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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 최적발효조건이 확립되어 있는 Bacillus subtilis 균주를 이용하여 농도별 발효누에 추출물을 제조하고, 알코올 급여 흰 쥐에 급여하여 알코올성 간 손상에 대한 개선효과를 검토하고자 하였다.
- 본 연구에서는 고초균 발효누에 추출물을 급여함으로써 혈중 알코올 및 acetaldehyde가 유의적으로 감소하였으며, 이는 고초균 발효누에 추출물 급여에 따라 ADH 및 ALDH 활성이 증가하는 것에 기인하는 것으로 사료된다.
제안 방법
- Nitrocellulose membrane 상의 단백질은 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate의 image analysis 방법으로 검출하였다. 각각 반응된 ADH 및 ALDH protein band의 상대적 density는 densitometer(Lumi-Imager F1, Roche, Siwzerland)로 정량하였다.
- 간 조직 유래의 ADH 활성은 Bergmeyer의 방법[5]을 변형하여 340 nm 흡광도에서 NADH의 생성속도를 측정하였다. 즉, 반응액 조성은 증류수 1.
- 간 조직 유래의 ALDH 활성은 Koivula [19] 등의 방법을 약간 변형하여 acetaldehyde에서 acetate를 생성하는 효소로 NAD로부터 NADH를 생성하는 원리를 이용하였다.
- 간 조직으로부터 homogenate 분획 조제는 간을 일정량 취해 ice-cold potassium phosphate buffer 용액(0.1 M/L potassium phosphate containing 1mM/L sodium EDTA and 1 mM/L dithiothretiol, pH 7.4)을 9배량 첨가하여 IKAULTRA-TURRAX T25 basic homogenizer (IKA-WERKEGMBH & Co., KG, Staufen, Germany)를 이용하여 균질액을 제조하였다.
- 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하고, 약 30분 간 실온에 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분 간 원심분리하여 얻은 혈청을 혈청 생화학적 분석에 제공하였다.
- 동물실험은 4주 간 각 군별로 조제사료를 급여하면서 사육한 후, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍게 마취시켜 해부하였다.
- 본 실험은 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 사육실 온도(22±2℃)와 습도(55±5%) 및 명암주기(명주기: 07:00~19:00)가 조절되는 동물사육실에서 사육하였다.
- 수용성 추출물은 건조된 발효누에 분말 100 g을 칭량하여 10배수의 정제수를 가한 후 37℃ 항온수조에서 3시간씩 교반하면서 3회 반복 추출하였으며 추출액은 Whatman NO.2 여과지(Toyo 2A; Toyo Roshi, Tokyo, Japan)로 여과한 다음, 감압농축기(Buchi Rotavapor R-215, Flawil, Switzerland)로 50℃에서 농축하여 용매를 제거시키고 동결건조(Eyela FUD-2100, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)하여 실험동물에 사용하였다.
- 식이조성은 Table 1과 같으며, 정상군(N, Normal), 알코올 투여 대조군(C, Control), 알코올+누에추출물 5%(v/w) 투여군(SP5), 알코올+발효누에 추출물 1%(v/w) 투여군(BSP1), 알코올+발효누에 추출물 2.5%(v/w) 투여군(BSP2.5), 알코올+발효누에 추출물 5%(v/w) 투여군(BSP5)과 간 기능 개선제로 알려진 silymarin을 식이 중에 0.1%(v/w) 농도로 투여한 양성 대조군(PC, Positive control)의 총 7 군으로 나누어 실험을 진행하였다.
- 실험동물은 각 군마다 6마리씩 나누고, 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였으며 체중은 매주 한번씩 일정한 시간에 측정하였다.
- 이 때 알코올 투여는 실험동물에서 알코올에 의한 급성 독성을 막기 위해 알코올 농도를 처음 10%로 시작하여 최종 30% 농도로 1주일마다 단계적으로 높여 본 실험을 시작하면서 시료를 병용하였다.
- 즉, 반응액의 조성은 증류수 2.2 ml, 1.0M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 0.3 ml, 20 mM NAD+ 0.1 ml, 1.0M acetaldehyde 0.1 ml, 3.0 M KCl 0.1 ml, 0.33 M 2-mercaptoethanol 0.1 ml, 효소원 0.1 ml를 총 3 ml이 되도록 조절하여 cuvette에 넣고 30℃에서 5분 간 pre-incubation한 후, 5분 동안 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 즉, 혈중 alcohol 농도는 NAD와 phosphate buffer (pH 9.0) 3 ml 혼합액에 혈청 0.1 ml를 첨가한 후 약 3분 간 반응하여 340 nm 흡광도를 측정하고, 혼합액에 ADH 0.05 ml를 첨가하여 20℃에서 10분 간 incubation시켜 340 nm 흡광도에서 생성된 NADH 농도에 따른 흡광도의 변화를 관찰하였다.
- 채혈 후 각 조직을 적출하여 차가운 0.9% 생리식염수로 세척하고 여과지로 물기를 제거한 후 무게를 측정하고 분석 시료로 제공하였다.
- 해부 직후 적출한 간을 냉각 생리식염수로 관류하여 혈액을 제거시킨 상태에서 조직의 일정한 부위의 일부를 취하여 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 통상적인 조직처리인 파라핀포매 과정을 거쳐 3~4 μm 두께로 절편하여 hematoxylin and eosin (H&E) 염색한 후 광학현미경(Olympus BX41, Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다[8].
- 혈중 acetaldehyde 농도는 NAD와 phosphate buffer (pH 9.0) 3 ml 혼합액에 혈청 0.2 ml를 첨가한 후 약 3분 간 반응하여 340 nm 흡광도를 측정하고, 혼합액에 ALDH 0.05 ml를 첨가하여 20~25℃에서 5분간 반응시켜 흡광도 340 nm에서 생성된 NADH의 농도에 따른 흡광도의 변화를 관찰하였다.
- 혈청 중의 total lipid, total cholesterol, HDL-cholesterol, free fatty acid, phospholipid, total protein, albumin 농도 및 AST, ALT, ALP, LDH 활성은 의료 전문 수탁 검사기관인 서울의과학연구소(경기도 용인, 한국)와 동남의화학연구소(부산, 한국)에 의뢰하여 분석하였다.
- 혈청에 함유된 alcohol 및 acetaldehyde 농도는 시판용R-Biopharm 사의 UV-Test kit (Darmshadt, Germany)를 이용하여 측정하였다. 즉, 혈중 alcohol 농도는 NAD와 phosphate buffer (pH 9.
대상 데이터
- 누에분말은 2017년 3월 열풍 건조된 분말을 보은누에토종농장(충북 보은, 한국)에서 구입하였다. 발효 균주는 본 연구실에서 분리·등록한 단백질 분해능이 우수한 Bacillus subtilis KACC 91157 균주[27]를 사용하여 열풍 건조 누에분말을 발효시켜 사용하였다.
- 발효 균주는 본 연구실에서 분리·등록한 단백질 분해능이 우수한 Bacillus subtilis KACC 91157 균주[27]를 사용하여 열풍 건조 누에분말을 발효시켜 사용하였다.
- 실험동물은 5주령의 Sprague-Dawley 계 수컷 흰 쥐를 ㈜대한바이오링크(충북 음성, 한국)에서 구입하여 일주일 간 시판 고형 사료를 급여하면서 환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean ± SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan’s multiple range test로 하였다[11].
이론/모형
- Homogenate, mitochondria, microsome 분획의 단백질 농도는 Bradford 방법에 준하여 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 측정하였다[6].
- Nitrocellulose membrane 상의 단백질은 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate의 image analysis 방법으로 검출하였다.
- TBARS 법을 이용하여 조직 내 과산화지질 함량을 측정한 결과는 Fig. 6과 같다.
- 분획한 homogenate, mitochondria 및 microsome 생체막의 과산화지질 함량은 TBARS 방법[26]에 준하여 측정하였다. 단백질 1 mg을 함유한 분획 용액 1 ml에 각각 TBA (thiobarbituric acid) 시약 2 ml를 가하여 잘 혼합하고, 끓는 물에서 30분 간 반응시킨 뒤 실온에서 방냉하여 3,000 rpm으로 10분 간 원심분리한 후 상등액을 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 따라서 알코올 급여 흰 쥐에 고초균 발효누에 추출물을 병용하였을 때 알코올 대사와 관련된 ADH 및 ALDH 효소 활성과 단백질 발현량이 유의적으로 증가하여 양성 대조군과 유사한 수준을 나타내었으며 이러한 결과로 보아 고초균 발효누에 추출물은 간 조직 내 알코올 대사에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- ALP 활성 또한 정상군에 비해 알코올 투여군에서 활성이 유의적으로 증가하였으며 BSP 투여군에서 농도에 의존적으로 활성이 감소하여 BSP5 군에서는 정상군에 가까운 수치를 나타내어 간 기능 개선에 긍정적인 영향을 준 것으로 사료된다.
- AST 및 ALT 활성은 정상군에 비해 알코올 투여군에서 유의적으로 높은 활성을 보였으며 이는 알코올 투여로 인한 간 손상에 기인하는 것으로 사료된다.
- BSP 투여군에서는 농도에 의존적으로 glutathione 농도가 회복되었으며 특히 BSP5 군은 간 조직 및 혈중 glutathione 농도가 정상군과 유사한 수준으로 회복되어 고초균 발효누에 추출물이 알코올 투여로 인한 간 조직 및 혈중 glutathione 농도 감소의 회복에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 간 조직의 ADH 활성을 측정한 결과, 정상군과 C 군은 ADH 활성에 차이를 보이지 않았으나, BSP 투여군에서는 유의적으로 활성이 증가한 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 간 조직의 무게는 N군과 비교하였을 때 알코올 투여군에서 유의적으로 증가하는 경향을 보여 알코올 투여에 의한 알코올성 지방간 유발되었음을 확인할 수 있었다.
- 따라서 고농도의 발효누에 추출물이 알코올 급여 흰 쥐의 간 조직 내 ADH 및 ALDH 활성을 유의적으로 증가시키는 것으로 생각되며 알코올 급여 흰 쥐의 혈중 알코올 및 acetaldehyde 농도가 감소하는 결과를 어느정도 뒷받침 해주는 것으로 보여진다.
- 따라서 고초균 발효누에 추출물은 알코올성 간 손상에 대한 개선효과를 가지는 것으로 확인할 수 있었다.
- SP 및 BSP 투여군에서는 C 군에 비해 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며 특히 BSP5 군에서는 정상군과 비슷한 수준의 수치를 나타내었다. 따라서 고초균 발효누에 추출물이 혈중 지질농도 개선에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 또한 BSP5 군에서 PC 군과 유사한 수준의 단백질 발현량을 보이며 ADH 및 ALDH 효소 활성과 단백질 발현량이 상관관계가 높은 것을 알 수 있었다.
- 또한 SP 및 BSP 투여군에서 과산화지질 농도가 감소하는 경향을 보였으며 특히 BSP5 군에서는 가장 낮은 수치를 보여 고농도의 고초균 발효누에 추출물을 급여함에 따라 알코올성 간 손상이 어느정도 개선된 것으로 사료된다.
- 또한 SP 및 BSP 투여군에서도 혈중 중성지질 농도가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 혈중 유리지방산의 농도 역시 정상군에 비해 알코올 투여군에서 높은 수치를 보였으며 SP 및 BSP 투여군 모두 C 군에 비해 감소하는 경향을 보였다.
- 또한 혈중 총 콜레스테롤 농도 역시 정상군에 비해 알코올 투여군에서 높게 측정되었으며 SP 및 BSP 투여군에 의해 유의적으로 수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 보여 고초균 발효누에 추출물의 급여가 혈중 과산화지질 농도에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
- 한편 알코올은 간 조직 내 triglyceride 형태로 지방 축적을 일으키는 것으로 알려져 있으며, Kim [18] 등에 의하면 알코올 투여에 의해 간 조직 내 중성지질 축적이 일어나는 것을 확인하기 위해 흰 쥐에 3 g/kg의 용량으로 알코올을 급여시킨 결과 수 시간 내에 간 조직 내 중성지질의 수준이 증가한다고 보고하였다. 본 연구에서는 간 조직 및 혈중 중성지질 농도가 정상군과 비교하였을 때 알코올 투여군에서 유의적으로 증가하여 알코올성 지방간이 유발된 것을 확인할 수 있었다. 특히 BSP 투여군에서 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, 특히 BSP5 군에서는 중성지질 농도가 정상군과 비슷한 수준으로 감소하여 고농도의 발효누에 추출물에 의해 알코올성 지방간이 어느정도 개선되는 것으로 생각할 수 있다.
- 본 연구에서도 이와 유사한 결과를 나타내었으며 고초균 발효누에 추출물을 급여함으로서 알코올성 간 손상 모델 흰 쥐의 조직 내 과산화지질 함량 감소에 개선효과를 가지는 것으로 사료된다.
- 신장, 심장, 비장 및 고환의 무게는 각 군마다 수치상의 유의적인 차이를 보이지 않았으며 신장 주위 지방과 고환 주위 지방은 정상군에서 높은 수치를 보였으나 알코올 투여군에서는 낮은 수치를 보여 알코올 투여에 따라 정상적인 지질대사가 이루어지지 않은 것으로 사료된다.
- 실험동물을 해부한 직후 간 조직을 적출하여 병리학적 검사를 실시한 결과, 정상군에서는 간 소엽의 구조가 잘 유지되어 있었으며, 간세포는 둥근 핵을 가지고 규칙적으로 배열되어 있었다(Fig. 8).
- 알코올 투여 대조군은 간세포 내 지방구의 수와 크기가 증가하여 알코올성 지방간의 유발이 일어난 것을 확인하였다.
- 혈중 총 지질 농도는 혈중 중성지질 농도와 유사한 경향을 나타내었다. 정상군에 비해 알코올 투여군에서 수치가 유의적으로 증가하였으며, SP 및 BSP 투여군에서는 혈중 총 지질농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 특히 BSP 투여군은 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며 BSP5 군에서는 정상군에 가까운 수치를 보였다.
- 정상군에 비해 C 군에서 약간의 활성 증가를 보였으며, PC 군, SP 및 BSP 투여군에서는 ALDH 활성이 유의적으로 증가하였다.
- 정상군에서 가장 낮은 발현량을 보였으며 PC 군에서 가장 높은 발현량을 나타내었다.
- 특히 BSP 투여군은 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며 BSP5 군에서는 정상군에 가까운 수치를 보였다.
- 또한 SP 및 BSP 투여군에서도 혈중 중성지질 농도가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 BSP5 군에서는 정상군, PC 군과 비슷한 수준의 수치를 보여 혈중 중성지질 농도 감소에 효과적인 것을 알 수 있었다.
- 한편 BSP 투여군은 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며 특히 BSP5 군에서 가장 낮은 활성을 보여 고초균 발효누에 추출물의 급여가 알코올성 간 손상에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 혈중 acetaldehyde 농도는 정상군에 비해 알코올 투여군에서 유의적으로 높은 수치를 보였으나 BSP 투여로 인해 감소하는 것으로 나타났다.
- 혈중 알코올 농도는 정상군에 비해 알코올 투여군에서 유의적으로 증가하였으며 SP 및 BSP 투여에 따라 감소하는 경향을 보였다.
- 흰 쥐에서 알코올 급여를 하였을 때 간 조직 및 혈중 glutathione 농도가 저하되었으나, SP 및 BSP 투여로 인해 glutathione 농도가 회복되는 것으로 확인되었다(Fig. 7).
후속연구
- 이러한 결과로 보아 고초균 발효누에 추출물을 알코올성 간 손상 모델 흰 쥐에 급여하였을 때 혈중 간 기능 지표 효소 활성의 감소, 간 조직 및 혈중 중성지질 농도 개선, 조직 내 과산화지질 농도 개선 등의 효과를 보여 알코올성 간 손상에 대한 개선효과를 가지는 건강기능식품의 소재로서 활용할 가치가 높은 것으로 사료된다.
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