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문제 정의
- 정착을 하기 위한 전제조건이다[13]. 본 연구를 통해선 발한 L. salivarius CPM-7이 동물의 장관세포에의 흡착능이 있는지의 여부를 간이실험을 통해 조사하였다. Overnight 배양한 L.
- salivarius CPM-7의 가능성을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 E. c에 대한 항균활성이 높은 L. salivarius CPM-7를 산란계의 분변으로부터 분리하였으며, 생균제적 특성에 대하여 조사하였다. L.
- 본 연구에서는 닭의 분변으로부터 L. salivarius를 분리하여 그 생균제적 특성을 조사하였으며, 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- pH 2, 3, 4로 각각 조절한 MRS broth 5 ml에 overnight 배양한 유산균 배양액(" cells/ml)을 2%씩 접종하고 37°C 에서 3(분에서 6시간동안 배양한 후에 생균수를 측정함 2로써 내산성 정도를 확인하였다.
- 동일한 인산완충용액으로 현탁한 L. salivarius CPM-7과 상피세포 현탁액을 혼합하고 37。(3에서 30분간 배양하였으며, 그람염색한 후에 상피세포흡착여 부를 광학현미경으로 관찰하였다.
- Genomic DNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 genomic DNA를 주줄한 다음, eubacterial 16S rDNA 클로닝을 위하여 forward primer(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer(5'-AAG GAG GTG ATC CAG C:C-3') set를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 50 pmole primer, 50 ng template DNA, lOxTaq DNA polymerase buffer 5 |1L, 2.5 mM dNTP mixture 4 mL, Taq DNA polymerase(Takara, Japan) 1 U가 포함된 PCR mixturet 95P에서 5분간 변성시킨 후에 95°C에서 1분, 55〜60°C에서 1분, 7/C에서 1분간 30 cycle을 반보함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1 (Novagen, USA)에 클로닝 한 다음, BigDye™- terminator sequencing kit 과 AB I PRISM377 sequencer (Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다.
- Bile salts를 각각 0.1%, 0.2%, 0.3% 첨가한 MRS broth 5 ml에 overnight 배양한 유산균 배양액(IO® cells/ml)을 2% 씩 접종하고 37°C에서 30°C에서 6시간동안 배양한 후에 생균 수를 측정함으로써 내담즙성 정도를 확인하였다.
- 쿤리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위히서는 Pavlova 등[⑵의 방법을 이용하였다. Genomic DNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 genomic DNA를 주줄한 다음, eubacterial 16S rDNA 클로닝을 위하여 forward primer(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer(5'-AAG GAG GTG ATC CAG C:C-3') set를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 50 pmole primer, 50 ng template DNA, lOxTaq DNA polymerase buffer 5 |1L, 2.
- 이하의 조건인 동물의 위를 통과하여야 한다. IN HC1 로 pH 2, 3, 4로 각각 조정한 MRS 액체배지에 L. salivarius CPM-7을 접종한 후에 37에서 배양하면서 배양시간별 생균 수의 변화를 관찰화였다. Fig.
- France)를 사용하였다. L. salivarius CPM- 7를 MRS 고체배지에서 배양한 후에 균체를 회수하여 0.85% NaCl 용액에 현탁하였다(Mcfarland 탁도 5~6로 조정 ). ZYM kit의 각 cupule에 현탁액을 65 pL씩 분주하고 37°C에서 4 시간 배양한 후에 색깔의 변화를 관찰함으로써, 효소의 활성 정도를 조사하였다.
- L. salivarius CPM-7 균주의 배양시간에 따른 항균력을 조사하기 위하여, CPM-7 균주를 MRS 액체배지에 접종하고 37°C에서 배양하였다. 배양 12시간 이후부터 6〜12시간 간격으로 배양액을 채취하였으며 , 배양 상등액 또는 중화액을 항균력 측정실험에 사용하였다.
- L. salivarius CPM-7 배양액의 대장균 억제능을 몇 가지 항생물질과 비교하였다. 자돈 설사를 유발시키는 것을 알려진 E.
- 이다. L. salivarius CPM-7의 담즙산 내성을 측정하기 위하여, 담즙산염 (bile salt) 0.1~0.3%가 각각 함유된 MRS broth에 L. salivarius CPM-7 배양액 0.1 %를 접종한 후에 37°C에서 배양하면서 배양시간별 생균수의 변화를 관찰하였다. Fig.
- 2에서 보는 바와 같이 배양 12시간 즉, 대수기부터 대장균 억제환이 뚜렷하게 나타났으며 배양 48시간, 즉 정체기까지 억제능이 지속되었다. L. salivarius CPM-7의 항균력이 유기산 또는 다른 물질에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여, sodium acetate bufFer(pH 6.0)를 첨가하여 배양액을 중화시킨 후에 대장균 억제 능을 조사하였다. 중화 후의 대장균 저해환(Fig.
- 5 mM dNTP mixture 4 mL, Taq DNA polymerase(Takara, Japan) 1 U가 포함된 PCR mixturet 95P에서 5분간 변성시킨 후에 95°C에서 1분, 55〜60°C에서 1분, 7/C에서 1분간 30 cycle을 반보함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1 (Novagen, USA)에 클로닝 한 다음, BigDye™- terminator sequencing kit 과 AB I PRISM377 sequencer (Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다.
- 대장균 중층배지 위에 놓인 paper disk 위에 24시간 및 48시간 동안 배양한 선발균주의 배양액을 각각 100식 roading하였으며, 항생물질과의 항균력을 비교하기 위해 kanamycin(30 pg), penicillin(10 units), tetracycline(30 ug), chloramphenicol(30 pig)이 함유된 paper disk-f- 사용하였다. Paper disl를 올려 놓고 30°C에서 overnight 배양한 후에 각각의 억제환의 크기를 비교하였다.
- 85% NaCl 용액에 현탁하였다(Mcfarland 탁도 5~6로 조정 ). ZYM kit의 각 cupule에 현탁액을 65 pL씩 분주하고 37°C에서 4 시간 배양한 후에 색깔의 변화를 관찰함으로써, 효소의 활성 정도를 조사하였다.
- 분리한 균주의 형태학적인 특징은 전자현미경 (Scanning Electron Microscopy) 으로 관찰하였으며, Sohn 등[15}의 방법에 준하였다. 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해서는 API 50CHL kit (BioMerieux, France)를 사용하였다. 또한 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다.
- CPM-7 균주는 glucose, galactose, fructose, mannitol, sorbitol과 같은 6탄당 및 그 환원당, maltose, lactose, sucrose와 같은 이당류 등을 선택적으로 이용하는 특성을 나타내었다. 당 이용성 차이를 이용한 동정 이외에 분자생물학적 동정도 시도하였다. CPM-7 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석한 후에(data not shown), NCBI의 BLAST search program을 이용하여 상동성을 비교한 결과, 99.
- coli K88을 overlay한 LB 중층배지를 사용하였다. 대장균 중층배지 위에 놓인 paper disk 위에 24시간 및 48시간 동안 배양한 선발균주의 배양액을 각각 100식 roading하였으며, 항생물질과의 항균력을 비교하기 위해 kanamycin(30 pg), penicillin(10 units), tetracycline(30 ug), chloramphenicol(30 pig)이 함유된 paper disk-f- 사용하였다. Paper disl를 올려 놓고 30°C에서 overnight 배양한 후에 각각의 억제환의 크기를 비교하였다.
- 대장균에 대한 억제능이 우수한 CPM-7 균주의 형태학적 특징을 관찰하였다. 주사전자현미경으로 관찰한 바와 같이 간균(rod) 형태의 균주임을 알 수 있었으며 (Fig.
- 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해서는 API 50CHL kit (BioMerieux, France)를 사용하였다. 또한 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다. 쿤리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위히서는 Pavlova 등[⑵의 방법을 이용하였다.
- salivarius CPM-7 균주의 배양시간에 따른 항균력을 조사하기 위하여, CPM-7 균주를 MRS 액체배지에 접종하고 37°C에서 배양하였다. 배양 12시간 이후부터 6〜12시간 간격으로 배양액을 채취하였으며 , 배양 상등액 또는 중화액을 항균력 측정실험에 사용하였다. Fig.
- 본 실험에서 분리한 L. salivarius CPM-7이 어떠한 효소 역가를 나타내는지 확인하기 위해 API ZYM kit를 사용하였다. Table 2에서 보는 바와 같이, L.
- 분리한 균주를 등정하기 위하여 16S rRNA 서열과 형태학적, 생화학적 특성 등을 조사하였다. 분리한 균주의 형태학적인 특징은 전자현미경 (Scanning Electron Microscopy) 으로 관찰하였으며, Sohn 등[15}의 방법에 준하였다.
- 분리한 균주의 배양액과 항생물질과의 항균력을 비교하기 위하여 E. coli K88을 overlay한 LB 중층배지를 사용하였다. 대장균 중층배지 위에 놓인 paper disk 위에 24시간 및 48시간 동안 배양한 선발균주의 배양액을 각각 100식 roading하였으며, 항생물질과의 항균력을 비교하기 위해 kanamycin(30 pg), penicillin(10 units), tetracycline(30 ug), chloramphenicol(30 pig)이 함유된 paper disk-f- 사용하였다.
- 선발한 균주의 효소 활성을 조사하기 위해서 API ZYM kit(BioMerieux, France)를 사용하였다. L.
- coli K88을 도말한 LB 평판배지에 둥근 홈을 파고 유산균 배양액을 첨가하는 agar well difliision assay 방법을 사용하였다[1]. 유산균 배양액을 agar well에 첨가하고 4에서 2시간동안 방치한 후에 37에서 overnight 배양하였으며, 지시균의 생육 억제환의 크기를 관찰함으로써 항균력을 측정하였다.
- salivarius CPM-7 배양액의 대장균 억제능을 몇 가지 항생물질과 비교하였다. 자돈 설사를 유발시키는 것을 알려진 E. coli K88를 도말한 LB 평판배지에 L. salivarius CPM-7 배양액 100 uL 및 항생물질이 함유된 paper disk 를 올려놓고 overnight 배양한 후에 억제환의 크기를 비교 관찰하였다. Fig.
대상 데이터
- 단국대학교 실험 농장에서 사육하는 산란계의 분변으로부터 균주를 분리하였다. 계분을 0.
- 단국대학교 실험농장에서 사육하는 산란계의 분변을 채취한 후에 MRS 고체배지에 도말함으로써 다수의 유산 균주를 선발하였다. 선발된 균주 중에서, 돼지의 설사를 유발하는 것으로 알려진 E.
- 무작위 선발법을 이용하여 1차적으로 균주들을 분리한 후에, MRS broth가 첨가된 96-well plate에 접종하고 37°C에서 1일간 배양하였다. 돼지의 설사를 유발하는 E. coli K88 이 도말된 LB 평판배지에 홈을 판 후에, 배양액을 100-200 IX 접종하고 37°C에서 배양하였으며 , 대장균 억제 환이 큰 유산균을 최종적으로 선발하였다.
- 선발된 균주 중에서, 돼지의 설사를 유발하는 것으로 알려진 E. coll K88에 대한 항균력이 가장 우수한 CPM-7 균주를 최종 선발하였다(data not shown).
- 유산균 분리용 기본배지로는 de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) 평판배지 또는 액체배지를 사용하였으며, 37에서 배양하였다. 항균활성 측정용 지시균으로는 돼지의 설사를 유발하는 E.
- 항균활성 측정용 지시균으로는 돼지의 설사를 유발하는 E. coli K88을 사용하였으며, 배양 배지로는 Luria- Bertani (LB) 평판배지 또는 액체배지를 사용하였다.
이론/모형
- 생화학적 특성 등을 조사하였다. 분리한 균주의 형태학적인 특징은 전자현미경 (Scanning Electron Microscopy) 으로 관찰하였으며, Sohn 등[15}의 방법에 준하였다. 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해서는 API 50CHL kit (BioMerieux, France)를 사용하였다.
- 선발한 균주의 장 상피세포 흡착능을 조사하기 위하여 , 돼지의 소장 조직을 채취한 후에 Mayra-Makinen 등의 방법 [8]에 의해 실험을 진행하였다. 장 상피세포 조직을 1x4 cm 크기의 조각으로 자른 후에 , 인산완충용액 (pH 7.
- 지시균으로 사용한 E. coli K88을 도말한 LB 평판배지에 둥근 홈을 파고 유산균 배양액을 첨가하는 agar well difliision assay 방법을 사용하였다[1]. 유산균 배양액을 agar well에 첨가하고 4에서 2시간동안 방치한 후에 37에서 overnight 배양하였으며, 지시균의 생육 억제환의 크기를 관찰함으로써 항균력을 측정하였다.
- 또한 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다. 쿤리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위히서는 Pavlova 등[⑵의 방법을 이용하였다. Genomic DNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 genomic DNA를 주줄한 다음, eubacterial 16S rDNA 클로닝을 위하여 forward primer(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer(5'-AAG GAG GTG ATC CAG C:C-3') set를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다.
성능/효과
- 2B(b)) 의 크기가 중화전(Fig. 2B(a))에 비해 줄어들었지만 중화 후에도 배양시간에 관계없이 저해환이 나타나는 것으로 볼 때, CPM-7 균주가 분비하는 유기산 이외에도 다른 항균물질이 함유되어 있을 것으로 추측되었다. 유산균의 항균력은 주로 배양 중에 생성되는 유기산에 의한 것이나, 이외에도 박테리오신, 과산화수소, diacetyl 등에 의한 것으로 알려져 있다[6, 14, 16], 본 실험에서 나타난 바와 같이, CPM-7 균주가 분비하는 유기산 이외의 항균물질에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 탄소원 이용성 차이로 동정하는 API CHL kit를 사용하여 CPM-7 균주를 1차 동정한 결과, Lactobacillus systems로 동정되었다(신뢰도 99%). CPM-7 균주는 glucose, galactose, fructose, mannitol, sorbitol과 같은 6탄당 및 그 환원당, maltose, lactose, sucrose와 같은 이당류 등을 선택적으로 이용하는 특성을 나타내었다. 당 이용성 차이를 이용한 동정 이외에 분자생물학적 동정도 시도하였다.
- 당 이용성 차이를 이용한 동정 이외에 분자생물학적 동정도 시도하였다. CPM-7 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석한 후에(data not shown), NCBI의 BLAST search program을 이용하여 상동성을 비교한 결과, 99.9%의 신뢰도로 L. salivarins로 동정 되었다. 따라서, 본 연구에서 선발한 CPM-7 균주를 L.
- 배양 12시간 이후부터 6〜12시간 간격으로 배양액을 채취하였으며 , 배양 상등액 또는 중화액을 항균력 측정실험에 사용하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 배양 12시간 즉, 대수기부터 대장균 억제환이 뚜렷하게 나타났으며 배양 48시간, 즉 정체기까지 억제능이 지속되었다. L.
- salivarius CPM-7을 접종한 후에 37에서 배양하면서 배양시간별 생균 수의 변화를 관찰화였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이, L. salivarius CPM-7를 pH 2에서 30분간 두었을 때 거의 절반이 생존하였으며(48%), 30분 이후부터는 생존률이 급격히 감소하였다. 한편, pH 3에서의 생균수는 접종 초기와 거의 비슷한 수준을 유지하였으며, pH 4에서는 control 구(pH 미조정구) 와 유사하게 배양시간에 따라 생균수가 오히려 증가하였다.
- salivarius CPM-7 배양액 100 uL 및 항생물질이 함유된 paper disk 를 올려놓고 overnight 배양한 후에 억제환의 크기를 비교 관찰하였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이, L. salivarius CPM-7 균주의 24시간 및 48시간 배양액의 대장균 억제 능은 chloramphenicol(30 pg) 보다는 낮았으나, penicillin(10 units), kanamycin(30 pg) 및 tetracycline(30 gg) 보다는 높았다. 본 실험에서 나타난 항균효과는 CPM-7 균주가 분비하는 유기산과 본 실험에서 아직 규명되지 않은 항균물질과의 복합적인 작용으로 나타나는 것으로 사료된다.
- salivarius CPM-7이 동물의 장관세포에의 흡착능이 있는지의 여부를 간이실험을 통해 조사하였다. Overnight 배양한 L. salivarius CPM.7을 돼지의 장 상피세포 현탁액과 37°C에서 30분간 혼합한 결과, L. salivarius CPM-7이장 상피세포에 흡착함을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 생균제의 장관세 포 흡착능 여부는 숙주동물 특이적 (host-specific) 이라고 알려져 있지만[3, 8], 본 연구를 통하여 닭의 분변에서 분리한 L.
- salivarins로 동정 되었다. 따라서, 본 연구에서 선발한 CPM-7 균주를 L. salivarius CPM-7으로 명명하였다.
- 3%의 담즙산에서 24시간 후에도 76%의 생존률을 나타내어 담즙산에 강한 내성을 나타내었다[11]. 본 실험에서 나타난 바와 같이 , L. salivarius CPM- 7은 담즙산에 대한 내성이 강한 편으로 나타났기 때문에 생균제로서의 가치가 있을 것으로 판단되었다.
- salivarius CPM-7 균주의 24시간 및 48시간 배양액의 대장균 억제 능은 chloramphenicol(30 pg) 보다는 낮았으나, penicillin(10 units), kanamycin(30 pg) 및 tetracycline(30 gg) 보다는 높았다. 본 실험에서 나타난 항균효과는 CPM-7 균주가 분비하는 유기산과 본 실험에서 아직 규명되지 않은 항균물질과의 복합적인 작용으로 나타나는 것으로 사료된다. 이상의 실험 결과에서 본 바와 같이, 항생제를 대체할 수 있는 생균제로서 L.
- 5). 생균제의 장관세 포 흡착능 여부는 숙주동물 특이적 (host-specific) 이라고 알려져 있지만[3, 8], 본 연구를 통하여 닭의 분변에서 분리한 L. salivarius CPM-7가 돼지의 장관 상피세포에도 홉착함을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서 나타난 항균효과는 CPM-7 균주가 분비하는 유기산과 본 실험에서 아직 규명되지 않은 항균물질과의 복합적인 작용으로 나타나는 것으로 사료된다. 이상의 실험 결과에서 본 바와 같이, 항생제를 대체할 수 있는 생균제로서 L. salivarius CPM-7의 가능성을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 E.
- 관찰하였다. 주사전자현미경으로 관찰한 바와 같이 간균(rod) 형태의 균주임을 알 수 있었으며 (Fig. 1), Gram 양성, catalase 음성으로서 포자를 형성하지 않았다(data not shown). 탄소원 이용성 차이로 동정하는 API CHL kit를 사용하여 CPM-7 균주를 1차 동정한 결과, Lactobacillus systems로 동정되었다(신뢰도 99%).
- 1), Gram 양성, catalase 음성으로서 포자를 형성하지 않았다(data not shown). 탄소원 이용성 차이로 동정하는 API CHL kit를 사용하여 CPM-7 균주를 1차 동정한 결과, Lactobacillus systems로 동정되었다(신뢰도 99%). CPM-7 균주는 glucose, galactose, fructose, mannitol, sorbitol과 같은 6탄당 및 그 환원당, maltose, lactose, sucrose와 같은 이당류 등을 선택적으로 이용하는 특성을 나타내었다.
후속연구
- salivarius CPM-7를 산란계의 분변으로부터 분리하였으며, 생균제적 특성에 대하여 조사하였다. L. salivarius CPM-7는내산성 및 내담즙성 이 우수한 편으로 나타났을 뿐만 아니라 유해균에 대한 항균활성이 강하기 때문에, 추가적인 연구를 통해 L. salivarius CPM-7이 분비하는 항균뮬질의 특성 조사 및 동물용 생균제로서의 적용 연구를 지속할 예정이다.
- 2B(a))에 비해 줄어들었지만 중화 후에도 배양시간에 관계없이 저해환이 나타나는 것으로 볼 때, CPM-7 균주가 분비하는 유기산 이외에도 다른 항균물질이 함유되어 있을 것으로 추측되었다. 유산균의 항균력은 주로 배양 중에 생성되는 유기산에 의한 것이나, 이외에도 박테리오신, 과산화수소, diacetyl 등에 의한 것으로 알려져 있다[6, 14, 16], 본 실험에서 나타난 바와 같이, CPM-7 균주가 분비하는 유기산 이외의 항균물질에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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