제 정의
본 연구에서는 서울, 경기, 강원도, 충남 지역의 벼를 수집하여 쌀겨와 현미에서의 B. cereus group을 분리하였으며, 분포분석을 통해 작물의 오염 정도를 알아보았고, biofilm 형성시 특성을 연구하였다. B.
cereus group 역시 토양이나 쌀 등에서 biofilm 등을 형성하여 오랜 시간 생존할 수 있다. 본 연구에서는 우리 쌀에 존재하는 식중독 유발세균인 B. cereus group의 분포와 분리된 B. cereus group에 대한 biofilm 형성 특성을 분석하고, biofilm이 형성된 B. cereus에 대한 항생제와 살균제에 대한 특성 변화를 확인하였다.
가설 설정
쌀은 저장 중에 미생물의 증식으로 인해 품질이 저하되는데(Mheen 등 1982), 저장 중 오염되는 미생물은 대개 Sphingomonas paucimobilis와 Arthrobacter atrocyaneus, Bacillus spp.가 높은 비율을 차지한다. 그 중 B.
제안 방법
Biofilm 형성 특성을 비교하기 위해 B. cereus group 표준 균주와 분리 균주들을 10 ㎖ TSB 배지에 접종한 후 PVC micorotiter plate(Becton Dickinson Labware, NJ, USA) 각 96 well에 200 ㎕씩 각각 분주하고 4일간 배양하면서 microtiter plate assay로 측정하였다. Microtiter plate assay는 각각의 well에 있는 배양 상등액을 제거한 후 0.
Mullar Hinton agar(Oxoid, Hampshire, England)에서 항균제로 H2O2, lactic acid, acetic acid, ethanol, rhamnolipid를, 항생제로 penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalothin, neomycin, streptomycin, kanamycin, paromomycin, chloramphenicol, vancomycin, nalidixic acid, rifampicin, tetracyclin, lincomycin, erythromycin(Sigma-aldrich, Germeny)를 사용하여 농도별로 배지를 만들어 실험에 사용하였다. Glass wool 외에 부유하고 있는 균과 glass wool로부터 취한 biofilm cell을 각 plate에 도말하고 결과를 관찰하였다.
Glass wool을 사용해 biofilm을 형성시킨 B. cereus와 부유 B. cereus에 대해 항균제와 항생제에 대한 최소생육저해농도를 비교하였다. Glass wool을 이용한 biofilm 형성은 103 CFU/㎖의 식중독 세균을 0.
cereus에 대해 항균제와 항생제에 대한 최소생육저해농도를 비교하였다. Glass wool을 이용한 biofilm 형성은 103 CFU/㎖의 식중독 세균을 0.5 g의 glass wool이 포함된 100 ㎖ Tryptic soy broth에서 37℃에서 48시간 배양한 후 0.1% crystal violet으로 염색한 후 현미경 관찰을 수행하였다. 그리고 부유 세균은 배양 상등액 10 ㎖를 취해 사용하였으며, biofilm 형성 B.
5분, 마지막으로 72℃에서 7분을 수행하였다. PCR 산물은 0.5% TAE buffer에 0.5 ㎍/㎖의 ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel로 전기영동한 후 UV transilluminator(Seolin Biotech, Suwon, Korea)에서 증폭 산물을 확인하였다.
thuringiensis는 Bt1(5’- ATCGGTGATACAGATAAGACT-3’)과 Bt2r(5’-CCTTCATACG TATGAATATTATTT-3’) primer를 이용하였다(Jeon 등 2010). PCR은 Gene cycler(BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용하였으며, 30 cycles로 94℃에서 1분, 58℃에서 1.5분, 72℃에서 2.5분, 마지막으로 72℃에서 7분을 수행하였다. PCR 산물은 0.
이후 식품공전에서 제시하는 방법으로 MYP agar에서 혼탁한 환을 형성한 분홍색 집락을 1차적으로 선별하였으며, 이 균주들은 다시 MYP agar에 획선 도말하여 군집을 선별하고 TSB에 배양하였다. 그리고 gyrB 유전자를 검출하는 primer를 이용해 B. cereus와 B. thuringiensis를 동정하는 PCR을 수행하였다. B.
mycoides의 분리는 rhizoid 형태의 집락을 선별하였다. 선별된 집락을 TSA에 평판 획선하여 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 Gram염색과 생화학적 특성 분석을 통해 1차적으로 선별하였다.
쌀겨와 쌀로부터 분리한 Bacillus cereus group을 이용하여 biofilm 형성 특성을 비교하기 위해 B. cereus group 표준 균주와 분리 균주들을 10 ㎕ TSB 배지에 접종한 후 PVC microtiter plate- 96 well에서 4일간 배양하여 측정하였다(Fig. 3). Microtiter plate에 표준 균주와 분리 균주를 각 200 ㎕씩 분주하여 시간 경과에 따른 biofilm 형성 정도를 spectrophotometer를 이용하여 비교한 결과, 12시간 배양에서는 평균 0.
쌀에서 분리된 B. cereus group으로 의심되는 분리 균주들을 대상으로 하여 B. cereus와 B. thuringiensis를 PCR을 통해 확인하였다. 이때 증폭 유전자는 gyrB를 사용하였으며, B.
건조 후 2% hucker crystal violet용액 200 ㎕로 5분 동안 well 안에 부착된 균주를 염색하고 멸균수로 세척한 뒤 건조시켰다. 이어서 33% glacial acetic acid를 160 ㎕씩 첨가하여 5분 동안 처리하여 유리되는 crystal violet을 550 nm에서 microtiter plate reader(Tecan, sunrise, Salzburg, Austria)로 흡광도를 측정하였다.
서울, 경기, 강원도, 충남 지역에서 생산되는 벼를 수집하여 무균 조작으로 쌀겨와 쌀로 분리하였다. 이후 식품공전에서 제시하는 방법으로 MYP agar에서 혼탁한 환을 형성한 분홍색 집락을 1차적으로 선별하였으며, 이 균주들은 다시 MYP agar에 획선 도말하여 군집을 선별하고 TSB에 배양하였다. 그리고 gyrB 유전자를 검출하는 primer를 이용해 B.
대상 데이터
Biofilm을 형성하기 위해 glass wool을 이용하였으며, 0.5 g의 glass wool이 첨가된 tryptic soy broth에 B. cereus KCCM 40935를 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 0.1% crystal violet으로 염색 후 현미경 관찰한 결과는 Fig. 4와 같다. 또한 glass wool에 부착되어 생성된 biofilm과 부유 세균을 분리하여 6종의 항균제와 8종의 항생제가 첨가된 배지에서 생육 최소저해농도를 확인하였다(Table 2).
cereus group의 분리는 식품 공전(고시 제2011-20호)에서 제시하는 방법에 준하여 수행하였다. MYP(mannitol egg yolk polymyxin agar) agar에서 배양된 집락들 중 혼탁한 환을 형성한 분홍색 집락을 선별하였으며, B. mycoides의 분리는 rhizoid 형태의 집락을 선별하였다. 선별된 집락을 TSA에 평판 획선하여 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 Gram염색과 생화학적 특성 분석을 통해 1차적으로 선별하였다.
cereus를 분리하였다. Mullar Hinton agar(Oxoid, Hampshire, England)에서 항균제로 H2O2, lactic acid, acetic acid, ethanol, rhamnolipid를, 항생제로 penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalothin, neomycin, streptomycin, kanamycin, paromomycin, chloramphenicol, vancomycin, nalidixic acid, rifampicin, tetracyclin, lincomycin, erythromycin(Sigma-aldrich, Germeny)를 사용하여 농도별로 배지를 만들어 실험에 사용하였다. Glass wool 외에 부유하고 있는 균과 glass wool로부터 취한 biofilm cell을 각 plate에 도말하고 결과를 관찰하였다.
본 연구에 사용된 균주는 B. cereus KCCM 40935, B. cereus KCCM 11773, B. cereus KCTC 1094, B. thuringiensis KCTC 1509, B. thuringiensis KCCM 11429, B. thuringiensis KCCM 11428, B. mycoides KCTC 3453를 한국종균협회와 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양받았다. B.
서울, 경기, 강원도, 충남 지역에서 생산되는 벼를 수집하여 무균 조작으로 쌀겨와 쌀로 분리하였다. 이후 식품공전에서 제시하는 방법으로 MYP agar에서 혼탁한 환을 형성한 분홍색 집락을 1차적으로 선별하였으며, 이 균주들은 다시 MYP agar에 획선 도말하여 군집을 선별하고 TSB에 배양하였다.
서울, 경기, 강원도, 충남지역의 벼의 쌀을 분리원으로 사용하였고, B. cereus group의 분리는 식품 공전(고시 제2011-20호)에서 제시하는 방법에 준하여 수행하였다. MYP(mannitol egg yolk polymyxin agar) agar에서 배양된 집락들 중 혼탁한 환을 형성한 분홍색 집락을 선별하였으며, B.
이때 증폭 유전자는 gyrB를 사용하였으며, B. cereus는 Bc1(5’-ATTGGTGACACCGATCAAACA-3’), Bc2r(5’- TCATACGTATGGATGTTATTC-3’), B. thuringiensis는 Bt1(5’- ATCGGTGATACAGATAAGACT-3’)과 Bt2r(5’-CCTTCATACG TATGAATATTATTT-3’) primer를 이용하였다(Jeon 등 2010).
성능/효과
cereus group을 분리하였으며, 분포분석을 통해 작물의 오염 정도를 알아보았고, biofilm 형성시 특성을 연구하였다. B. cereus는 총 26개의 시료 가운데 쌀에서 34.6%, 쌀겨에서 50.0%로 가장 높은 분포도를 나타냈으며, B. thuringiensis는 쌀에서 3.9%, 쌀겨에서 23%의 분포를 보였다. 분리된 균주의 biofilm 형성 능력 실험에서는 시간이 지남에 따라 biofilm 형성 정도가 증가하였으며, 표준 균주에 비해 분리 균주가 biofilm 형성 능력이 높은 것으로 나타났다.
thuringiensis를 동정하는 PCR을 수행하였다. B. cereus와 B. thuringeinsis는 염기서열이 매우 유사하여 16S rRNA를 이용한 sequencing에서도 99% 이상의 유사성을 보이나(Seki 등 1978), Yamada 등(1999)이 고안한 primer는 reverse primer에 차이를 두어 종간의 분리가 가능하게 하므로 본 실험에서 B. cereus는 365 bp, B. thuringeinsis는 368 bp의 PCR product band를 확인할 수 있었다(Fig. 2). 총 26개의 쌀과 쌀겨시료 가운데, 9개의 쌀(34.
9%)과 6개의 쌀겨(23%)에서 검출되었다. B. mycoides는 1개 (3.8%)의 쌀겨 시료에서 발견되어 전체 시료 중 B. cereus가 차지하는 비율이 84.6%로 가장 높았고, B. thuringiensis는 26.9%를 차지하여 전체적으로 Bacillus cereus group이 분포되어 있음을 확인하였다(Table 1). Bacillus spp.
3). Microtiter plate에 표준 균주와 분리 균주를 각 200 ㎕씩 분주하여 시간 경과에 따른 biofilm 형성 정도를 spectrophotometer를 이용하여 비교한 결과, 12시간 배양에서는 평균 0.15의 O.D값을 나타냈으나, 24시간 후에는 그 수가 2배 가량 증가했고, 4일째에 대부분 0.4의 O.D값을 나타내어 B. cereus가 polyethylene에 부착해 biofilm을 형성한다는 것을 알 수 있었다. 또한 시간이 경과함에 따라 환경 스트레스에 저항하여 생존한 세균이 두터운 층의 biofilm을 형성한다는 것을 확인하였는데, 특히 표준 균주보다 분리 균주에서의 biofilm이 더 강하고 빠르게 형성됨을 알 수 있었다.
분리된 균주의 biofilm 형성 능력 실험에서는 시간이 지남에 따라 biofilm 형성 정도가 증가하였으며, 표준 균주에 비해 분리 균주가 biofilm 형성 능력이 높은 것으로 나타났다. 또한 biofilm이 형성된 B. cereus의 경우 항생제와 항균제 처리에 따른 최소저해농도는 부유 세균에 비해 대체적으로 높은 내성을 나타내는 것으로 확인되었다.
4와 같다. 또한 glass wool에 부착되어 생성된 biofilm과 부유 세균을 분리하여 6종의 항균제와 8종의 항생제가 첨가된 배지에서 생육 최소저해농도를 확인하였다(Table 2). 전반적으로 biofilm을 형성한 cell이 부유 세균에 비해 2배 정도 높은 농도의 항생제에서 생존하여 항생제에 덜 민감한 것으로 나타났으며, cephalothin, streptomyxin, tetracycline, lincomycin에서는 biofilm formation cell이 각각 128 ㎍/㎖, 64 ㎍/㎖, 16 ㎍/㎖, 32 ㎍/㎖로 부유 세균보다 4배가 높은 농도에서도 생육이 가능하였다.
cereus가 polyethylene에 부착해 biofilm을 형성한다는 것을 알 수 있었다. 또한 시간이 경과함에 따라 환경 스트레스에 저항하여 생존한 세균이 두터운 층의 biofilm을 형성한다는 것을 확인하였는데, 특히 표준 균주보다 분리 균주에서의 biofilm이 더 강하고 빠르게 형성됨을 알 수 있었다. Elhariry(2011)의 실험에서도 희석된 TSB 배지에서 48시간 배양된 표준 균주는 0.
9%, 쌀겨에서 23%의 분포를 보였다. 분리된 균주의 biofilm 형성 능력 실험에서는 시간이 지남에 따라 biofilm 형성 정도가 증가하였으며, 표준 균주에 비해 분리 균주가 biofilm 형성 능력이 높은 것으로 나타났다. 또한 biofilm이 형성된 B.
또한 glass wool에 부착되어 생성된 biofilm과 부유 세균을 분리하여 6종의 항균제와 8종의 항생제가 첨가된 배지에서 생육 최소저해농도를 확인하였다(Table 2). 전반적으로 biofilm을 형성한 cell이 부유 세균에 비해 2배 정도 높은 농도의 항생제에서 생존하여 항생제에 덜 민감한 것으로 나타났으며, cephalothin, streptomyxin, tetracycline, lincomycin에서는 biofilm formation cell이 각각 128 ㎍/㎖, 64 ㎍/㎖, 16 ㎍/㎖, 32 ㎍/㎖로 부유 세균보다 4배가 높은 농도에서도 생육이 가능하였다. 특히 neomycin과 vancomycin에서는 모두 16 ㎍/㎖로 8배가 높은 농도의 배지에서도 생육하는 것을 확인하였다.
2). 총 26개의 쌀과 쌀겨시료 가운데, 9개의 쌀(34.6%)과 13개의 쌀겨(50.0%)에서 B. cereus가 검출되었으며, B. thuringiensis는 1개의 쌀(3.9%)과 6개의 쌀겨(23%)에서 검출되었다. B.
전반적으로 biofilm을 형성한 cell이 부유 세균에 비해 2배 정도 높은 농도의 항생제에서 생존하여 항생제에 덜 민감한 것으로 나타났으며, cephalothin, streptomyxin, tetracycline, lincomycin에서는 biofilm formation cell이 각각 128 ㎍/㎖, 64 ㎍/㎖, 16 ㎍/㎖, 32 ㎍/㎖로 부유 세균보다 4배가 높은 농도에서도 생육이 가능하였다. 특히 neomycin과 vancomycin에서는 모두 16 ㎍/㎖로 8배가 높은 농도의 배지에서도 생육하는 것을 확인하였다. 그러나 항균제인 Na(ClO2)과 rhamnolipid는 biofilm 형성과 상관없이 부유 세균과 동일한 MIC수치를 나타냈다.
후속연구
cereus group이 생산하는 AHL lactonase(AiiA)를 이용하여 그람 음성 세균의 biofilm 형성을 억제할 수 있다고 밝혔다. 그러나 그람 양성 세균의 경우 AHL이 아닌 peptide 신호전달물질과 LuxS 계 autoinducer를 사용하기 때문에(Richard 등 2009) 이것에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 한편, Kim 등(2006)은 염소소독제와 은 화합물을 이용한 biofilm 제어 실험에서 은 화합물을 소독제로 사용하는 경우 생물 막 외부의 EPS 유기물과 쉽게 반응하여 생물 막 내부로 투과할 수 있어 낮은 농도의 처리에도 효과적이라고 보고하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
B. cereus group이란 무엇인가?
B. cereus group은 Gram 양성이며 포자를 형성하는 통성 혐기성 세균이며, 대표적으로는 B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. (pseudo)mycoides가 알려져 있다(Lechner 등 1998; Nakamura LK 1998). B.
쌀의 품질을 저하시켜 부패를 유발하는 세균은 무엇인가?
가 많이 오염되어 있는 것으로 보고되고 있으며(Kim 등 2006), 최근에는 다양한 친환경 농법을 이용한 유기농 제품의 증가 및 생물 농약 제제 사용의 증가 등으로 인해 쌀에서도 오염 가능성이 증대되고 있다(Jo 등 2011). 쌀의 품질을 저하시켜 부패를 유발하는 Bacillus spp.는 Bacillus subtilis, B. megaterium, B. circulans 등이 있으며, 특히 식중독을 유발하는 B. cereus group의 오염도 보고되고 있다(Jeon 등 2010).
enterotoxin의 제거 방법은 무엇인가?
cereus의 독소인 enterotoxin은 분자량이 5～6만의 고분자 단백질로 장관 내에서 이 균이 증식하여 생산된다. Trypsin에 의해 분해되고 60℃, 20분간의 가열로 파괴되며, pH 변화에도 민감하다(Granum PE 1994). 반면, 구토 독소는 음식물 내에서 생산된 독소로 여과막을 통과하는 분자량 1만 이하의 저분자 펩타이드이며, 126℃에서 90분간 가열하여도 파괴되지 않는 열 저항성과, 산, 알칼리 및 단백질 가수분해 효소에도 저항력을 갖는다(Kramer 등 1989).
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