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문제 정의
- Asia1/Shamir는 세계동물보건기구(Office inter national des epizooties, 아©에서도 우선 순위가 높은 것으로 추천하고 있으며 현재 우리나라에서 백신주로 선정되어 있으나 아직 그 바이러스의 전체 염기서열이 밝혀져 있지 않다. 백신주는 바이러스 유행형에 따라 달라질 수 있어 대부분의 혈청형의 경우 발생하는 바이러스의 유행형에 따라 여러 백신주가 선정, 추천되고 있으나 Asia1 혈청형의 경우는 Asia1/ Shamir 한 가지만추천하고 있다 따라서 이 논문에서는 국내에 유입 가능성이 있는 Asia1 혈청형의 바이러스에 대비해 백신주 Aia1/Shamir 의 전체 염기서열을 확인하고 이를 통해 방어 가능성을 예측, 구제역 발생시 빠른 대처가 가능하도록 염기서열 분석을 통한 바이러스의 특성을 파악해 보고자 하였다
- 주변지역에서 유입 위험이 큰 바이러스와 유사한 백신주의 적절한 선정 및 이에 따른 백신정책은 바이러스의 전파를 막는 중요한 요소가 될 수 있다. 이러한 실제적인 백신 정책의 효용성을 유전적인 변화 측면에서 판단할 수 있도록 이번 실험을 시도하게 되었다.
제안 방법
- SuperScript™ First-Strand Synthesis System (Invitrogen,USA)을 이용해 RNA로부터 cDNA 합성하였다. RNA 5 ul primer로는 oligo dT를 1 [U 그리고 10 mM dNTPs를 1 [l, 총 10 [l 로 65oC 에서 5 분 반응 후 ice 에서 최소 1 분간 처리하였다.
- RNA 5 ul primer로는 oligo dT를 1 [U 그리고 10 mM dNTPs를 1 [l, 총 10 [l 로 65oC 에서 5 분 반응 후 ice 에서 최소 1 분간 처리하였다. 그리고 50oC 에서 50분, 85oC 에서 5분 반응 후 RNase H를 1 [l를 넣고 37oC에서 20분간 반응 시켜 나머지 RNA를 제거하였다 합성된 cDNA 2 [l를 Phusion® Hot Start enzyme (Finnzyme, Finland) 을 이용해특이적으로 결합 가능한 primer를 합성하고 (Table 1), 5개의 단편으로 나누어 PCR을 수행하였다. Phusion® Hot Start enzyme 의 제조사에서 제시된 protoc이에 따라 PCR mix는 최종 50 ul가 되게 조정하였다.
- 바이러스 RNA는 RNeasy MINI kit (QIAGEN, USA) 를 이용하여제조사에서 추천한 방법대로 추출하였다.
- 염기서열 분석은 M13 frward와 M13 reverse universal primer롤 이용하여 ABI Prism 3730xi DNA sequencer (Applied BiosystemsTM, Life Technologies'™, USA)로 수행하였다 염기서열의 Align 및 분석, 유사도 분석은Clone Manager professional suite (Scientific & Educatio nal Software, USA), DNASTAR package (DNASTAR, INC., USA)를 이용하여 결과를 얻었다. Phylogenetic tree 의 제작과 identity 분석에는 MEGA version 3.
- 전체 DNA 중 poly C 서열이 포함된 5' region 근처의 352nt 부터 947nt 까지의 염기서열 부분은 primer 220F 와 710R(Table 1)로 PCR 수행한 후 QIAquick Gel Ext^c- tion Kit (QIAGEN, USA)를 이용해 agarose gel에서 분리, 정제하였고 그 후 pGEM®-T Easy vector (Promega, USA)에 삽입하였다 그 후 형성된 콜로니를 선별하여 Accu-Power® PCR premix (Bioneer, Korea)를 이용해 M13 for ward^ M13 reverse universal primer를 이용, colony PCR을 시행해 클로닝이 확인된 플라스미드를 DNA 염기서열 분석을 하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 구제역 바이러스는 백신주인 Asia1/ Shamir (ISR 3/89) 주로 2009년 세계 구제역 표준연구소로부터 Bovine thyroid cell (BYT) 에서 한번 계대 후 Baby hamster kidney cell(BHK) 에서 3 번 계대한 바이러스를 분양받아 국립수의과학검역원(National VeterinaryResearch and Quarantine Service, NVRQS) 의 Biosafetylevel III (BL-3) 실험실에서 실험을 수행했다. 바이러스 RNA는 RNeasy MINI kit (QIAGEN, USA) 를 이용하여제조사에서 추천한 방법대로 추출하였다.
- 이 실험에서 분석된 Asia1/Shamir의 전체 유전자(Table 2)의 크기는 poly C와 Internal ribosome entry site (IRES) 등을 포함한 5'-UTR 부분 1, 100nt와 6, 989nt 길이의 ORF, 3'-UTR 110nt 를 포함해 8, 202 bp 였다. ORF 는 2, 329개의 polyprotein을 암호화하며 poly C 부위 cytosine 의 개수는 실험 시 마다 다양하게 나타났으나 최소 15개 이상으로 확인되었다
이론/모형
- , USA)를 이용하여 결과를 얻었다. Phylogenetic tree 의 제작과 identity 분석에는 MEGA version 3.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA)을 이용했으며, 염기서열의 similarity를 분석에 Simplot 3.5.1software 를 이용하여 자료를 정리하였다 전체 염기서열의 Align 비교에 이용한 혈청형은 Table 2와 같다.
성능/효과
- 1D 부위의 서열을 바탕으로 radial phylogenetic tree 를확인한 결과 Asia1/Shamir 백신주는 기존에 알려진 gen-otype 의 어느 그룹에도 속하지 않았다. Shamir는 group III, VI, I과 유전적으로 가까운 곳에 있었으며 group II, group IV 및 group "와는 유전적 거리를 두고 있음이 확인되었다(Fig.
- 1% 의 유사도 평균보다 낮은 수치를 보였다. 그중에서도 1D 부분의 유사도가 뉴클레오타이드 서열, 아미노산 서열 모두 74.5%, 67.3%로 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다(Table 3).
- 다른 구제역 바이러스와 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열의 유사도를 각각 비교해본 결과, 구조단백질인 P1 부위 1A 부터 1D 까지의 부위가 각각 평균 74.5 -89.9%, 67.3〜71.9% 정도였으며 비구조 단백질 P2는 뉴클레오타이드 서열이 평균 91.3 〜93.8%, 아미노산은80.2〜83.6% P3는 각각 91.4〜93.2% 77.4〜84.3%로 평균 범위를 보였다 P1 부위가 다른 부위의 91.4〜100%,77.4 〜 95.1% 의 유사도 평균보다 낮은 수치를 보였다. 그중에서도 1D 부분의 유사도가 뉴클레오타이드 서열, 아미노산 서열 모두 74.
- 다시 한 번 증명되었다. 따라서 이 결과는 Sh amir 주와의 변화 부위를 판단하기 위해서 P1 부위와 1D 부위를 분석하면 방어가 가능한 항원의 변화를 알 수 있는 후보 부위라는 것이 확인되었다.
- 가까운 것으로 밝혀졌다. 또한, 염기서열이 알려진 모든 Asia1 혈청형과의 유사율 및 유사도 비교에서 예상대로 구조 단백질인 P1 의 차이가 가장 크게 나타났으며, 비구조 단백질인 P2 및 P3 부위에서는 변화가 심하지 않았으며, 아미노산 서열 중에서 가장 유사성이 낮은 부위는 P1 부위로 1D, 1A, 1C, 1B 순이었다. 이 중 특히 1D(VP1) 서열은 세포와의 결합부위로 알려졌으며, 뉴클레오타이드와 아미노산 서열에서 가장 변화가 심한 부위라는 것이 이번 결과로 다시 한 번 확인되었다 또한 1D 의 아미노산 서열에서 다른 Asia1 바이러스와 5개 residue 에서 뚜렷한 차이를 보인 것은 Shamir주의 특징이었다.
- 비구조 단백질 부위에서는 P2 보다는 P3 부위가 유사도 범위가 더 넓었으며 P1 부위보다는 낮았다 P2와 3' UTR의 변화는 전반적으로 낮은 것으로 확인되었다.
- 유사도 그래프 분석 결과 1D, 1B, L, 5' UTR 순으로 그 변화가 커짐을 확인할 수 있었고, 전반적으로 구조단백질이 포함된 부위인 5' UTR에서 P1 까지의 변화가 뚜렷하였다. 비구조 단백질 부위에서는 P2 보다는 P3 부위가 유사도 범위가 더 넓었으며 P1 부위보다는 낮았다 P2와 3' UTR의 변화는 전반적으로 낮은 것으로 확인되었다.
- 또한, 염기서열이 알려진 모든 Asia1 혈청형과의 유사율 및 유사도 비교에서 예상대로 구조 단백질인 P1 의 차이가 가장 크게 나타났으며, 비구조 단백질인 P2 및 P3 부위에서는 변화가 심하지 않았으며, 아미노산 서열 중에서 가장 유사성이 낮은 부위는 P1 부위로 1D, 1A, 1C, 1B 순이었다. 이 중 특히 1D(VP1) 서열은 세포와의 결합부위로 알려졌으며, 뉴클레오타이드와 아미노산 서열에서 가장 변화가 심한 부위라는 것이 이번 결과로 다시 한 번 확인되었다 또한 1D 의 아미노산 서열에서 다른 Asia1 바이러스와 5개 residue 에서 뚜렷한 차이를 보인 것은 Shamir주의 특징이었다. 따라서 P1 부위 특히 1D 부위의 염기서열 분석이 구제역 바이러스의 특성 파악 및 방어 가능성 예측을 가능하게 해줄 강력한 후보라는 것이 확인되었다 1D 부위의 epitope 부위 염기서열 분석으로 백신 주의 방어 가능성을 예측할 수 있다면 Asia1 혈청형의 바이러스가 국내 유입되었을 때라도 특정 부위의 염기서열분석만으로 빠른 대처가 가능하리라 생각한다.
- 이번 실험의 결과, 구제역 바이러스 백신 주 Shamir 의 전체 염기서열은 8, 209 bp로 전체 유전자의 염기서열이 밝혀진 다른 바이러스주와 비교했을 때 group III 와 가까운 것으로 밝혀졌다. 또한, 염기서열이 알려진 모든 Asia1 혈청형과의 유사율 및 유사도 비교에서 예상대로 구조 단백질인 P1 의 차이가 가장 크게 나타났으며, 비구조 단백질인 P2 및 P3 부위에서는 변화가 심하지 않았으며, 아미노산 서열 중에서 가장 유사성이 낮은 부위는 P1 부위로 1D, 1A, 1C, 1B 순이었다.
- 이번 실험의 결과로 구제역 바이러스 백신주 Sh amir와 알려진 모든 Asia1 혈청형과의 유사율 및 유사도 그래프 비교에서 예상대로 구조단백질인 P1 의 차이가 가장 크게 나타났으며, 비구조 단백질인 P2 및 P3 부위에서는 변화가 심하지 않았다 P1 부위 중 특히 1D(VP1) 서열은 세포와의 결합부위로 알려졌으며, 뉴클레오타이드와 아미노산 서열에서 가장 변화가 심한 부위라는 것이 이번 결과로 다시 한 번 증명되었다. 따라서 이 결과는 Sh amir 주와의 변화 부위를 판단하기 위해서 P1 부위와 1D 부위를 분석하면 방어가 가능한 항원의 변화를 알 수 있는 후보 부위라는 것이 확인되었다.
- 전체 유전자의 염기서열이 밝혀진 strain과 phyloge netic tree를 만들어 비교해 보았을 때, group III와 가까운 위치에 속하는 것을 확인할 수 있었고, P1 부위, 1D 부위의 염기서열로 비교했을 때도 역시 같은 결과를 보였다(Fig. 1).
후속연구
- 이 중 특히 1D(VP1) 서열은 세포와의 결합부위로 알려졌으며, 뉴클레오타이드와 아미노산 서열에서 가장 변화가 심한 부위라는 것이 이번 결과로 다시 한 번 확인되었다 또한 1D 의 아미노산 서열에서 다른 Asia1 바이러스와 5개 residue 에서 뚜렷한 차이를 보인 것은 Shamir주의 특징이었다. 따라서 P1 부위 특히 1D 부위의 염기서열 분석이 구제역 바이러스의 특성 파악 및 방어 가능성 예측을 가능하게 해줄 강력한 후보라는 것이 확인되었다 1D 부위의 epitope 부위 염기서열 분석으로 백신 주의 방어 가능성을 예측할 수 있다면 Asia1 혈청형의 바이러스가 국내 유입되었을 때라도 특정 부위의 염기서열분석만으로 빠른 대처가 가능하리라 생각한다.
- Asia1 형을 비롯한。및 A형에 대한 3종 혈청형에 대한 예방체계를 구축하여야 하며, 지속적으로 긴급 발생 상황 시 주변지역의 발생 지역형과 및 유전적 분석에 의한 관련된 적절한 유전형 백신으로 개발하거나 비축하여야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.