본 실험은 bioceramic을 첨가하여 만든 다공성 poly D,L-lactic-co-glycolic acid(PLGA)-scaffold가 인간 지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)의 골 형성과정에 효과적인지를 알아보고자 수행하였다. ATMSCs를 well plate에 접종하여 골형성 유도(osteogenic induction, OI) 배양액으로 28일 동안 배양하였다. OI배양액군의 증식률은 세포접종 후 14일까지는 세포증식이 활발하게 진행됐지만, 21일 이후 세포의증식이 둔화되는 양상을 보였다. 반면, 기본배양액군은 꾸준한 세포 증식을 보이며 21일 이후에는 OI배양액군보다 더 높은 증식을 나타냈다. OI배양액군의 alkaline phosphatase(ALP) 활성은 세포배양 21일까지는 증가했지만, 28일에는 감소한 반면에 기본배양액군은 계속 감소하는 양상을 띠었다. OI배양액군의 세포는 배양 21일에는 뚜렷한nodule의 형성을 관찰할 수 있었고, nodule에 칼슘의 축적이 일어남을 확인하였다. ATMSCs를 scaffold에 접종하여 OI배양액으로 배양하였다. Scaffold 내 골아세포 분화에 따른 ALP 활성은 PLGA scaffold와 Bioceramic-PLGA scaffold 모두에서 세포 배양 21일에 급격히 증가하였고, Bioceramic-PLGA scaffold의 ALP 활성이 PLGA scaffold보다 크게 증가하였다. 칼슘과 인의 함량 역시 Bioceramic-PLGA scaffold에서 높게 나타났으며, Bioceramic-PLGA scaffold의 Ca/P ratio가 PLGA scaffold보다 높게 나타났다. 생체내에 이식된 scaffold의 생분해성과 광물화는 bioceramic-PLGA scaffold에서 더욱 뚜렷하게 관찰되었다. 본 실험의 결과들을 종합해 볼 때 ATMSCs의 골형성능은 well plate보다 scaffold가 더 효과적이며, bioceramic이 scaffold의 세포 부착률과 ALP 활성을 증가시켜 골형성능에 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다. 또한 bioceramic이 ATMSCs의 골형성 분화에 따른 광물화단계의 scaffold 내 칼슘과 인의 함량을 증가시키는 것으로 사료된다.생체 내 scaffold의 생분해성은 PLGA scaffold보다 Bioceramic-PLGA scaffold가 빠른 분해를 나타내며, 광물화에 따른 칼슘 침착이 더 활발한 것은 scaffold에 포함된 bioceramic이 생체 내 세포의 부착, 증식, 분화를 증가시켜 골형성을 촉진시키는 물질로 작용한 것으로 사료된다.
본 실험은 bioceramic을 첨가하여 만든 다공성 poly D,L-lactic-co-glycolic acid(PLGA)-scaffold가 인간 지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)의 골 형성과정에 효과적인지를 알아보고자 수행하였다. ATMSCs를 well plate에 접종하여 골형성 유도(osteogenic induction, OI) 배양액으로 28일 동안 배양하였다. OI배양액군의 증식률은 세포접종 후 14일까지는 세포증식이 활발하게 진행됐지만, 21일 이후 세포의증식이 둔화되는 양상을 보였다. 반면, 기본배양액군은 꾸준한 세포 증식을 보이며 21일 이후에는 OI배양액군보다 더 높은 증식을 나타냈다. OI배양액군의 alkaline phosphatase(ALP) 활성은 세포배양 21일까지는 증가했지만, 28일에는 감소한 반면에 기본배양액군은 계속 감소하는 양상을 띠었다. OI배양액군의 세포는 배양 21일에는 뚜렷한nodule의 형성을 관찰할 수 있었고, nodule에 칼슘의 축적이 일어남을 확인하였다. ATMSCs를 scaffold에 접종하여 OI배양액으로 배양하였다. Scaffold 내 골아세포 분화에 따른 ALP 활성은 PLGA scaffold와 Bioceramic-PLGA scaffold 모두에서 세포 배양 21일에 급격히 증가하였고, Bioceramic-PLGA scaffold의 ALP 활성이 PLGA scaffold보다 크게 증가하였다. 칼슘과 인의 함량 역시 Bioceramic-PLGA scaffold에서 높게 나타났으며, Bioceramic-PLGA scaffold의 Ca/P ratio가 PLGA scaffold보다 높게 나타났다. 생체내에 이식된 scaffold의 생분해성과 광물화는 bioceramic-PLGA scaffold에서 더욱 뚜렷하게 관찰되었다. 본 실험의 결과들을 종합해 볼 때 ATMSCs의 골형성능은 well plate보다 scaffold가 더 효과적이며, bioceramic이 scaffold의 세포 부착률과 ALP 활성을 증가시켜 골형성능에 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다. 또한 bioceramic이 ATMSCs의 골형성 분화에 따른 광물화단계의 scaffold 내 칼슘과 인의 함량을 증가시키는 것으로 사료된다.생체 내 scaffold의 생분해성은 PLGA scaffold보다 Bioceramic-PLGA scaffold가 빠른 분해를 나타내며, 광물화에 따른 칼슘 침착이 더 활발한 것은 scaffold에 포함된 bioceramic이 생체 내 세포의 부착, 증식, 분화를 증가시켜 골형성을 촉진시키는 물질로 작용한 것으로 사료된다.
The present experiment was performed to evaluate the osteogenic differentiation of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) seeded in bioceramic-poly D,L-latic-co-glycolic acid (PLGA) scaffold. Osteogenic differentiation of ATMSCs were induced using the osteogenic induction (OI) ...
The present experiment was performed to evaluate the osteogenic differentiation of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) seeded in bioceramic-poly D,L-latic-co-glycolic acid (PLGA) scaffold. Osteogenic differentiation of ATMSCs were induced using the osteogenic induction (OI) medium. ATMSCs were cultured with OI medium during 28 days in well plate. The proliferation of ATMSCs in OI medium group was significantly increased for 14 days of plate culture but slowed after 21 days. On the other hand, proliferation in the control group showed constant increase for 28 days of culturing. The alkaline phosphatase (ALP) activity of ATMSCs in OI medium group increased during the 21 days of culture but decreased on 28 days. However, in control group ALP activity of ATMSCs was continuously decreased as time goes. Nodule was observed at 21 days of culture in OI medium group and confirmed accumulation of calcium in cell by alizarin red staining. ATMSCs were seeded in PLGA scaffold or in Bioceramic-PLGA scaffold, and cultured with OI medium. ALP activity of ATMSCs by osteoblast differentiation in each scaffold increased on 21 days of culture and decreased rapidly on 28 days. ALP activity of ATMSCs was increased highly in Bioceramic-PLGA scaffold compared to PLGA scaffold on 21 days of culturing. SEM-EDS analysis demonstrated that calcium and phosphate content and Ca/P ratio in Bioceramic-PLGA scaffold increased higher than in PLGA scaffold. Biodegradability of scaffold at 56 days after implantation showed that Bioceramic-PLGA scaffold was more biodegradable than PLGA scaffold. The results demonstrated that the differentiation of ATMSCs to osteoblast were more effective in scaffold culture than well plate culture. Bioceramic increased cell adhesion rate on scaffold and ALP activity by osteoblast differentiation. Also, bioceramic was considered to increase the calcium and phosphate in scaffold when ATMSCs was mineralized by osteogenic differentiation. Bioceramic-PLGA scaffold enhanced the osteogenesis of seeded ATMSCs compared to PLGA scaffold.
The present experiment was performed to evaluate the osteogenic differentiation of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) seeded in bioceramic-poly D,L-latic-co-glycolic acid (PLGA) scaffold. Osteogenic differentiation of ATMSCs were induced using the osteogenic induction (OI) medium. ATMSCs were cultured with OI medium during 28 days in well plate. The proliferation of ATMSCs in OI medium group was significantly increased for 14 days of plate culture but slowed after 21 days. On the other hand, proliferation in the control group showed constant increase for 28 days of culturing. The alkaline phosphatase (ALP) activity of ATMSCs in OI medium group increased during the 21 days of culture but decreased on 28 days. However, in control group ALP activity of ATMSCs was continuously decreased as time goes. Nodule was observed at 21 days of culture in OI medium group and confirmed accumulation of calcium in cell by alizarin red staining. ATMSCs were seeded in PLGA scaffold or in Bioceramic-PLGA scaffold, and cultured with OI medium. ALP activity of ATMSCs by osteoblast differentiation in each scaffold increased on 21 days of culture and decreased rapidly on 28 days. ALP activity of ATMSCs was increased highly in Bioceramic-PLGA scaffold compared to PLGA scaffold on 21 days of culturing. SEM-EDS analysis demonstrated that calcium and phosphate content and Ca/P ratio in Bioceramic-PLGA scaffold increased higher than in PLGA scaffold. Biodegradability of scaffold at 56 days after implantation showed that Bioceramic-PLGA scaffold was more biodegradable than PLGA scaffold. The results demonstrated that the differentiation of ATMSCs to osteoblast were more effective in scaffold culture than well plate culture. Bioceramic increased cell adhesion rate on scaffold and ALP activity by osteoblast differentiation. Also, bioceramic was considered to increase the calcium and phosphate in scaffold when ATMSCs was mineralized by osteogenic differentiation. Bioceramic-PLGA scaffold enhanced the osteogenesis of seeded ATMSCs compared to PLGA scaffold.
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문제 정의
이에 본 실험에서는 Bioceramic-PLGA scaffold가 인간 ATMSCs의 골 조직 형성에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 또한, ATMSCs를 dexamethasone, ascorbic acid와 βglycerophosphate가 들어있는 골 형성 유도 배양액으로 배양하여 ATMSCs의 골 형성 분화능을 조사하였다.
제안 방법
ATMSCs가 접종된 scaffold를 OI배양액에서 배양하여 14, 28, 42, 56일에 well plate로부터 꺼내어 4% formaldehyde로 1시간 고정하였다. Scaffold는 수세 후 탈수하여 동결건조기(Micro Modulyo-115, Thermo Savant)로 12시간 동안 동결 건조시켰다.
ATMSCs를 well plate에 접종하고 OI배양액으로 28일 동안 배양하였다. ATMSCs의 골형성 과정은 세포의 형태적 변화와 alizarin red 염색을 하여 광물화를 관찰하였다.
Bioceramic-PLGA scaffold는 acetone 8 ㎖에 PLGA 8 g 과 bioceramic(SiO2-68.13%, Al2O3-18.70%, Na2O3-6.80%, K2O-4.60%, CaO-1.50%, Fe2O3-0.07%, AL-S-30, OK Co. Japan)을 50 ㎎ 첨가하여 넣고 완전히 용해한 후 NaCl(particle size, 212～425 ㎛) 8 g을 넣고 충분히 섞어 두께가 1.6 ㎜가 되도록 cast에 부어 두께가 일정해지도록 하여 바람이 잘 통하는 그늘진 곳에 놓아두었다. 단단히 굳어진 각각의 scaffold가 든 cast를 증류수에 넣고 scaffold와 cast가 분리될 때까지 3시간마다 한번 씩 증류수를 교환하였다.
PLGA scaffold와 Bioceramic-PLGA scaffold에 ATMSCs 를 접종하여 8주 동안 배양하며, 14, 28, 42, 56일에 scaffold 단위 면적당 칼슘과 인의 함량을 측정하였다. PLGA scaffold는 인의 방출선량(emitted beam intensity)은 세포를 접종하기 전에는 18 광자량(photon count)에서 접종 후 각각 34, 44, 52, 72 광자량으로 배양시간이 증가함에 따라 인의 함량 증가가 나타났다.
Scaffold에 접종된 ATMSCs의 분화유도에 따른 ALP 활성은 배양 0, 7, 14, 21, 28일에 각각 측정하였다. PLGA scaffold에서 ALP 활성은 각각 1.
Scaffold에서의 광물화를 관찰하기 위해 체내 이식하였던 scaffold는 4% formaldehyde에서 1시간 동안 고정한 후 paraffin section method로 5～7 ㎛로 절단하여 hematoxylineosin(H/E) 염색과 alizarin red 염색을 실시하였다.
기본배양액 또는 OI배양액으로 배양한 ATMSCs에 의한 광물화를 관찰하기 위해 배양 7, 14, 21, 28일에 alizarin red 염색으로 기질의 광물화를 확인하였다. 배양용기 내 세포의 광물화를 관찰하기 위해 배양용기의 배양액을 제거하고 4% formaldehyde로 10분간 고정한 후 수세하여 5분 동안 염색을 실시하였다.
6 ㎜가 되도록 cast에 부어 두께가 일정해지도록 하여 바람이 잘 통하는 그늘진 곳에 놓아두었다. 단단히 굳어진 각각의 scaffold가 든 cast를 증류수에 넣고 scaffold와 cast가 분리될 때까지 3시간마다 한번 씩 증류수를 교환하였다. 분리된 각각의 scaffold에 수분을 완전히 제거하고 직경 12.
Scaffold는 수세 후 탈수하여 동결건조기(Micro Modulyo-115, Thermo Savant)로 12시간 동안 동결 건조시켰다. 동결 건조된 scaffold는 gold coating한뒤 FE-SEM (LEO1530, German)을 이용하여 10 keV로 scaffold 표면을 관찰하였고, SEM-EDS(KEVEX, USA)을 이용하여 20 keV로scaffold 내의 인과 칼슘의 함량(광자량, photon count)을 측정하였다.
또한, ATMSCs를 dexamethasone, ascorbic acid와 βglycerophosphate가 들어있는 골 형성 유도 배양액으로 배양하여 ATMSCs의 골 형성 분화능을 조사하였다.
, 1998)를 이용하여 파장 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 배양 0, 7, 14, 21, 28일째 되는 날에 ALP 활성을 측정하였다.
기본배양액 또는 OI배양액으로 배양한 ATMSCs에 의한 광물화를 관찰하기 위해 배양 7, 14, 21, 28일에 alizarin red 염색으로 기질의 광물화를 확인하였다. 배양용기 내 세포의 광물화를 관찰하기 위해 배양용기의 배양액을 제거하고 4% formaldehyde로 10분간 고정한 후 수세하여 5분 동안 염색을 실시하였다.
상층액 제거 후 1 ㎖의 DMEM-L를 첨가하여 현탁한 후 T-75 flask에 2×105의 세포수가 되도록 접종하여 계대배양을 실시하였다.
cells/scaffold가 되도록 접종하여 37℃에 30분간 방치하였다. 세포가 scaffold에 충분히 부착된 것을 확인한 후 세포가 접종된 scaffold를 새 24-well plate로 옮기고, 200 ㎕ TrepLE를 이용하여 scaffold에 부착되지 않고 배양용기에 남아있는 세포를 채취하였다. 채취된 세포는 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 새 배양액으로 재 부유시키고 hemocytometer로 세포수를 측정한 다음 처음 접종한 세포수와 비교하여 부착률을 계산하였다.
기본 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS, GIBCO), 100 ㎕/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin 이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium-low glucose(DMEM-L, GIBCO)를 기본 배양액으로 사용하였으며, 2～3일에 한 번씩 배양액을 교환해 주었다. 세포가 배양용기에 80～90%까지 증식하였을 때 배양용기 내 배양액을 제거한 후 2 ㎖의 TrepLE(GIBCO)을 첨가하여 배양기에 3～5분간 방치한 후 배양용기로부터 약 90% 이상 단일세포로 분리된 것을 현미경을 통해 확인한 후 10 ㎖의 DMEM-L를 첨가하여 15 ㎖ conical tube(SPL)에 옮겨 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액 제거 후 1 ㎖의 DMEM-L를 첨가하여 현탁한 후 T-75 flask에 2×105의 세포수가 되도록 접종하여 계대배양을 실시하였다.
각 well plate에서 세포의 증식률은 MTT assay(Mosmann, 1983)를 이용하여 측정하였다. 세포배양 0, 7, 14, 21, 28일째 되는 날에 plate의 상층액을 제거하고 0.5 ㎎/㎖의 3-(4,5-demethylthizol-2- yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma)가 포함된 DMEM-L를 넣어준 후 배양시켰다. 배양 8시간 후 각 plate의 상층액을 제거한 후 DMSO 1 ㎖를 넣고 10분 동안 배양시킨 뒤 microplate reader(Bio-Tek, ELx-800)를 이용하여 550 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
인간 지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)를 wellplate에 접종하여 osteogenic induction(OI)배양액과 기본배양액으로 28일 동안 배양하여 MTT assay로 증식률을 비교하고, osteoblast로의 분화는 alkaline phosphatase(ALP) 활성을 측정하였다.
세포가 scaffold에 충분히 부착된 것을 확인한 후 세포가 접종된 scaffold를 새 24-well plate로 옮기고, 200 ㎕ TrepLE를 이용하여 scaffold에 부착되지 않고 배양용기에 남아있는 세포를 채취하였다. 채취된 세포는 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 새 배양액으로 재 부유시키고 hemocytometer로 세포수를 측정한 다음 처음 접종한 세포수와 비교하여 부착률을 계산하였다.
대상 데이터
기본 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS, GIBCO), 100 ㎕/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin 이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium-low glucose(DMEM-L, GIBCO)를 기본 배양액으로 사용하였으며, 2～3일에 한 번씩 배양액을 교환해 주었다.
인간 지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)는 휴림 바이오쎌(주)에서 제공받아 사용하였다.
데이터처리
실험은 3회 이상 반복하였으며, 대조군과 실험군의 통계적 유의성은 origin pro 7.5(OriginLab, USA)를 이용하여 Student t-test로 검정하였다.
이론/모형
4th-passage ATMSCs를 24well plate에 2,000 cells/well이되도록 접종하여 OI배양액과 기본배양액으로 처리하여 2～3일에 한번씩 배양액을 교체하며 배양하였다. Osteoblast로의 분화를 보기 위하여 각 well plate에서 marker enzyme인 ALP의 활성을 p-nitrophenol method(Shukunami et al., 1998)를 이용하여 파장 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 배양 0, 7, 14, 21, 28일째 되는 날에 ALP 활성을 측정하였다.
PLGA scaffold는 salt leaching method를 이용하여 제작하였다. Acetone 8 ㎖에 poly D,L-lactic-co-glycolic acid(PLGA, Sigma) 8 g을 넣고 완전히 녹인 용액에 NaCl(particle size, 212～425 ㎛) 8 g을 넣고 충분히 섞어 두께가 1.
4th-passage ATMSCs를 24 well plate(SPL)에 2,000 cells/ well이 되도록 접종하여 OI배양액과 기본배양액으로 2～3일에 한번씩 배양액을 교체하며 배양하였다. 각 well plate에서 세포의 증식률은 MTT assay(Mosmann, 1983)를 이용하여 측정하였다. 세포배양 0, 7, 14, 21, 28일째 되는 날에 plate의 상층액을 제거하고 0.
성능/효과
1). ALP 활성은 OI배양액 군이 21일까지 계속적인 증가 후 28일에 control level로 감소를 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이러한 결과는 ATMSCs가 OI배양액군에서 초기 증식이 활발하게 진행되어 증식이 둔화되는 시점에 ALP 활성이 증가하여 최대가 되어 초기 분화가 진행됨을 확인할 수 있었다.
ATMSCs의 증식률은 OI배양액군에서 배양 7일과 배양 14일에서 optical density(O.D)가 각각 0.31±0.02, 0.81±0.03로 기본배양액군 0.27±0.01, 0.56±0.06에 비해 다소 높게 나타났다(p<0.01).
11). Bioceramic-PLGA scaffold 자체에 초기 인과 칼슘의 함량 정도가 더 높게 나타났으며, Bioceramic-PLGA scaffold의 칼슘의 함량은 56일에는 PLGA scaffold와 비교했을 때 거의 2배 이상 높았다.
10). Bioceramic-PLGA scaffold의 크기는 31%가 감소하고, PLGA scaffold의 크기는 25%가 감소하여, BioceramicPLGA scaffold의 크기가 더 작게 나타났다(Fig. 9). 또한 alizarin red 염색으로 확인한 광물화도 Bioceramic-PLGA scaffold에서 더 뚜렷하게 나타났다(Fig.
11). BioceramicPLGA scaffold는 인의 방출선량이 세포를 접종하기 전 38광자량에서 접종 후 각각 48, 50, 64, 98 광자량으로 배양시간이 증가함에 따라 인의 함량 정도가 증가함을 알 수 있었 는데, 14일에서 28일 사이의 증가폭보다 28일 이후의 증가폭이 현저히 크게 나타남을 알 수 있었다. 또한 칼슘의 방출 선량은 세포를 접종하기 전 13 광자량에서 접종 후 각각 18, 32, 40, 82 광자량으로 배양시간에 따라 지속적인 증가가 일어났다(Fig.
또한 56일 배양 후 칼슘의 함량은 Bioceramic-PLGA scaffold가 PLGA scaffold보다 2배 높게 나타났는데, 이는 bioceramic이 PLGA scaffold에 첨가되어 CaP가 함유된 ceramics처럼 작용을 하여 ATMSCs의 골형성 분화능을 촉진시켜 광물화에 따른 칼슘과 인의 함량이 증가된 것으로 사료된다. EDS 분석결과의 Ca/P ratio는 배양시간에 따라 PLGA scaffold에서 0.44, 0.40, 0.45, 0.54, 0.58배로 증가하고, Bioceramic-PLGA scaffold에서는 0.34, 0.38, 0.64, 0.63, 0.84배로 배양시간이 길어짐에 따라 scaffold 내의 골 형성이 증가되었다. 동물 뼈의 Ca/P ratio는 대략 1.
PLGA scaffold와 Bioceramic-PLGA scaffold에 ATMSCs 를 접종하여 8주 동안 배양하며, 14, 28, 42, 56일에 scaffold 단위 면적당 칼슘과 인의 함량을 측정하였다. PLGA scaffold는 인의 방출선량(emitted beam intensity)은 세포를 접종하기 전에는 18 광자량(photon count)에서 접종 후 각각 34, 44, 52, 72 광자량으로 배양시간이 증가함에 따라 인의 함량 증가가 나타났다. 또한 칼슘의 방출선량도 세포를 접종하기 전에는 8 광자량에서 접종 후 각각 12, 20, 28, 42 광자량으로 배양시간이 지나며 칼슘의 함량도 증가하였다(Fig.
PLGA scaffold에서 ALP 활성은 각각 1.67±0.02, 1.73±0.01, 1.76±0.01, 2.18±0.09, 1.70±0.01로 나타났고, Bioceramic-PLGA scaffold는 각각 1.68±0.02, 1.75±0.01, 1.82±0.01, 2.50±0.11, 1.77±0.01로 PLGA scaffold와 비슷하게 나타났다.
Scaffold에 ATMSCs를 접종하여 OI배양액에서 14일간 분화를 유도한 뒤에, 이 scaffold를 생쥐의 등쪽 피하에 이식하여 56일 경과된 scaffold와 세포를 접종하여 배양하기 전의 scaffold의 직경을 비교해 보았을 때, PLGA scaffold는 12 ㎜에서 9 ㎜로 세포를 접종하여 배양하기 전보다 크기가 25% 감소하였다. Bioceramic-PLGA scaffold는 12 ㎜에서 8.
각각의 scaffold에서 ATMSCs의 부착률은 PLGA scaffold 에서 73.52±1.80%로 나타났으며, Bioceramic-PLGA scaffold에서는 82.31±1.52%로 나타났다(Fig. 7)
그러나 배양 21일과 28일에서 증식률은 OI 배양액군(1.05±0.05, 1.13±0.05)보다 기본배양액군(1.16±0.01, 1.46±0.07)에서 증식이 더 활발한 것으로 나타났다(p<0.01).
배양 시작시에 Bioceramic-PLGA scaffold의 칼슘과 인의 함량이 PLGA scaffold의 약 2배로 나타났고, 배양시간이 증가함에 따라 칼슘과 인의 함량도 지속적으로 증가함을 확인하였다. 또한 56일 배양 후 칼슘의 함량은 Bioceramic-PLGA scaffold가 PLGA scaffold보다 2배 높게 나타났는데, 이는 bioceramic이 PLGA scaffold에 첨가되어 CaP가 함유된 ceramics처럼 작용을 하여 ATMSCs의 골형성 분화능을 촉진시켜 광물화에 따른 칼슘과 인의 함량이 증가된 것으로 사료된다. EDS 분석결과의 Ca/P ratio는 배양시간에 따라 PLGA scaffold에서 0.
9). 또한 ATMSCs가 접종된 scaffold의 생체내 mineralization은 hematoxylin-eosin 염색과 alizarin red 염색을 통해 확인했는데, Bioceramic-PLGA scaffold의 세포들이 더 큰 군집을 이룬 것을 볼 수 있었다. 또한 Bioceramic-PLGA scaffold에서 PLGA scaffold보다 더 뚜렷한 alizarin red 염색을 나타냈다(Fig.
또한 ATMSCs가 접종된 scaffold의 생체내 mineralization은 hematoxylin-eosin 염색과 alizarin red 염색을 통해 확인했는데, Bioceramic-PLGA scaffold의 세포들이 더 큰 군집을 이룬 것을 볼 수 있었다. 또한 Bioceramic-PLGA scaffold에서 PLGA scaffold보다 더 뚜렷한 alizarin red 염색을 나타냈다(Fig. 10).
01). 또한 OI배양액군의 증식률은 세포배양 후 14일까지는 세포증식이 활발하게 진행됐지만, 21일 이후에는 세포의 증식이 둔화되는 양상을 보였다. 반면, 기본배양액군은 꾸준한 세포증식을 보이며 21일 이후에는 OI배양액군보다 더 높은 증식을 나타냈다(Fig.
9). 또한 alizarin red 염색으로 확인한 광물화도 Bioceramic-PLGA scaffold에서 더 뚜렷하게 나타났다(Fig. 10). 이러한 결과는 scaffold에 함유된 bioceramic으로 인해서 세포 분화가 촉진되고 골 형성 과정이 촉진되어 칼슘의 침착이 증가된 것으로 사료된다.
본 실험에서 ATMSCs를 plate에 배양하며 세포의 증식과 ALP 활성 측정 결과를 보면 osteogenic induction(OI)배양액군의 초기 증식률이 기본배양액군보다 높게 나타났고, 배양 21일에는 OI배양액군보다 기본배양액군의 증식률이 높게 나타났다. 또한 배양 21일 후 OI배양액군의 증식률은 다소 둔화되는 양상을 보여주었다(Fig. 1). ALP 활성은 OI배양액 군이 21일까지 계속적인 증가 후 28일에 control level로 감소를 확인할 수 있었다(Fig.
BioceramicPLGA scaffold는 인의 방출선량이 세포를 접종하기 전 38광자량에서 접종 후 각각 48, 50, 64, 98 광자량으로 배양시간이 증가함에 따라 인의 함량 정도가 증가함을 알 수 있었 는데, 14일에서 28일 사이의 증가폭보다 28일 이후의 증가폭이 현저히 크게 나타남을 알 수 있었다. 또한 칼슘의 방출 선량은 세포를 접종하기 전 13 광자량에서 접종 후 각각 18, 32, 40, 82 광자량으로 배양시간에 따라 지속적인 증가가 일어났다(Fig. 11). Bioceramic-PLGA scaffold 자체에 초기 인과 칼슘의 함량 정도가 더 높게 나타났으며, Bioceramic-PLGA scaffold의 칼슘의 함량은 56일에는 PLGA scaffold와 비교했을 때 거의 2배 이상 높았다.
4). 반면, OI배양액군은 14일 이후 염색에 의한 변화가 뚜렷하게 나타났으며, 시간이 지날수록 더욱 뚜렷한 색 변화를 볼 수 있었다(Fig. 4). OI배양액군의 염색부분은 세포가 모여 둥글게 형성된 nodule 부분에서 더 활발히 일어난 것을 볼 수 있었다(Fig.
OI배양액군은 14일에 세포가 모여 군집을 이루며 둥글게 nodule를 형성하기 시작했다. 반면, 기본배양액군에서는 뚜렷한 형태의 군집을 이루지 않고 일반적인 세포증식에 따른 세포의 형태를 띠고 있음을 관찰하였다(Fig. 3).
이러한 결과는 ATMSCs가 OI배양액군에서 초기 증식이 활발하게 진행되어 증식이 둔화되는 시점에 ALP 활성이 증가하여 최대가 되어 초기 분화가 진행됨을 확인할 수 있었다. 반면, 기본배양액군은 골 형성 유도 물질이 존재하지 않아 ALP 활성이 증가 하지 않음을 확인할 수 있었다.
11). 배양 시작시에 Bioceramic-PLGA scaffold의 칼슘과 인의 함량이 PLGA scaffold의 약 2배로 나타났고, 배양시간이 증가함에 따라 칼슘과 인의 함량도 지속적으로 증가함을 확인하였다. 또한 56일 배양 후 칼슘의 함량은 Bioceramic-PLGA scaffold가 PLGA scaffold보다 2배 높게 나타났는데, 이는 bioceramic이 PLGA scaffold에 첨가되어 CaP가 함유된 ceramics처럼 작용을 하여 ATMSCs의 골형성 분화능을 촉진시켜 광물화에 따른 칼슘과 인의 함량이 증가된 것으로 사료된다.
배양에 따른 세포의 ALP 활성은 OI배양액군은 배양 7, 14, 21, 28일에서 각각 1.72±0.02, 1.85±0.01, 1.95±0.01, 1,72±0.01로 세포배양 21일까지는 ALP 활성이 증가했지만 28일(1.72±0.01)에는 감소하였다.
본 실험에서 ATMSCs를 plate에 배양하며 세포의 증식과 ALP 활성 측정 결과를 보면 osteogenic induction(OI)배양액군의 초기 증식률이 기본배양액군보다 높게 나타났고, 배양 21일에는 OI배양액군보다 기본배양액군의 증식률이 높게 나타났다. 또한 배양 21일 후 OI배양액군의 증식률은 다소 둔화되는 양상을 보여주었다(Fig.
, 2007). 본 실험에서도 ATMSCs를 접종한 scaffold를 OI배양액으로 배양한 후 ALP 활성을 측정하여 비교한 결과, ALP 활성 최대점이 배양 21일에 PLGA scaffold는 2.18, Bioceramic-PLGA scaffold는 2.50로 나타났다(Fig. 8). 이러한 결과로 볼 때 bioceramic이 PLGA scaffold에 첨가되면 PLGA scaffold 자체보다 osteoblast로의 분화에 효과적으로 작용한다고 사료된다.
, 2007). 본 실험에서도 plate에 ATMSCs를 접종하여 배양하여 nodular aggregates가 형성됨을 배양 21일에 확인하였고, 침착된 물질은 alizarin red 염색을 통해 칼슘임을 확인하였다(Fig. 3, 4).
본 실험에서도 배양 기간이 길어질수록 PLGA scaffold와 Bioceramic-PLGA scaffold내 칼슘과 인의 함량이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 11). 배양 시작시에 Bioceramic-PLGA scaffold의 칼슘과 인의 함량이 PLGA scaffold의 약 2배로 나타났고, 배양시간이 증가함에 따라 칼슘과 인의 함량도 지속적으로 증가함을 확인하였다.
본 실험에서도 세포를 접종한 Bioceramic-PLGA scaffold 와 PLGA scaffold를 분화 유도하여 생체 내 이식하여 56일 동안 배양한 scaffold와 세포가 접종되지 않은 초기 scaffold의 크기를 비교해 보았을 때, 생체 내 이식한 두 scaffold 모두 크기가 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 9). 또한 생체 내배양에 따른 광물화도 alizarin red 염색으로 확인할 수 있었다(Fig.
본 실험의 결과들을 종합해 볼 때 ATMSCs의 골형성능은 plate보다 scaffold가 더 효과적이며, bioceramic이 scaffold의 세포 부착률을 증가시키고 골 형성 분화에 효과적으로 작용하여 ALP 활성을 높이는 것으로 생각되며, scaffold 제작시 생성되는 pore size를 감소시켜 scaffold에 세포가 부착, 증식하여 분화하기 더 좋은 환경을 제공한다고 사료된다. 또한 bioceramic이 ATMSCs의 골 형성 분화에 따른 광물화단계의 scaffold내 칼슘과 인의 함량을 증가시키는 것으로 사료된다.
Nano-sized hydroxyapatite(HA) particles를 이용해 만든 PLGA/HA scaffolds는 micro-sized HA particles보다 표면적이 큰 scaffold를 만들 수 있으며, 골 손상 부위에 이식되어 생리활성과 골의 재생을 개선할 수 있고, 또한 단백질 흡착과 세포 부착을 촉진한다고 보고되고 있다(Kim et al, 2006). 본 실험의 결과에서도 Bioceramic-PLGA scaffold 표면은 PLGA scaffold의 pore와 달리 pore 표면을 bioceramic이 뒤덮어 pore 사이를 채워주고 있는 것을 확인하였다(Fig. 5). 이로 인해서 세포부착 표면적을 넓혀 scaffold에 세포 접종 시 부착률을 증가시키는 것도 확인할 수 있었다(Fig.
2). 이러한 결과는 ATMSCs가 OI배양액군에서 초기 증식이 활발하게 진행되어 증식이 둔화되는 시점에 ALP 활성이 증가하여 최대가 되어 초기 분화가 진행됨을 확인할 수 있었다. 반면, 기본배양액군은 골 형성 유도 물질이 존재하지 않아 ALP 활성이 증가 하지 않음을 확인할 수 있었다.
8). 이러한 결과로 볼 때 bioceramic이 PLGA scaffold에 첨가되면 PLGA scaffold 자체보다 osteoblast로의 분화에 효과적으로 작용한다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
성체 중간엽 줄기세포란 무엇인가?
배아줄기세포는 전능성으로 조직공학적으로 이상적인 세포이지만 실제적인 사용은 윤리적 관점과 정부의 규제로 제한된다(Dresser, 2001). 성체 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 높은 clonogenic cell로 자가 재생능력을 가지며, 골, 연골, 지방, 근육세포 등으로 분화할 수 있다고 알려져 최근 연구에 많이 이용되고 있다(Barry et al., 2001).
배아줄기세포의 사용이 왜 제한되는가?
배아줄기세포는 전능성으로 조직공학적으로 이상적인 세포이지만 실제적인 사용은 윤리적 관점과 정부의 규제로 제한된다(Dresser, 2001). 성체 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 높은 clonogenic cell로 자가 재생능력을 가지며, 골, 연골, 지방, 근육세포 등으로 분화할 수 있다고 알려져 최근 연구에 많이 이용되고 있다(Barry et al.
성체 중간엽 줄기세포의 원천으로 지방세포가 각광받고 있는 이유는?
또한, 지방조직은 채취하기 쉽고 풍부해서 최근에 더욱 각광받고 있다(Nathan et al., 2003).
참고문헌 (31)
Aubin JE, Liu F, Malval L, Gupta AK (1995) Osteoblast and chondroblast differentiation. Bone 17(suppl):s77-s83.
Ayers R, Sheila NP, Virginia F, Guglielmo G, Moore JJ, Kleebe HJ (2006) Osteoblast-like cell mineralization induced by multiphasic calcium phosphate ceramic. Materials Sci and Eng C 26:1333-1337.
Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM (2001) Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res 268:189-200.
Boyan BD, Bonewlsd LF, Paschlis EP, Lohmann CH, Rosser J, Cochra DL, Dean DD, Schwartz Z, Boskey AL (2002) Osteoblast-mediated mineral deposition in culture is dependent on surface microtopology. Calcif Tissue Int 71:519-529.
Chang BS, Lee CK, Hong KS, Youn HJ, Ryu HS, Chung SS (2000) Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations. Biomaterials 21:1291-1298.
Das P, Ozan A, Aza AM (2005) Optimization of the mineral content in polymeric gels: The effect of calcium to phosphate molar ratio. J Crystal Growth 280:587-593.
Donzelli E, Salvade A, Mimo P, Vigano M, Morrone M, Papagna R, Carini F, Zaopo A, Miloso M, Baldoni M, Tredici G (2007) Mesenchymal stem cells cultured on a collagen scaffold: In vitro osteogenic differentiation. Arch Oral Biol 52:64-73.
Dresser R (2001) Ethical issues in embryonic stem cell research. JAMA 285:1439-1440.
Halvorsen YD, Franklin D, Bond AL, Hitt DC, Auchter C, Boskey AL (2001) Extracellular matrix mineralization and osteoblast gene expression by human adipose tissuederived stromal cells. Tissue Eng 7:729-741.
Hee CK, Joinkas MA, Nicoll SB (2006) Influence of threedimensional scaffold on the expression of osteogenic differentiation markers by human dermal fibroblasts. Biomaterials 27:875-884.
Huang W, Carlsen B, Wulur I, Rudkin G, Ishida K, Wu B (2004) BMP-2 exerts differential effects on differentiation of rabbit bone marrow stromal cells grown in two-dimensional and three-dimensional systems and required for in vitro bone formation in a PLGA scaffold. Exp Cell Res 229:325-334.
Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder SP (1997) Osteogenic differentiation of purified culture-expanded human mesenchymal stem cell in vitro. J Cell Biochem 64:295-312.
Kanczler JM, Ginty PJ, Barry JJA, Clarke NMP, Howdle SM, Shakesheff KM, Oreffo ROC (2008) The effect of mesenchymal populations and vascular endothelial growth factor delivered from biodegradable polymer scaffolds on bone formation. Biomaterials 29:1892-1900.
Kim SS, Park MS, Jeon O, Choi CY, Kim BS (2006) Poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 27:1399-1409.
Mastrogiacomo M, Papadimitropoulos A, Cedola A, Peyrin F, Giannoni P, Pearce SG, Alini M, Giannini P, Guagliardi A, Cancedda R (2007) Engineering of bone using bone marrow stromal cells and a silicon-stabilized tricalcium phosphate bioceramic: Evidence for a coupling between bone formation and scaffold resorption. Biomaterals 28:1379-1384.
Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65:55-63.
Nathan S, De Das S, Thambyah A, Fen C, Goh J, Lee EH (2003) Cell-based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue. Tissue Eng 9: 733-744.
Peter SJ, Miller MJ, Yasko AW, Yaszemski MJ, Mikos AG (1998) Polymer concepts in tissue engineering. J Biomed Mater Res 43:422-427.
Radin SR, Ducheyne P (1994) Effect of bioactive ceramic composition and structure on in vitro behavior: III Porous versus dense ceramics. J Biomed Mater Res 28: 1303-1309.
Redey SA, Razzouk S, Rey C, Bernache-Assollant D, Leroy G, Nardin M (1994) Osteoclast adhesion and activity on synthetic hydroxyapatite, carbonated hydroxyapatite, and natural calcium carbonate: relationship to surface energies. J Biomed Mater Res 45:140-147.
Shukunami C, Ohta Y, Sakuda M, Hiraki Y (1998) Sequential progression of the differentiation program by bone morphogenetic protein-2 in chondrogenic cell line ATDC5. Exp Cell Res 241:1-11.
Sugawara Y, Suzuki K, Koshikawa M, Ando M, Iida J (2002) Necessity of enzymatic activity of alkaline phosphatase for mineralization of osteoblastic cells. Jpn J Pharmacol 88:262-269.
Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y (2005) Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in biodegradable sponges composed of gelatin and $\beta$ -tricalcium phosphate. Biomaterials 26:3587-3596.
Wang YW, Wu Q, Chen JC, Chen GQ (2005) Evaluation of three-dimensional scaffolds made of blends of hydro xyapatite and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexnoate) for bone reconstruction. Biomaterials 26:899-904.
Wang H, Li Y, Zuo Y, Li J, Ma S, Cheng L (2007) Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nanohydroxyapatite/ polyamid composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 28:3338-3348.
Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, Siegel RW, Bizios R (2000) Specific proteins mediate enhanced osteoblast adhesion on nanophase ceramics. J Biomed Mater Res 51:475-483.
Winter A, Breit S, Parsch D, Benz K, Steck E, Hauner H (2003) Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids. Arthritis Rheum 48:418-429.
Yang S, Leong KF, Du Z, Chua CK (2001) The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue Eng 7:679-689.
Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H (2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 13:4279-4295.
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