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문제 정의
- 특히, JWS 1354균주는 NO를, JWS 58균주는 cytokine의 생성을 자극하는 것으로 나타났다. Macrophage를 활성화시키는 실험에는 열처리로 사멸시킨 유산균을 이용하였는데, 그 이유는 유산균의 증식으로 인해 배지가 산성화되면서 macrophage가 죽는 현상을 방지하기 위해서였다. 열처리로 사멸시킨 유산균도 macrophage를 활성화시켜 cytokine의 생산을 증가시킨다는 연구 보고가 발표되었다 [10, 18].
- 본 연구에서는 박테리오신 생성능력이 검증된 JWS 58 균주와 JWS 1354균주가 가진 면역 조절 능력을 평가하기 위해 in vitro 상에서 C57BL/6 마우스 peritoneal macrophage의 유산균에 의한 활성 효과를 NO와 cytokine 측정을 통해 실시하였으며, in vivo 상에서는 마우스 L. monocytogenes 감염 실험을 통해 병원성 미생물에 대한두 유산균주의 방어효과를 검증하기 위하여 실시되었다.
제안 방법
- NC와 PC에는 10% skim milk가 함유된 PBS 100 μL만을 경구투여 하였다. 2주 후에 JWS 58투여군, JWS 1354투여군 그리고 PC군의 마우스에 L monocytogenes 치사량인 1.2 × 10, CFU를 100μL PBS 에 현탁하여 미정맥을 통해 인공감염 시켰다. NC의 마우스에는 100 μL PBS만을 주사하였다 [6, 17].
- 모든 시험은 3반복씩 수행하였다. 37C, 5% CO에서 24시간 배양한 후, 상층액 만을 모아 NO와 cytokine(IL-1p, TNF-α)의 농도를 측정 하였다 [12, 25].
- 25);">IL-1β와 TNF-α의 농도는 ELISA set(BD, USA)를 이용하여 측정하였다. 450nm 에서 측정한 흡광도 값을 standard (0~2,000 pg/mL, IL-10; 0~1,000 pg/mL, TNF-α) 표준곡선을 이용하여 계산하였다. 모든 샘플과 standard 는 3반복씩 실시하였다.
- monocytogenes의 감염 시험은 normal control(NC), positive control(PC), JWS 58 투여군 그리고 JWS 1354투여군으로 총 4개의 군으로 나누어 실시하였으며, 각 군 별 7마리, 총 28마리의 마우스를 사용하였다. 7~9 주령의 암컷 BALB/c 마우스(Nara Biotech, Korea)에게 1 × 10CFU의 JWS 58 또는 JWS 1354균주 100 μL를 2주간 매일 경구투여 하였다. NC와 PC에는 10% skim milk가 함유된 PBS 100 μL만을 경구투여 하였다.
- 따라 분리하였다. C57BL/6 마우스(Nara Biotech, Korea)의 복강에 3 mL의 Brewer thioglycollate medium (Sigma, USA)을 복강내로 주사하고 4~5일 경과 후, CO2 로 안락사한 마우스의 복강에 5 mL PBS를 주사하여 복강을 세척하여 복수를 채취하였다. 그 후 4C, 1, 500rpm 에서 8분 간 원심 분리하여 cell pellet을 모은 후, PBS 로 2회 세척 하고, hemocytometer로 세포의 활력과 세포 수를 측정하였다.
- IL-1β와 TNF-α의 농도는 ELISA set(BD, USA)를 이용하여 측정하였다. 450nm 에서 측정한 흡광도 값을 standard (0~2,000 pg/mL, IL-10; 0~1,000 pg/mL, TNF-α) 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- In vitro 실험시, 유산:균을 5 × 10과 1X10 colony forming units(CFU)/ mH 희석하여 사용하였다. In vivo 실험의 경우에는 살아있는 유산균 1 × 10CFU를 100 μ丄의 10% skim milk 가 함유된 PBS 에 현탁하여 2주간 매일 경구투여 하였다.
- JWS 58균주와 JWS 1354균주가 in vitro 상에서 보여준 면역조절능력이 in vivo 상에서도 증명되는지 알아보기 위하여 마우스에 2주간 유산균을 투여한 뒤 L. monocytogenes를 감염시켜 유산균에 의한 숙주의 감염에 대한 저항성 증가 여부를 관찰하였다. 마우스의 체중의 경우, 2주간의 유산균 투여 후 L.
- JWS 58균주와 JWS 1354균주는 MRS broth(BD, USA) 에 37C에서 24시간 배양한 후, MRS plate를 이용하여균 수를 측정하였다. 또한, 배양액을 4C 에서 12, 000 rpm으로 10분 간 원심 분리하여 상층액은 버리고 균체만을 0.
- NC의 마우스에는 100 μL PBS만을 주사하였다 [6, 17]. L monocytogenes 감염 3일 후, 마우스의 체중을 측정하고 안락사 시킨 후, 복대정맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 수집하였다. 무균적으로 간과 비장을 적출하여 무게를 측정한 후, 간은 70 gm nylon mesh(Fisher Scientic Inc.
- L. monocytogenes BA00092은 농림수산검 역검사본부로부터 분양 받은 야생 균주로 BHI broth(BD, USA)에 37C 에서 12시간 배양한 후 BHI plate 에서 균수를 측정하였다. 4C 에서 12,000rpm으로 10분 간 원심 분리하여균체만 PBS로 두 번 세척한 후 2× 10CFU/mL로 희석하였다.
- 7~9 주령의 암컷 BALB/c 마우스(Nara Biotech, Korea)에게 1 × 10CFU의 JWS 58 또는 JWS 1354균주 100 μL를 2주간 매일 경구투여 하였다. NC와 PC에는 10% skim milk가 함유된 PBS 100 μL만을 경구투여 하였다. 2주 후에 JWS 58투여군, JWS 1354투여군 그리고 PC군의 마우스에 L monocytogenes 치사량인 1.
- NO의 농도는 Griess reagent(Promega, USA)를 이용하여 측정하였다. 50 μL의 macrophage 배 양액 또는 nitrite standard(0~100 μM sodium nitrite)에 1% sulfanilamide/} 함유된 5% phosphoric acid 50 μL와 0.
- Controle 사용할 well에는 유산균 대신 PBS 를 첨가하였다. Negative control well에는 유산균을 제외하고 PBS 만을 첨가하였으며, positive control well 에는 PBS와 함께 LPS(Sigma, USA)를 100 또는 500 ng/mL 씩 첨가하였다. LPS는 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 macrophages를 활성화시키는 것으로 알려져 있어 유산균에 의한 macrophages 활성화 정도를 평가하기 위해 사용되었다 [15].
- C57BL/6 마우스(Nara Biotech, Korea)의 복강에 3 mL의 Brewer thioglycollate medium (Sigma, USA)을 복강내로 주사하고 4~5일 경과 후, CO2 로 안락사한 마우스의 복강에 5 mL PBS를 주사하여 복강을 세척하여 복수를 채취하였다. 그 후 4C, 1, 500rpm 에서 8분 간 원심 분리하여 cell pellet을 모은 후, PBS 로 2회 세척 하고, hemocytometer로 세포의 활력과 세포 수를 측정하였다. 10%(v/v) FBS(Invitrogen, USA)와 100 mg/mL streptomycin과 100 U/mL penicillin(Invitrogen, USA)이 첨가된 RPMI 1640(Sigma, USA)배지에 macro- phage를 1 × 10cells/mL으로 희석하였다.
- 결과는 log 지수로 나타내었다. 마우스 혈청으로는 NO와 cytokine(IL-10, TNF-α)을 측정하였다 [20]. 모든 동물실험은 충북대학교 동물실험 윤리위원회의 규정을 준수하며 실시하였다.
- 마우스에 대한 L. monocytogenes의 감염 시험은 normal control(NC), positive control(PC), JWS 58 투여군 그리고 JWS 1354투여군으로 총 4개의 군으로 나누어 실시하였으며, 각 군 별 7마리, 총 28마리의 마우스를 사용하였다. 7~9 주령의 암컷 BALB/c 마우스(Nara Biotech, Korea)에게 1 × 10CFU의 JWS 58 또는 JWS 1354균주 100 μL를 2주간 매일 경구투여 하였다.
- 450nm 에서 측정한 흡광도 값을 standard (0~2,000 pg/mL, IL-10; 0~1,000 pg/mL, TNF-α) 표준곡선을 이용하여 계산하였다. 모든 샘플과 standard 는 3반복씩 실시하였다.
- LPS는 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 macrophages를 활성화시키는 것으로 알려져 있어 유산균에 의한 macrophages 활성화 정도를 평가하기 위해 사용되었다 [15]. 모든 시험은 3반복씩 수행하였다. 37C, 5% CO에서 24시간 배양한 후, 상층액 만을 모아 NO와 cytokine(IL-1p, TNF-α)의 농도를 측정 하였다 [12, 25].
- L monocytogenes 감염 3일 후, 마우스의 체중을 측정하고 안락사 시킨 후, 복대정맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 수집하였다. 무균적으로 간과 비장을 적출하여 무게를 측정한 후, 간은 70 gm nylon mesh(Fisher Scientic Inc., USA)로 균질화하여 PBS로 단계 희석하고 BHI plate에 접종하여, 간 내 L. monocytogenes의 균수를 측정하였다. 결과는 log 지수로 나타내었다.
- 박테리오신을 생산하는 JWS 58균주와 JWS 1354 균주의 면역 활성효과를 확인하기 위하여 마우스 macrophage에서 NO와 cytokine 생산량 측정을 통한 in vitro 실험을 실시하였다. 이를 토대로 마우스 L.
- 이 결과를 토대로 in vivo 상에서 마우스의 L. monocytogenes 감염 모델로 유산균 투여 시 면역 활성을 통한 숙주의 저항성 증가 여부를 확인하여 보는 실험을 실시하였다. L.
- 실험을 실시하였다. 이를 토대로 마우스 L. monocytogenes challenge model의 혈청 내 NO와 cytokine 수치 측정, 체중 당 간장과 비장의 무게 측정, 간 내 L. monocytogenes균 수 측정 등을 이용한 in vivo 실험을 실시하였다. 그 결과 두 균주에 의한 우수한 면역 활성 효과를 관찰할 수 있었으며 또한 L.
- 1% N-1- naphylethylenediamine dihydrochloride 50 μL를 섞 고 실온의 암실에서 10분간 방치한 후, microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 nm에서 홉광도를 측정하였다. 측정한 홉광도 값을 standard 표준곡선을 이용하여 NO의 농도를 계산하였다. 모든 샘플과 standard는 3반복씩 실시하였다 [19].
데이터처리
- 통계 처리는 SPSS(Windows ver. 12.0; SPSS, USA) 를이용하였으며 그룹간의 유의성 검정은 ANOVA와 Tukey’s multiple range test로 실시하였다 (p < 0.05).
이론/모형
- 마우스 peritoneal macrophage는 Zhang 등 [29] 의 방법에 따라 분리하였다. C57BL/6 마우스(Nara Biotech, Korea)의 복강에 3 mL의 Brewer thioglycollate medium (Sigma, USA)을 복강내로 주사하고 4~5일 경과 후, CO2 로 안락사한 마우스의 복강에 5 mL PBS를 주사하여 복강을 세척하여 복수를 채취하였다.
성능/효과
- TNF-α의 경우 JWS 58 투여군에서 NC군이나 PC군에 비해 증가되기는 하였지만, JWS 1354투여군처럼 통계적 유의성을 나타내지는 못하였다. Cytokine과는 다르게 혈청 내 NO량에 있어서는 4군 모두 유의성이 없는 것으로 나타났다(Fig. 3A).
- IL-1β 의 생성량은 유산균 농도에 따른 증가를 보였는데, 두 균주 모두 PBS를 첨가한 macrophage 보다 증가하였으나 JWS 58균주를 첨가한 macrophage의 증가 량이 훨씬 많았다. JWS 1354균주 저농도 처리군의 In vivo 실험 결과, 혈청 내 cytokine(IL-1p, TNF-α) 수치가 유산균 투여군의 마우스에서 비 투여군 (NC 군과 PC군)에 비해 월등하게 증가된 것을 볼 수 있었다. 특히 JWS 1354투여군의 cytokine 농도 증가가 현저하였다.
- 84 pg/mL) 과 유의성을 보이지 않았고 JWS 58균주의 경우 저농도처리 군은 LPS 100 ng/mL 처리군과 유사한 TNF-α 생성량을 나타내었다. JWS 58균주 고농도 처리군(592.39 ± 75.17pg/mL) 이 가장 많은 TNF-α 생산량을 보였으나, 이 또한 LPS 500 ngmL 처리군 (2, 767.11 ± 67.12 pg/mL) 보다는 적었다 (Fig. 1C).
- 2). PC군의 간 내 평균 L. monocytogenes 수는 4.3 × 10 CFU/g 이 었으나 JWS 58균주를 투여 한 마우스의 간 내 L. monocytogenes 수는 평균 5.2 × 10 CFU/g, JWS 1354균주는 4.1 × 10 CFU/g로 각각 88% 와 90.5% 의 감소율을 보였다.
- monocytogenes균 수 측정 등을 이용한 in vivo 실험을 실시하였다. 그 결과 두 균주에 의한 우수한 면역 활성 효과를 관찰할 수 있었으며 또한 L. monocytogenes 감염에서 숙주를 보호하는 능력을 가진 것으로 확인되었다. 두 유산균주 중에서 JWS 1354균주의 면역 활성효과가 더 높았지만 두 균주를 혼합하여 동물 사료 첨가용 복합 생균제로 개발할 경우, 산업적 활용가치가 더욱 높을 것으로 생각되었다.
- [19]. 그 결과, 유산균 투여가 간 내의 L monocytogenese 수를 크게 감소시킨 것으로 판단되었다. 또한 유산균 투여군은 L.
- 생성 량 증가 효과가 크지 않았다. 두 균주 모두 농도에 따른 증가를 보이기는 하였지만 JWS 1354 균주의 경우 두 농도 모두 PBS 처리군(140.33 ± 1.84 pg/mL) 과 유의성을 보이지 않았고 JWS 58균주의 경우 저농도처리 군은 LPS 100 ng/mL 처리군과 유사한 TNF-α 생성량을 나타내었다. JWS 58균주 고농도 처리군(592.
- monocytogenes 감염에서 숙주를 보호하는 능력을 가진 것으로 확인되었다. 두 유산균주 중에서 JWS 1354균주의 면역 활성효과가 더 높았지만 두 균주를 혼합하여 동물 사료 첨가용 복합 생균제로 개발할 경우, 산업적 활용가치가 더욱 높을 것으로 생각되었다.
- 그 결과, 유산균 투여가 간 내의 L monocytogenese 수를 크게 감소시킨 것으로 판단되었다. 또한 유산균 투여군은 L. monocytogenes 감염으로 인한 마우스 체중당 비장의 무게 증가가 PC 군에 비해 크지 않았는데, 이것은 아마도 유산균에 의한 숙주의 면역 활성으로 인한 보호 효과로 추측된다. Puertollano 등 [20] 또한 Lactobacillus plantarum 투여로 L.
- 마우스 혈청 내 cytokine 수치 또한 유산균 투여군에서 증가되는 경향을 나타내었다(Figs. 3B and C). 특히 JWS 1354투여군의 cytokine 수치가 많이 증가된 것을 볼 수 있었다.
- monocytogenes를 감염시켜 유산균에 의한 숙주의 감염에 대한 저항성 증가 여부를 관찰하였다. 마우스의 체중의 경우, 2주간의 유산균 투여 후 L. monocytogenes 감염 전 측정 결과, 모든 군간에 통계학적 유의성을 발견되지 않았으나, 감염 3일 후 측정한 체중에서 L. monocytogenes 감염 시킨 유산균 투여군과 PC군의 마우스 체중이 감염 시키지 않은 NC군에 비해 유의성 있게감소된 것으로 나타났다 (Table 1). 체중 당 간장의 무게또한 감염으로 인해 증가되었는데, 유산균 투여군의 증가 폭이 PC군에 비해 더 컸다.
- 체중 당 간장의 무게또한 감염으로 인해 증가되었는데, 유산균 투여군의 증가 폭이 PC군에 비해 더 컸다. 반면 체중 당 비장 무게는 유산균 투여군의 증가 폭이 PC군에 비해 작아 PC군이 NC군에 비해 비장 무게가 유의적으로 증가 된데 비해 유산균 투여군은 NC군과의 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.
- 열처리하여 사멸시킨 유산균에 의한 in vitro 상에서의 마우스 peritoneal macrophage의 NO 생성량의 경우 JWS 58균주를 5 × 10CFU/mL과 1 × 10 CFU/mL의 농도로 처리한 macrophage는 두 농도 모두에서 PBS만을 첨가한 군(0.79 ± 0.07gM/mL)에 비해 NO 생성이 유의적으로 증가되지 않았다. 하지만 JWS 1354균주를 첨가한 macrophage의 NO 생 성 량은 11.
- 오리로부터 분리한 유산균 JWS 58균주와 JWS 1354 균주의 macrophage에 대한 활성효과를 NO와 cytokine 을 통해 측정해 본 결과, 두 균주 모두 macrophage를 활성화 시켰다. 특히, JWS 1354균주는 NO를, JWS 58균주는 cytokine의 생성을 자극하는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, JWS 58균주와 JWS 1354 균주는 마우스의 macrophage를 활성화 시켜 NO 및 cytokine의 분비를 증가 시키는 능력을 가지고 있다. 또한 이와 같은 효과로 macrophage 및 숙주의 면역 체계가 활성화 되어 체내에 존재하는 L.
- monocytogenes 감염 시킨 유산균 투여군과 PC군의 마우스 체중이 감염 시키지 않은 NC군에 비해 유의성 있게감소된 것으로 나타났다 (Table 1). 체중 당 간장의 무게또한 감염으로 인해 증가되었는데, 유산균 투여군의 증가 폭이 PC군에 비해 더 컸다. 반면 체중 당 비장 무게는 유산균 투여군의 증가 폭이 PC군에 비해 작아 PC군이 NC군에 비해 비장 무게가 유의적으로 증가 된데 비해 유산균 투여군은 NC군과의 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.
- 시켰다. 특히, JWS 1354균주는 NO를, JWS 58균주는 cytokine의 생성을 자극하는 것으로 나타났다. Macrophage를 활성화시키는 실험에는 열처리로 사멸시킨 유산균을 이용하였는데, 그 이유는 유산균의 증식으로 인해 배지가 산성화되면서 macrophage가 죽는 현상을 방지하기 위해서였다.
후속연구
- 이와 같은 학문적 배경에서 볼 때, JWS 58균주와 JWS 1354균주는 오리에서 분리한 비 병원성의 유산균주로서 박테리오신을 생산하는 능력과 면역활성효과를 동시에 가지고 있으므로 두 균주를 혼합하여 동물 사료첨가용 복합 생균제로 개발한다면 항생제대체제로서 산업적 활용가치가 높을 것으로 기대된다. 이를 위해서는 JWS 58와 JWS 1354 두 균주의 마우스에서 나타난 면역 활성효과가 생균제를 사용 하고자 하는 동물에서의 재현성 여부와 사용 동물의 안전성 검증에 대한 연구가 추가로 행해져야 할 것이다.
- [7]. 이와 같은 학문적 배경에서 볼 때, JWS 58균주와 JWS 1354균주는 오리에서 분리한 비 병원성의 유산균주로서 박테리오신을 생산하는 능력과 면역활성효과를 동시에 가지고 있으므로 두 균주를 혼합하여 동물 사료첨가용 복합 생균제로 개발한다면 항생제대체제로서 산업적 활용가치가 높을 것으로 기대된다. 이를 위해서는 JWS 58와 JWS 1354 두 균주의 마우스에서 나타난 면역 활성효과가 생균제를 사용 하고자 하는 동물에서의 재현성 여부와 사용 동물의 안전성 검증에 대한 연구가 추가로 행해져야 할 것이다.
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