선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 있다. 미생물 표면 발현에서, 목적 단백질의 표면 발현 후 숙주세포의 안정성은 매우 중요한 사항이므로, 본 연구에서도 열처리와 lysozyme 처리를 통하여 levansucrase가 표면발현된 고쵸균 포자의 안정성을 조사해 보았다.
- 본 논문에서는 이러한 고초균 포자에 기반한 표면발현 시스템의 응용처를 더욱 넓히고, 포자 발현된 효소의 전 세포 반응에의 가능성을 확인하기 위하여, 彻mobilis 유래의 levansucrase를 고초균 포자에 표면 발현하고, 그 특성을 분석하고자 한다.
제안 방법
- 포자의 열안정성 측정을 위해서는 준비된 포자 혹은 포자가 포함된 배양액을 "C 에서 15분간 가열한 후 멸균된 D.D.W (Deionized Distilled Water)에서 적절한 농도로 희석한 샘플을 TBAB (Tryptose Blood Agar Base) 배지위에 도말한 후 37℃ 에서 24시간 배양하였다. 30-300개 정도의 colony를 가지는 TBAB plate를 선별하여 생존 세포의 개수를 계산하였다.
- levansucrase를 클로닝 하기 위해서 Zymomonas mobilischromosome을 template로 하여 다음 두 개의 DNA primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. (levU 5 prime; 5, -AAG TGC CTG CAG ATG TTG AAT AAA GCA GGC AT-3', levU 3 prime; 5'-AAT GAA. AAG CTT TTA TTT ATT CAA TAA AGA CA-3') pSDJH-co/G와 위에서 PCR 증폭된 levansucrase gene을 제한효소 Pst I과 Hind Ⅲ로 처리한 후, ligation하였다. 이렇게 만들어진 cotG-levU를 융합 발현하는 plasmid vector를 pSDJH-cofG-ZevU라고 이름지었다.
- W (Deionized Distilled Water)에서 적절한 농도로 희석한 샘플을 TBAB (Tryptose Blood Agar Base) 배지위에 도말한 후 37℃ 에서 24시간 배양하였다. 30-300개 정도의 colony를 가지는 TBAB plate를 선별하여 생존 세포의 개수를 계산하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 각각의 실험에서 세 개의 plate 에 도말하여 (triplicate) 그 평균값을 구하였다.
- DB104와 DB104 (pSDm-cotG-levU) 두 가지의 균주에 대해 배양 시간에 따라 두 가지의 (24 h, 48 h) 샘플이 준비되었고, 각각의 샘플에 대해 열처리와 lysozyme 처리를 수행하였다. CotG-LevU 융합 단백질의 표면 발현은 Table 1에서 나타나 바와 마찬가지로 포자의 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 실험은 3회 반복하였으며, 각각의 실험에서 세 개의 plate 에 도말하여 (triplicate) 그 평균값을 구하였다. Lysozyme 처리 후의 포자의 안정성을 측정하기 위해서는 분리 정제된포자 혹은 포자가 포함된 배양액을 50 mg/L의 lysozyme을 함유하는 50 mM Tris-Cl (pH 7.2) 완충 용액에서 37℃에서 1시간 방치한 후 위의 방법으로 도말, 생존한 세포의 빈도를 측정하였다.
- )의 짧은 단편을 상기 Klenow 로 처리된 vectore 연결하여 multi cloning site를 가지는 pCSKl vectoi를 완성하였다. cotG promoter# 포함하는 구조유전자를 누 개의 DNA primer를 이용히여 PCR 증폭하였다. (cotG 5 prime; 5'-GCC TTT GGA TCC AGT GTC CCT AGC TCC GAG-3', ceG-Linker 3 prime; 5f-CTA TTG CTG CAG TGA ACC CCC ACC TCC TIT GTA TIT CTT TIT GAC TA-3) coZG-Linker 3 prime primer는 cotG 구조 유전자의 C-말단에 flexi미己 linker (Giy・Gly-GIy-Gly-Ser)를 가지도록 디자인되었다 [14], 위의 pCSKl vector와 PCR 증폭 단편을 제한 효소 Pst I과 BamH I으로 처리한 후 ligation하였다 이렇게 만들어진 cotG를 표면 발현 모체로 가진 plasmid vector를 pSDJH-cofG라고 이름지었다.
- (cotG 5 prime; 5'-GCC TTT GGA TCC AGT GTC CCT AGC TCC GAG-3', ceG-Linker 3 prime; 5f-CTA TTG CTG CAG TGA ACC CCC ACC TCC TIT GTA TIT CTT TIT GAC TA-3) coZG-Linker 3 prime primer는 cotG 구조 유전자의 C-말단에 flexi미己 linker (Giy・Gly-GIy-Gly-Ser)를 가지도록 디자인되었다 [14], 위의 pCSKl vector와 PCR 증폭 단편을 제한 효소 Pst I과 BamH I으로 처리한 후 ligation하였다 이렇게 만들어진 cotG를 표면 발현 모체로 가진 plasmid vector를 pSDJH-cofG라고 이름지었다. levansucrase를 클로닝 하기 위해서 Zymomonas mobilischromosome을 template로 하여 다음 두 개의 DNA primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. (levU 5 prime; 5, -AAG TGC CTG CAG ATG TTG AAT AAA GCA GGC AT-3', levU 3 prime; 5'-AAT GAA.
- levansucrase의 포자 표면 발현을 증명하기 위하여 유세포 분석기를 이용하였다. 목적 단백질의 항체과 그 2차 항체에 대한 접근성을 이용하는 유세포 분석은 미생물 표면 발현 분야에서 목적 단백질의 위치에 관한 중요한 정보를 제공하는 실험 방법이다.
- 고초균 대조군인 DB104오]- DB104 (pSDJ旧-c况GJevU)의 포자를 분리 정제한 후, levansucrase에 대항하는 항체인 anti- LevU Rabbit IgG [2]로 각각의 포자를 표지하고, 2차 항체인 FITC-labeled anti Rabbit IgG로 표지하였다 (Fig. 3). 대조균인 DB104인 경우에 비하여, 목적 단백질을 표면 발현하고 있는 DB104 (pSDJH-o部의 경우, 각각의 포자가 나타내는 형광의 정도가 매우 크게 증가하여 , 그래프가 오른쪽으로 이동한 것을 확인할 수 있다.
- 30-300개 정도의 colony를 가지는 TBAB plate를 선별하여 생존 세포의 개수를 계산하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 각각의 실험에서 세 개의 plate 에 도말하여 (triplicate) 그 평균값을 구하였다. Lysozyme 처리 후의 포자의 안정성을 측정하기 위해서는 분리 정제된포자 혹은 포자가 포함된 배양액을 50 mg/L의 lysozyme을 함유하는 50 mM Tris-Cl (pH 7.
- 유세포 분석을 위해 분리 정제된 포자를 PBS 용액을 이용하여 세 번 세척하였다. 세척된 포자는 anti-LevU Rabbit IgG (1: 200)으로 1차 표지하여 1시간 동안 0℃ 에서 처리하였다.
- 이를 극복하기 위하여 본 저자들은 고초균의 포자를 이용한 미생물 표면발현 시스템을 개발하였고, 이를 이용히여, P-galactosidase, streptavidin, GFPuv 등의 기존의 표면 발현시스템에서는 용이하지 않았던, 다양한 목적 단백질들을 표면 발현하였다 [10-12],
- 접송 후 24시간이 지난 고초균 대조군인 DB104와 levamucrase 를 표면 발현하는 DB104 (pCSK-cWGJevt/)의 포자를 배양액 4.5 mL에서 분리 정제하였다. 분리정제된 포자를 이용하여 1(说의 sucrose를 포함하는 PBS 용액에서 37℃ 에서 효소 반응이 수행되었다.
- 5 mL의 PBS 에 재부유되었다. 준비된 포자는 F AC Sort flow cytometer (FACSort, Becton Dickinson, Oxnard, CA)와, software CellQuest ver. 1.0을 이용하여 분석되었다.
- 즉정함으로써 알 수 있다. 표면 발현된 levansucrase의 효소 활성 측정을 위해, 고초균 대조군인 DB104와 DB104 (pSDJH.twG-SU)의 포자를 분리 정제하여 반응에 이용하였다 (Fig. 4). 84시간의 반응 동안 DB104와 DB104 (pSDJH-caG*viT)의 포자 모두에서 유리된 포도당의 농도는 계속 증가하였耳.
대상 데이터
- 82 g/L)를 사용하였으며, 37℃ 에서 진탕배양기를 통하여 배양하였다. DB104 (pSDJH-cofG-知V의 선별과 배양을 위해서 chlonm叩henicol (5 mg/L)을 사용하였다.
- DNA 중합효소 (polymerase) 는 Boehringer Manheim (Expand Long Ten中late PCR System, catalogue NO. 1681834, Germany) 사에서 구입하여 사용하였다. 표면 발현 모체인 고초균의 cotG 유전자 서열을 얻기 위해서는 Bacillus subtilis genome site (http://www.
- html)를 이용하였다. PCR 증폭-을 위한 DNA primer는 Genotech (Taejeon, Korea) 에서 주무 구입하였다 PCR 증폭을 위해서는 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA) 을 사용하였다.
- 제한 효소, DNA ligase, 기타 필요한 시약은 Boehringer Manheim에서 구입하였다. PCR 증폭단편 및 유전자 단편, plasmid vector의 정제를 위해서는 Quiagen 사의 제품을 이용하였다.
- 두 개의 단백질 분해 효소가 제거된 고초균인 DB104가 전 실험에 걸쳐서 발현용 숙주로 사용되었다. 배양 배지로는 GYS 배지 ((NH4)2SC>4 2 g/L, yeast extract 2 g/L, K2HPO4 3.
- 걸쳐서 발현용 숙주로 사용되었다. 배양 배지로는 GYS 배지 ((NH4)2SC>4 2 g/L, yeast extract 2 g/L, K2HPO4 3.3 g/L, sodium citrate 0.1 g/L, glucose 0.1 g/L, M11SO4 H2O 0.1 g/L, CaCl2 0.16 g/L, MgSO4 7H2O 0.82 g/L)를 사용하였으며, 37℃ 에서 진탕배양기를 통하여 배양하였다. DB104 (pSDJH-cofG-知V의 선별과 배양을 위해서 chlonm叩henicol (5 mg/L)을 사용하였다.
- 유전자 클로닝을 위해서는 대장균 JM109와 DH5a를 사용하였다. 제한 효소, DNA ligase, 기타 필요한 시약은 Boehringer Manheim에서 구입하였다.
- 유전자 클로닝을 위해서는 대장균 JM109와 DH5a를 사용하였다. 제한 효소, DNA ligase, 기타 필요한 시약은 Boehringer Manheim에서 구입하였다. PCR 증폭단편 및 유전자 단편, plasmid vector의 정제를 위해서는 Quiagen 사의 제품을 이용하였다.
- 1681834, Germany) 사에서 구입하여 사용하였다. 표면 발현 모체인 고초균의 cotG 유전자 서열을 얻기 위해서는 Bacillus subtilis genome site (http://www.pasteHr.fi/Bio/subtiList.html)를 이용하였다. PCR 증폭-을 위한 DNA primer는 Genotech (Taejeon, Korea) 에서 주무 구입하였다 PCR 증폭을 위해서는 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA) 을 사용하였다.
이론/모형
- 완성된 발현벡터 pSDJH-c0G-/evlZ를 고초균으로 도입하기 위해서는 Two-step (SP I, SP II) 방법을 이용하였다 [13].
- 유전자 조작의 일반적인 방법은 Sambrook 등의 방법을 따랐다. 유전자 클로닝을 위해서는 대장균 JM109와 DH5a를 사용하였다.
성능/효과
- 3). 대조균인 DB104인 경우에 비하여, 목적 단백질을 표면 발현하고 있는 DB104 (pSDJH-o部의 경우, 각각의 포자가 나타내는 형광의 정도가 매우 크게 증가하여 , 그래프가 오른쪽으로 이동한 것을 확인할 수 있다. 이는 실험에서 의도한 바와 같이, 목적단백질인 levansucrase가 고초균 포자의 표면 위에 항체가 접근할 수 있을 정도에 바깥쪽 위치에 존재한다는 것을 증명하는 것이다.
- CotG-LevU 융합 단백질의 표면 발현은 Table 1에서 나타나 바와 마찬가지로 포자의 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 세 번씩 (Triplicate) 반복된 실험의 평균값에서, 대조균인 DB104와 융합 단백질을 표면 발현하는 DB104 (pSDJH-corG-ZevU) 포자 모두, 유의미한 포자 안정성의 차이를 보이지 않았고, 이는 CotG-LevU 융합단백질의 표면 발현이 고초균 포자의 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
후속연구
- — I I I I 1— :| 간l 1— xX-—j— I O、그L I /y\ I . 만약 %妃와 sacB가 제거된 고초균 변이주를 이용한다면, 표면 발현된 효소에 대한 더욱 확실한 효소 반응 정도의 차이를 볼 수 있으리라 사료된다.
- 본 연구에서는 안정적인 목적 단백질의 표면 발현을 위해서 , 고초균의 포자 형성 단백질인 cSG를 표면 발현 모체로 하여, Zymomonas mobilis 유래의 levansucrase를 고초균 포자위에 표면 발현하였다 유세포 분석기를 통해서 목적 단백질의 표면 발현을 증명하였고, levansucrase 효소 활성 측정을 통하여 표면 발현된 목적 단백질이 효소로서의 기능을 가지는 것을 보여주었다 마지막으로 열처리 및 lysozyme 처리를 통해서 , 표면 발현된 융합 단백질이 고초균 포자의 안정성에 영향을 미치지 않는 것을 입증하였다 지금까지 발표된 다른 논문결과들과 함께 , 고초균의 포자를 이용한 표면 발현 시스템은, 포자가 가지는 안정성을 비롯한 다양한 장점으로 말미암아 그 응용범위를 넓혀갈 것으로 기대된다. [10-12, 15].
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.