[논문]KGN(난소과립세포)에서 BCL2L10 단백질의 세포사멸 유도 기능 연구

김재홍; 이경아; 배지현

KGN(난소과립세포)에서 BCL2L10 단백질의 세포사멸 유도 기능 연구
BCL2L10 Protein Induces Apoptosis in KGN-Human Granulosa Cells 원문보기

Development & reproduction = 발생과 생식, v.15 no.2, 2011년, pp.113 - 120

김재홍 (차의과학대학교 약학대학 약학과) , 이경아 (차의과학대학교 의생명과학대학 의생명과학과) , 배지현 (차의과학대학교 약학대학 약학과)

초록
AI-Helper

BCL-2 family 단백질들은 세포사멸 신호전달 체계에서 중추적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, BCL2L10 단백질은 그 중 하나로 세포의 사멸과 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특이하게도 BCL2L10 단백질은 세포 또는 조직 특이적으로 서로 상반되는 친 세포사멸 또는 항 세포사멸 효과가 각각 보고되어 있다. 현재까지 난소세포에서의 BCL2L10의 발현 여부 및 기능은 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서 인간 난소 과립세포주인 KGN 세포에서의 BCL2L10 단백질의 발현 여부를 확인한 결과, 상당한 양의 단백질이 발현함을 확인할 수 있었으며, 또한 세포사멸효과를 확인하기 위해서 BCL2L10 단백질을 dose-dependent하게 과발현시킨 후 세포의 생존에 미치는 영향을 분석한 결과,BCL2L10은 KGN 세포에서 과발현 시 세포사멸을 유도함을 관찰하였다. BCL2L10 단백질을 과발현 시 Caspase 9와 3를 활성화 하였으며, 면역염색법을 통해서 BCL2L10 단백질이 미토콘드리아에 위치하는 것을 확인하였다. 또한 BCL2L10단백질의 과발현에 의해 미토콘드리아에서 cytochrome c가 세포질로 분비되는 것을 확인하였다. 이상의 결과로서 본 연구는 BCL2L10의 과발현이 KGN 세포에서 세포사멸을 유도하고, 또한 미토콘드리아에 위치하여 세포질로 cytochrome c를 분비하여 Caspase 9와 3을 활성화 시키는 메커니즘으로 세포사멸을 유도함을 확인하였다. 이러한 연구결과는 BCL2L10단백질이 인간 난소과립세포의 생존과 사멸을 조절하는 인자임을 최초로 규명한 것으로서, 추후 난소에서의 BCL2L10단백질의 생리적인 기능 및 신호 조절 연구의 기반 데이터로서 그 의의가 있으며 활용될 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

BCL-2 family essential proteins to play a pivotal role to perform in apoptosis signaling pathways and essential proteins for the regulation of cell death. BCL2L10 protein is a member of BCL-2 family and it regulates both anti-apoptotic and pro-apoptotic function of specific tissue or cell line. BCL2L10 of function and expression is not reported in ovary cell lines. In this study we reported that BCL2L10 were significant expression of KGN cell line. Ectopic expression of BCL2L10 induced cell death, and its cells killing effect was blocked by pan-caspase inhibitor of the Z-VAD-fmk. Ectopic expression of BCL2L10 protein led to the activation of caspase 9 and caspase 3, suggesting apoptotic cell death, and confocal microscopic analyses showed that BCL2L10 was partially localized in mitochondria. Thus, we provide a novel function of BCL2L10 in KGN cells, which was involved in the intrinsic cell death pathway.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 2009). BCL2L10 단백질의 난소발달단계에서의 기능연구를 위해서 본 연구자는 human granulosa tumor cell-KGN(Nishi et al., 2001)에서의 BCL2L10 단백질의 세포사멸 기능연구를 진행하였다. 이번 연구를 통해서 우리는 BCL-2 패밀리 단백질 중의 하나인 BCL2L10 단백질 세포사멸유도 메커니즘이 human granulosa tumor cell 미토콘드리아가 관여하는 intrinsic pathway라는 것을 확인하였다.
또한 많이 발현한다고 알려진 인간 난소에서의 연구에 어려움이 있어서 BCL2L10의 역할 또는 발현 연구가 인간 난소 세포에서는 활발하게 진행되어지지 않았다. 따라서 본 연구는 BCL2L10 단백질의 인간 난소 세포에서의 세포사멸 양상 패턴 및 메커니즘 확인을 위한 중요한 연구이다.
본 연구자는 이번 연구를 통해 KGN 세포에서 BCL2L10 단백질이 상대적으로 많이 발현하고 있었으며, 따라서 난소 발달단계에서 중요한 역할을 하는 granulosa cell에서의 BCL2L10의 세포사멸 연구를 수행하였으며, 본 연구자는 최초로 BCL2L10 단백질의 난소발달 과정에서의 역할을 규명하기 위한 human granulosa tumor cell line인 KGN 세포에서 BCL2L10이 미토콘드리아를 기반으로 하는 세포사멸 메커니즘 연구의 기초적 자료를 제시하였다.

제안 방법

Blocking 후 3% Skim milk PBS-Tween 20에 anti-Caspase9(Cell signaling, Danvers, MA, USA, #9502), anti-Caspase3(Cell signaling, #9662)를 1:1000 비율로 처리 후 4℃에서 12시간 반응 후 PBS-Tween 20으로 3회 세척하였다. 2차 항체인 anti-goatrabbit IgG-horseradish peroxidase(Santa Cruz Biotechnology)로 6시간 반응 후 PBS-Tween 20으로 3회 세척한 후 Luminescence image analyzer(Fujifilm Life Science, Stamford, CT, U.S.A.)에서 단백질 발현을 관찰하였다. 동량의 단백질 정량을 위해서 anti-GAPDH(Ab Frontier, Korea)를 사용하여 확인하였다.
이후 2% FBS가 함유된 PBS에 1시간 반응하여 비 특이적 반응을 억제하였다. Anti-BCL2L10 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A, #8740) 와 MitoTracker(Invitrogen, Calsbad, CA, U.S.A.)을 1:100 으로 PBS-Tween 20 용액에 희석하여 실온에서 1시간 반응하였다. PBS-Tween 20으로 3회 세척한 후 2차 항체인 antigoat 488 IgG (Invitrogen)을 1:1000으로 희석하여 실온에서 30분간 반응 후 PBS-Tween 20으로 3차례 세척 후 mounting gel로 슬라이드 글라스에 고정하여 Zeiss LSM 510 META conforcal fluorescence microscopy(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)를 이용하여 세포를 관찰하였다.
Apoptotic 세포를 분석하기 위해서 BCL2L10 단백질을 1×106 세포에 2, 4 ㎍ DNA를 MicroPorator MP-100(Invitrogen)를 이용하여 transfection한 뒤 세포를 T/E로 수거하여 AposcanTM(BioBud, Korea)를 이용하여 kit의 protocol대로 실험을 실시하였다.
1B). BCL2L10 단백질의 발현량에 따라 KGN 세포가 사멸되는 효과를 확인하였다. BCL2L10의 발현에 의한 세포사멸이 Caspase 의존적인 세포사멸인지 확인하기 위해서 Caspase inhibitor인 Z-VAD-fmk를 BCL2L10이 발현하는 세포에 각각의 농도인 0, 10, 30, 100 μM의 농도로 처리하여 세포생존율을 측정하였다(Fig.
BCL2L10의 발현에 의한 세포사멸이 Caspase 의존적인 세포사멸인지 확인하기 위해서 Caspase inhibitor인 Z-VAD-fmk를 BCL2L10이 발현하는 세포에 각각의 농도인 0, 10, 30, 100 μM의 농도로 처리하여 세포생존율을 측정하였다(Fig. 1C).
BCL2L10이 세포내에서 어느 위치에 존재하는지 알아보기 위해서 면역형광염색을 실시하였다. 24-well 배양접시에 각 well마다 cover slip을 깔고 세포의 부착을 위해 0.
KGN cDNA를 주형으로 하여 1 X PCR 반응액(2.5 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 2.5 U의 재조합 Taq 중합효소) 100㎕를 각각 1 μM의 pc Flag BCL2L10 정방향 프라이머(5'- CTAGGATCCATGGACTACAAAGACGACGACGACA AAGTTGACCAGTTGCGGGG-3') 및 BCL2L10 역방향 프라이머(5'-CTAGAATTCTCATAATAATCGT-GTCCA)를 이용하여 1 X PCR 반응액에서 95℃에서 3분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초간 30회 반응시킨 다음, 72℃에서 10분간 연장하는 조건으로 PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻었다.
KGN 세포를 2.0×104 세포량으로 24-well 배양접시에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, pc Flag-BCL2L10을 단독으로, 총 DNA가 100, 300 및 500 ng이 되도록 MicroPorator MP-100(Invitrogen, USA)를 이용하여 transfection한 뒤, DMEM/F12 medium에 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
KGN 세포를 60 ㎜ 배양접시를 사용하여 well 당 1×106세포에 4 ㎍의 pc Flag BCL2L10 플라스미드 DNA를 Micro Porator MP-100(Invitrogen)를 이용하여 transfection한 뒤, DMEM/F12 medium에 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
KGN 세포에서 BCL2L10 단백질의 세포사멸조절 기능을 확인하기 위해서 BCL2L10 플라스미드를 0, 100, 300, 500 ng 농도로 dose-dependent하게 electroporator로 transfection 하여 세포생존율을 측정하였다(Fig. 1B). BCL2L10 단백질의 발현량에 따라 KGN 세포가 사멸되는 효과를 확인하였다.
KGN 세포에서의 cytochrome c의 release를 분석하기 위해서 1×106 세포에 4 ㎍의 pc Flag BCL2L10 플라스미드 DNA를 MicroPorator MP-100(Invitrogen, USA)를 이용하여 transfection한 뒤 digitonin을 사용한 fractions 방법을 사용하여(Arnoult, 2008) cytosol과 membrane fraction을 분리하여 각각 cytochrome crelease을 확인하였다.
)을 1:100 으로 PBS-Tween 20 용액에 희석하여 실온에서 1시간 반응하였다. PBS-Tween 20으로 3회 세척한 후 2차 항체인 antigoat 488 IgG (Invitrogen)을 1:1000으로 희석하여 실온에서 30분간 반응 후 PBS-Tween 20으로 3차례 세척 후 mounting gel로 슬라이드 글라스에 고정하여 Zeiss LSM 510 META conforcal fluorescence microscopy(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)를 이용하여 세포를 관찰하였다.
이때, pcFlag-BCL2L10 정방향 프라이머와 pcBCL2L10 역방향 프라이머를 사용하였으며, PCR 조건은 상기 프라이머쌍과 주형을 95℃에서 3분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 30회 반응시킨 다음, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. pcDNA3(Invitrogen, Calsbad, CA, U.S.A.)의 다중 클로닝 부위를 제한효소 BamHI EcoRI으로 처리한 다음, 앞서 얻어진 PCR 산물을 클로닝하여 재조합 플라스미드 pc Flag-BCL2L10를 얻었다. 이후 Sanger 방법을 통해 서열분석을 수행한 결과, 재조합 플라스미드 pcBCL2L10 염기서열을 갖는 DNA를 포함하고 있음을 확인하였다.
)에서 단백질 발현을 관찰하였다. 동량의 단백질 정량을 위해서 anti-GAPDH(Ab Frontier, Korea)를 사용하여 확인하였다.
또한 Caspase에 의존적인 세포사멸인지 확인하기 위해서 Z-VAD-fmk(caspase inhibitor)를 10 μM 처리하여 세포생존율을 같은 방법으로 측정하였다.
0×10⁴ 숫자로 분주하여 37℃ 5% CO₂의 환경 하에서 배양하였다. 배양 후 Lipofectamine2000 형질감염키트(Invitrogen)를 이용하여300 ng의pc Flag BCL2L10 DNA를 형질감염 시켰다. 37℃ 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양 후 4% paraformaldehyde를 넣고 실온에서 15분간 고정 후 PBS로 3회 세척 후 0.
세포생존율(cell viability)의 변화는 각 실험 시 triplicate로 3회 반복 실시하여 평균값 및 표준 오차를 계산하였다. 각 실험에서 통계학적 분석은 Student’s t-test를 통해 분석하였으며, p-value 0.
1C). 실직적인 세포사멸 마커인 Annexin V 염색방법을 사용하여 BCL2L10이 세포사멸을 유도하는지 다시 flow Cytometry 실험으로 확인하였다(Fig 2A). 또한 세포사멸 양상이 caspase의 활성에 인한 메커니즘인지 확인하기 위해서 웨스턴 방법을 사용하여 caspase 9, 3의 활성을 측정하였다(Fig 2B).
0×10⁴ 세포량으로 24-well 배양접시에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, pc Flag-BCL2L10을 단독으로, 총 DNA가 100, 300 및 500 ng이 되도록 MicroPorator MP-100(Invitrogen, USA)를 이용하여 transfection한 뒤, DMEM/F12 medium에 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 50 ng의 녹색형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 플라스미드(Clontech, Mountain View, CA, U.S.A.)를 함께 형질감염시켜 24시간 후 GFP를 발현하는 세포만 카운팅하여 세포의 사멸 정도를 측정하였다. 또한 Caspase에 의존적인 세포사멸인지 확인하기 위해서 Z-VAD-fmk(caspase inhibitor)를 10 μM 처리하여 세포생존율을 같은 방법으로 측정하였다.
이렇게 얻어진 PCR 산물들을 주형으로 하여 재조합 PCR을 수행하여 최종적으로 PCR 산물을 얻었다. 이때, pcFlag-BCL2L10 정방향 프라이머와 pcBCL2L10 역방향 프라이머를 사용하였으며, PCR 조건은 상기 프라이머쌍과 주형을 95℃에서 3분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 30회 반응시킨 다음, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. pcDNA3(Invitrogen, Calsbad, CA, U.
따라서 미토콘드리아는 세포사멸에서의 중요한 기관으로 작용한다. 이러한 미토콘드리아와 BCL2L10의 세포에서 위치를 확인하기 위해서 세포면역염색실험을 진행하였다. BCL2L10를 293T 세포에서 과발현하였고, confocal fluorescent microscopy를 사용하여 BCL2L10의 위치를 확인하였으며 BCL2L10은 부분적으로 미토콘드리아에 존재하고 있는 것으로 확인되었다(Fig.
5 U의 재조합 Taq 중합효소) 100㎕를 각각 1 μM의 pc Flag BCL2L10 정방향 프라이머(5'- CTAGGATCCATGGACTACAAAGACGACGACGACA AAGTTGACCAGTTGCGGGG-3') 및 BCL2L10 역방향 프라이머(5'-CTAGAATTCTCATAATAATCGT-GTCCA)를 이용하여 1 X PCR 반응액에서 95℃에서 3분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초간 30회 반응시킨 다음, 72℃에서 10분간 연장하는 조건으로 PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻었다. 이렇게 얻어진 PCR 산물들을 주형으로 하여 재조합 PCR을 수행하여 최종적으로 PCR 산물을 얻었다. 이때, pcFlag-BCL2L10 정방향 프라이머와 pcBCL2L10 역방향 프라이머를 사용하였으며, PCR 조건은 상기 프라이머쌍과 주형을 95℃에서 3분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 30회 반응시킨 다음, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다.
이번 연구를 통해서 human granulosa tumor cell line인 KGN 세포와 다른 조직세포에서의 BCL2L10 단백질 발현 양상(Fig. 1A)을 관찰하였으며, BCL2L10 단백질의 과발현이 세포 수 감소를 유도하는 것을 관찰하였다(Fig. 1B). 이러한 세포 수 감소의 원인이 세포사멸(apoptosis) 시그널 pathway 또는 세포괴사(necrosis)인지 확인하기 위해서 세포사멸의 실행자인 caspase inhibitor Z-VAD-fmk를 처리하여 세포생존율 측정을 하였고, 세포생존율이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
)을 이용하여 각 샘플을 정량하였다. 총 단백질을 SDS sample buffer(Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 50% glycerol, 0.1% bromophenol blue, 14.4 mM 2-mercaptoethanol; Sigma)와 혼합하여 100℃에서 10분간 끓인 후, SDSPAGE 전기 영동을 실시하였다. 전기영동 후 gel을 PVDF membrane(Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, U.

대상 데이터

15 M NaCl, 1% NP-40; Sigma)을 이용하여 단백질을 샘플링한다. Bicinchoninic acid(BCA)^TMproteinassay(Pierce, Rockford, IL, U.S.A.)을 이용하여 각 샘플을 정량하였다. 총 단백질을 SDS sample buffer(Tris-Cl pH 6.
본 실험에서는 Human granulosa 세포(KGN)를 사용하였다. 세포배양액은 Dulbecco's Modified Eagle's-F12 Medium와 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Welgene, Daegu, Korea)을 사용하였으며, 10% fetal bovine serum(Welgene)과 1% penicillin-streptomycin 첨가하여 37℃ 5% CO₂의 환경 하에서 배양하였다.
세포배양액은 Dulbecco's Modified Eagle's-F12 Medium와 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Welgene, Daegu, Korea)을 사용하였으며, 10% fetal bovine serum(Welgene)과 1% penicillin-streptomycin 첨가하여 37℃ 5% CO2의 환경 하에서 배양하였다.

데이터처리

각 실험에서 통계학적 분석은 Student’s t-test를 통해 분석하였으며, p-value 0.05 미만일 때 유의성이 있는 것으로 해석하였다.

이론/모형

Z-VAD-fmk의 농도에 따라 세포사멸율이 감소하는 결과를 확인하였다. BCL2L10 과다 발현에 따른 생존율의 저하 현상이 세포예정사(apoptosis)에 의한 세포사멸인지를 확인하기 위하여 Annexin V-staining 방법을 통하여 확인하였다. BCL2L10 단백질을 4 ㎍ transfection한 실험군에서 동일한 양의 control 백터를 발현한 대조군에 비해서 3배 정도 많은 세포가 검출되었다(Fig.
실직적인 세포사멸 마커인 Annexin V 염색방법을 사용하여 BCL2L10이 세포사멸을 유도하는지 다시 flow Cytometry 실험으로 확인하였다(Fig 2A). 또한 세포사멸 양상이 caspase의 활성에 인한 메커니즘인지 확인하기 위해서 웨스턴 방법을 사용하여 caspase 9, 3의 활성을 측정하였다(Fig 2B). 실험 결과 BCL2L10 단백질의 발현 양상에 따라서 caspase 9, 3의 활성화된 밴드를 확인할 수 있었다.
3A). 또한 실질적으로 미토콘드리아에서 cytochrome c가 분비되는 것을 확인하기 위해서 digitonin을 사용하여 세포를 cytosolic fraction과 membrane fraction으로 나누어 cytochrome c가 세포질로 분비되는 것을 웨스턴 실험 방법으로 확인하였다(Fig. 3B).
Caspase Inhibitor인 Z-VAD-fmk를 처리하였을 때 세포 사멸 양상이 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 Caspase 의존적인 세포사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있다. 실질적인 Caspase의 활성을 확인하기 위해서 western blot 방법을 사용하여 Caspase 9과 Caspase 3의 활성을 확인하였다(Fig. 2B). BCL2L10 단백질을 농도 의존적으로 발현하였을 경우 Caspase 9와 3의 활성화 되어진 밴드를 확인할 수 있었다.

성능/효과

BCL2L10 단백질의 발현 양상을 확인하기 위해 Lung cancer cell(A549), Embryonic Kidney cell(293T), Granulosa cell tumor(KGN), Cervix cancer(HeLa)에서 웨스턴 블롯 실험을 진행하였으며, 실험결과 BCL2L10 단백질의 발현은 lung, kidney, cercix와 granulosa cell에서 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, granulosa cell tumor(KGN)에서 다른 조직세포보다 더 많이 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1A).
이러한 미토콘드리아와 BCL2L10의 세포에서 위치를 확인하기 위해서 세포면역염색실험을 진행하였다. BCL2L10를 293T 세포에서 과발현하였고, confocal fluorescent microscopy를 사용하여 BCL2L10의 위치를 확인하였으며 BCL2L10은 부분적으로 미토콘드리아에 존재하고 있는 것으로 확인되었다(Fig. 3A). 또한 실질적으로 미토콘드리아에서 cytochrome c가 분비되는 것을 확인하기 위해서 digitonin을 사용하여 세포를 cytosolic fraction과 membrane fraction으로 나누어 cytochrome c가 세포질로 분비되는 것을 웨스턴 실험 방법으로 확인하였다(Fig.
Caspase Inhibitor인 Z-VAD-fmk를 처리하였을 때 세포 사멸 양상이 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 Caspase 의존적인 세포사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있다. 실질적인 Caspase의 활성을 확인하기 위해서 western blot 방법을 사용하여 Caspase 9과 Caspase 3의 활성을 확인하였다(Fig.
1C). Z-VAD-fmk의 농도에 따라 세포사멸율이 감소하는 결과를 확인하였다. BCL2L10 과다 발현에 따른 생존율의 저하 현상이 세포예정사(apoptosis)에 의한 세포사멸인지를 확인하기 위하여 Annexin V-staining 방법을 통하여 확인하였다.
BCL2L10 단백질을 농도 의존적으로 발현하였을 경우 Caspase 9와 3의 활성화 되어진 밴드를 확인할 수 있었다. 또한 BCL2L10의 발현에 따라 BAX 단백질의 양이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 Caspase의 활성은 세포괴사가 아닌 세포사멸(apoptosis)에 의한 pathway임을 확인하였다.
2A). 또한 세포사멸단백질로 잘 알려진 BAX을 같은 농도로 transfection한 양에 비하여 절반 정도의 세포 수를 확인하였으며, 이는 BAX의 활성율이 절반 정도 되는 것을 확인할 수 있다.
또한 세포사멸 양상이 caspase의 활성에 인한 메커니즘인지 확인하기 위해서 웨스턴 방법을 사용하여 caspase 9, 3의 활성을 측정하였다(Fig 2B). 실험 결과 BCL2L10 단백질의 발현 양상에 따라서 caspase 9, 3의 활성화된 밴드를 확인할 수 있었다. SiRNA를 사용한 BCL2L10의 Gastric cancer cells에서 knock-down은 세포사멸을 유도하며, BAX의 발현량을 증가시킨다는 보고가 있으며(Guillemin et al.
1B). 이러한 세포 수 감소의 원인이 세포사멸(apoptosis) 시그널 pathway 또는 세포괴사(necrosis)인지 확인하기 위해서 세포사멸의 실행자인 caspase inhibitor Z-VAD-fmk를 처리하여 세포생존율 측정을 하였고, 세포생존율이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1C). 실직적인 세포사멸 마커인 Annexin V 염색방법을 사용하여 BCL2L10이 세포사멸을 유도하는지 다시 flow Cytometry 실험으로 확인하였다(Fig 2A).
, 2001)에서의 BCL2L10 단백질의 세포사멸 기능연구를 진행하였다. 이번 연구를 통해서 우리는 BCL-2 패밀리 단백질 중의 하나인 BCL2L10 단백질 세포사멸유도 메커니즘이 human granulosa tumor cell 미토콘드리아가 관여하는 intrinsic pathway라는 것을 확인하였다.
2% triton-X100을 넣은 PBS에 15분간 반응시킨다. 이후 2% FBS가 함유된 PBS에 1시간 반응하여 비 특이적 반응을 억제하였다. Anti-BCL2L10 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
)의 다중 클로닝 부위를 제한효소 BamHI EcoRI으로 처리한 다음, 앞서 얻어진 PCR 산물을 클로닝하여 재조합 플라스미드 pc Flag-BCL2L10를 얻었다. 이후 Sanger 방법을 통해 서열분석을 수행한 결과, 재조합 플라스미드 pcBCL2L10 염기서열을 갖는 DNA를 포함하고 있음을 확인하였다.
, 1999). 즉, BCL2L10이 미토콘드리아에 위치하며, cytochrome c를 분비하는지 확인하기 위해서 confocal microscope로 BCL2L10단백질이 미토콘드리아에 위치하는지 확인하였으며(Fig. 3A), Digitonin을 사용한 세포분획방법을 사용 cytochrome c가 분비되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 이러한 세포사멸은 BAX, BAK 단백질 의존적으로 일어나며(Chipuk et al.

후속연구

, 2006), 동종 이합체 또는 이종 이합체를 형성하여 세포사멸을 유도한다. 앞으로의 연구는 실질적으로 BCL2L10 단백질의 세포사멸 양상이 BAX, BAK의 이종이합체에 의해서 유도되는 것을 확인하여야 하며 난소의 발달에 미치는 영향을 확인하여야 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	BCL-2 패밀리 단백질은 공통으로 어떤 도메인을 소유하고 있는가?	그 동안 진행된 활발한 연구를 통해서 현재까지 사람에게서 약 20종이 넘는 BCL-2 패밀리 단백질 구성원이 클로닝 되었다. 이러한 BCL-2 패밀리 단백질은 세포 apoptosis 신호전달 체계에서 중추적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 이들 패밀리 구성원들은 모두 공통적으로 BH(BCL-2 homology) 도메인을 소유하고 있다. BCL2L10 단백질은 1998년 클로닝되었다(Song et al.
	BCL-2 패밀리 단백질은 어떤 역할을 담당하는가?	그 동안 진행된 활발한 연구를 통해서 현재까지 사람에게서 약 20종이 넘는 BCL-2 패밀리 단백질 구성원이 클로닝 되었다. 이러한 BCL-2 패밀리 단백질은 세포 apoptosis 신호전달 체계에서 중추적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 이들 패밀리 구성원들은 모두 공통적으로 BH(BCL-2 homology) 도메인을 소유하고 있다. BCL2L10 단백질은 1998년 클로닝되었다(Song et al.
	본 연구를 통해 KGN(Nishi et al., 2001)에서의 BCL2L10 단백질의 세포사멸 기능연구를 진행한 결과, 어떤 점을 확인하였는가?	, 2001)에서의 BCL2L10 단백질의 세포사멸 기능연구를 진행하였다. 이번 연구를 통해서 우리는 BCL-2 패밀리 단백질 중의 하나인 BCL2L10 단백질 세포사멸유도 메커니즘이 human granulosa tumor cell 미토콘드리아가 관여하는 intrinsic pathway라는 것을 확인하였다.

참고문헌 (29)

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상세보기
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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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