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문제 정의
- COPP의 자극에 의한 HO-1 유전자 발현 과정에 관여하는 Nrf2 외 다른 조절인자들의 활성에 DADS가 미치는 영향을 조사하였다. HO-1 유전자 발현을 조절하는 여러 전사인자 중 하나인 Nrf2는 세포질에서 Keap1과 결합하여 불활성 상태로 있다가 적합한 자극에 의해 Keap1이 thiol기를 산화시켜 Nrf2을 떨어지게 하여 핵내로 이동하게 해준다.
- 본 연구에서는 유기 황화합물 중에서 가장 강력한 약리작용을 보이는 DADS가 HO-1과 그 전사인자인 Nrf2의 발현에 미치는 영향을 인간 간암세포주 HepG2에서 조사하였다. 또한 HO-1의 강력한 유도제로 알려져 있는 CoPP와 hemin에 의해 유도되는 HO-1의 발현과정에서 DADS의 효과에 대해서도 조사하였다.
- 최근의 보고에 따르면 DADS를 포함한 마늘의 주요 유기 황화합물이 Nrf2의 활성화를 통해 HO-1의 발현을 증가시킨다는 연구결과가 있다[4,11]. 본 연구에서는 유기 황화합물 중에서 가장 강력한 약리작용을 보이는 DADS가 HO-1과 그 전사인자인 Nrf2의 발현에 미치는 영향을 인간 간암세포주 HepG2에서 조사하였다. 또한 HO-1의 강력한 유도제로 알려져 있는 CoPP와 hemin에 의해 유도되는 HO-1의 발현과정에서 DADS의 효과에 대해서도 조사하였다.
제안 방법
- 24시간 배양 후 상층액과 0.01% trypsin-EDTA을 이용하여 부착한 세포를 수확하여 FBS를 포함하는 PBS로 2번 세척한 후 300× g로 원심분리를 시행하였다.
- 마지막으로 extension 72℃에서 5분간 반응하였다. DNA 증폭양상을 확인하기 위하여 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후, ethidium bromide에 염색하여 UV 램프 상에서 확인하였다. DNA polymerase의 primer는 다음과 같다: HO-1, 5’-CGGGCCAGCAACAAAGTG-3’(sense) and 5’-AGTGTAAGGACCCATCGGAGAA-3’(antisense), Nrf2, 5’-GAGAGCCCAGTCTTCATTGC-3’(sense) and 5’-TGCTCAATGTCCTGTTGCAT-3’ (antisense), and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’ (sense) and 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’ (antisense).
- HO-1 유도제의 자극으로 HO-1의 발현을 증가시키는 경우 DADS가 HepG2 세포에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구를 위하여 강력한 HO-1 유도제로 널리 사용되는 cobalt protoporphyrin (CoPP)과 hemin을 사용하였다.
- 각 2μg의 RNA를 사용하여 제조사의 지침에 따라 superscript reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 제작하였고, 합성된 cDNA는 -20℃에 보관하였다. PCR은 pre-heating time을 95℃에서 5분간 반응한 다음, denaturation 95℃에서 10초, annealing은 57℃에서 10초, extension은 72℃에서 10초간 실시하여 30 cycles을 시행하였다. 마지막으로 extension 72℃에서 5분간 반응하였다.
- 각 2μg의 RNA를 사용하여 제조사의 지침에 따라 superscript reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 제작하였고, 합성된 cDNA는 -20℃에 보관하였다.
- 5 mM)의 DADS를 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 다음 trypan blue dye exclusion 방법으로 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하였다. 세포의 생존율에서는 1 mM DADS 까지는 큰 영향을 보이지 않았다.
- 4). 그리고, DADS 전처리는 CoPP에 의해 유도되는 Bach1의 세포질로의 이동과 small Maf의 핵내의 축적을 더욱 증가시켰다. 이러한 DADS가 HO-1 유전자 발현에 관련된 전사인자들의 활성에는 영향을 주지 못하는 것을 확인하였는데, 이는 DADS가 CoPP 처리에 의한 HO-1유전자 발현을 억제하지 못한다는 결과와 부합한다.
- 3B). 다음으로 HO-1 유도제에 의한 HO-1의 단백질 합성의 DADS에 의한 감소가 유전자 수준에서도 단백질과 같은 발현 양상을 나타내는지 조사하기 위하여 RNA를 분리하여 RT-PCR을 이용해 분석하였다. 흥미롭게도, CoPP에 의해 유도되는 HO-1과 전사인자 Nrf2의 RNA 수준에서는 DADS에 의해 억제되지 않고 발현이 유지됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 1B), 이는 DADS가 1 mM 이상의 고농도에서는 HepG2 세포에 독성을 주어 세포사멸을 일으킬 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 본 연구에서는 DADS가 HepG2 세포의 세포사멸을 유도하지 않는 범위의 농도를 사용하였다.
- 마늘의 주요 약리 성분인 유기 황화합물 DADS에 의한 인간 간암세포주 HepG2의 생존율에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 배양중인 세포에 다양한 농도(0.2, 0.5, 1, 2.5 mM)의 DADS를 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 다음 trypan blue dye exclusion 방법으로 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하였다.
- Membrane은 항체의 비특이적 부착을 막기 위하여 5% skim milk에 1시간 동안 두었고, 그 후 필요한 일차 항체 및 horse radish peroxide (HRP)가 부착되어 있는 2차 goat 항체를 반응시켰다. 부착된 면역복합체는 ECL kit를 이용하여 X-ray 필름에 표현하여 단백질 발현을 분석하였다.
- 세포를 PBS로 세척한 후, Fermetas (Waltham, MA, USA) 제품인 ProteoJET™ cytoplasmic/ nuclear protein extraction kit를 이용하여 제조사가 추천하는 protocol에 의거하여 세포질과 핵 단백질을 분리하였다.
- 01% trypsin-EDTA을 이용하여 부착한 세포를 수확하여 FBS를 포함하는 PBS로 2번 세척한 후 300× g로 원심분리를 시행하였다. 세포를 배양액에서 sesuspension 시킨 후 trypan blue dye exclusion 방법을 이용하여 hemocytometer 상에서 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하여 생존율을 분석하였다. 실험은 3번 이상 반복하였으며, 결과의 수치는 3개의 독립적인 dish에서 수행한 값을 means±SD 값으로 나타내었다.
- 세포질 및 핵 단백질의 오염을 측정을 위하여 histone과 β-actin에 대한 항체를 각각 사용하였다.
- 약물을 처리한 세포를 PBS로 세척한 후, TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 RNA를 분리하고 spectrophotometer를 이용하여 RNA를 정량하였다. 각 2μg의 RNA를 사용하여 제조사의 지침에 따라 superscript reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 제작하였고, 합성된 cDNA는 -20℃에 보관하였다.
- 약물을 처리한 세포를 PBS로 세척한 후, 단백질 분해효소 저해제(protease inhibitor cocktail)를 포함한 lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40)를 첨가하여 세포의 전체 단백질을 추출하였다. Bicinchoninic acid를 이용하여 정량하고, 동일한 양의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후 electroblotting apparatus (Bio-rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 단백질을 nitrocellulose membrane에 이동시켰다.
대상 데이터
- DADS는 Fluka Chemical Co. (Bucha, Switzerland) 제품을 사용하였다. Protease inhibitor cocktail, trypan blue, CoPP, hemin은 Sigma Chemical Co.
- Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bach1, Keap1, small Maf에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA) 제품을 사용하였고, RT-PCR에 필요한 reverse transcriptase, dNTP mixture, DNA polymerase 등의 시약은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 제품을 사용하였다.
- Nrf2, HO-1, Bach1, β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였다.
- Nrf2, HO-1, Bach1, β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였다. Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bach1, Keap1, small Maf에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA) 제품을 사용하였고, RT-PCR에 필요한 reverse transcriptase, dNTP mixture, DNA polymerase 등의 시약은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 제품을 사용하였다.
- (Bucha, Switzerland) 제품을 사용하였다. Protease inhibitor cocktail, trypan blue, CoPP, hemin은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. Nrf2, HO-1, Bach1, β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였다.
- HO-1 유도제의 자극으로 HO-1의 발현을 증가시키는 경우 DADS가 HepG2 세포에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구를 위하여 강력한 HO-1 유도제로 널리 사용되는 cobalt protoporphyrin (CoPP)과 hemin을 사용하였다. 배양중인 HepG2 세포에 50 μM CoPP를 처리하면 HO-1과 전사인자 Nrf2의 발현이 6시간부터 시간이 지남에 따라 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 실험에서 사용된 인간 간암세포주 HepG2는 한국세포주은행에서 구입하였고, 세포배양에 필요한 minimum essential medium (MEM), fetal bovine serum (FBS), 항생제, trypsin-EDTA는 HyClone Laboratories Inc. (Logan, UT, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. HepG2 세포는 10% FBS, 100 μg/ml streptomycin/100 U/ml penicillin이 함유된 MEM 배양액에서 5% CO2 조건에서 37℃ incubator에서 배양하였다.
이론/모형
- 세포를 PBS로 세척한 후, Fermetas (Waltham, MA, USA) 제품인 ProteoJET™ cytoplasmic/ nuclear protein extraction kit를 이용하여 제조사가 추천하는 protocol에 의거하여 세포질과 핵 단백질을 분리하였다. 분리된 각각의 단백질은 정량한 후 Western blot analysis를 이용하여 분석하였다. 세포질 및 핵 단백질의 오염을 측정을 위하여 histone과 β-actin에 대한 항체를 각각 사용하였다.
성능/효과
- 1A). 그러나 1 mM 이상에서 세포사멸 관련 단백질인 활성형 PARP의 분절화(fragmentation)가 명확하게 확인되었는데(Fig. 1B), 이는 DADS가 1 mM 이상의 고농도에서는 HepG2 세포에 독성을 주어 세포사멸을 일으킬 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 본 연구에서는 DADS가 HepG2 세포의 세포사멸을 유도하지 않는 범위의 농도를 사용하였다.
- 또한, diallyl sulfide (DAS)가 ROS 경유 Nrf2 및 MAPK의 활성을 통하여 HO-1의 발현을 유도한다는 연구결과도 보고되었다[11]. 그러나 본 연구에서는 상반된 결과가 나타났는데, DADS를 농도별로 HepG2 세포에 단독 처리하였을 때, HO-1의 발현은 RNA 뿐만 아니라 단백질 수준에서도 유도되지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이는 세포사멸을 일으키는 높은 농도의 경우에서도 같은 결과를 볼 수 있었다(data not shown).
- 3A). 그러나, DADS가 1시간 전처리 된 HepG2 세포에 CoPP를 처리한 경우에는 HO-1 단백질의 양이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 이때 전사인자 Nrf2 단백질의 양은 DADS 처리에 의해 억제되지 않고 발현이 유지되었다.
- 배양중인 HepG2 세포에 50 μM CoPP를 처리하면 HO-1과 전사인자 Nrf2의 발현이 6시간부터 시간이 지남에 따라 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 3A).
- 또한 HO-1 발현은 전사 억제인자로 알려져 있는 Bach1의 불활성화가 요구되는데, Bach1은 자극이 없는 경우에는 HO-1 유전자 promoter의 ARE 부위에 결합하고 있다가 자극이 오면 떨어져 세포질로 나가면서 Nrf2/small Maf 이량체가 ARE에 결합이 가능하도록 하여 HO-1 유전자 발현이 개시된다[13]. 본 연구에서 DADS 단독 처리는 핵내 전사조절 억제 인자인 Bach1의 감소와 small Maf의 증가를 보였으며, Nrf2와 결합하고 있는 Keap1의 변화는 없는 것으로 나타났다(Fig. 4). 그리고, DADS 전처리는 CoPP에 의해 유도되는 Bach1의 세포질로의 이동과 small Maf의 핵내의 축적을 더욱 증가시켰다.
- 실험은 3번 이상 반복하였으며, 결과의 수치는 3개의 독립적인 dish에서 수행한 값을 means±SD 값으로 나타내었다.
- 3C). 이러한 결과를 볼 때, CoPP 같은 HO-1 유도제로 자극한 HepG2 세포의 HO-1 발현 과정에서, DADS는 HO-1 유도제에 의해 자극된 HepG2 세포에서 HO-1 유전자의 전사 후 단백질 합성과정을 억제하는데 역할을 하는 것으로 볼 수 있다. 그러므로, HO-1 유전자의 전사 후 단백질로의 번역 과정에 관여하는 세포내 인자들과 DADS의 상호관련성을 살펴보는 것이 필요하다고 여겨진다.
- 다음으로 HO-1 유도제에 의한 HO-1의 단백질 합성의 DADS에 의한 감소가 유전자 수준에서도 단백질과 같은 발현 양상을 나타내는지 조사하기 위하여 RNA를 분리하여 RT-PCR을 이용해 분석하였다. 흥미롭게도, CoPP에 의해 유도되는 HO-1과 전사인자 Nrf2의 RNA 수준에서는 DADS에 의해 억제되지 않고 발현이 유지됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3C). 이러한 결과를 볼 때, CoPP 같은 HO-1 유도제로 자극한 HepG2 세포의 HO-1 발현 과정에서, DADS는 HO-1 유도제에 의해 자극된 HepG2 세포에서 HO-1 유전자의 전사 후 단백질 합성과정을 억제하는데 역할을 하는 것으로 볼 수 있다.
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