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문제 정의
- 본 연구에서는 지표수의 잠재적 위험성을 갖고 있는 가축분변에 대한 생태유해성이나 공중보건위해성의 측면에서 지표미생물의 분리 동정 및 가축분변 및 퇴비중의 항생제 다재내성균의 오염실태를 조사하여 다음과 같은 결론을 도출하였다.
- 이에 본 연구에서는 소, 돼지, 닭을 사육하는 축산농가를 무작위로 선정하여 가축의 분변 및 퇴비에서 채취한 검체로부터 지표수 수질에 영향을 미칠 수 있는 축분 유래 지표미생물의 분포 현황을 조사하고, 분리한 항생제 다재 내성균을 대상으로 16S rRNA Sequencing으로 동정하여 지표수 수질관리에 필요한 자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 1. PCR(Polymerase Chain Reaction) Amplification 멸균된 1.5 ml 원심분리 튜브에 0.5 ml의 멸균 생리식염수를 넣고 각각의 검체에서 분리한 호기성균주 중 항생제(Amoxicillin, Ampicillin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Streptomycin, Tetracycline, Vancomycin)에 다재 내성을 보이는 균주를 멸균된 백금이를 이용하여 순수 집락을 취하여 혼합하였다. 혼합된 1.
- PCR 반응에 참여하지 않은 반응물과 dNTPs는 Montage PCR Clean Up Kit(Millipore)를 이용하여 정제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystems, Forster City, CA, USA)를 이용하여 Sequencing 반응을 실시하였다.
- PCR 증폭은 20 µl PCR 반응용액에 Template DNA 1 µl를 첨가하여 MJ Reserch PTC-225 Peltier Thermal Cycler PCR Machine을 사용하였으며, 증폭을 위해 Universal Primer 27F(5'-AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGAC TT-3')을 사용하였다.
- 가축분변유래 항생제 내성균 분포를 조사하기 위하여 축산농가에서 채취한 각각의 돼지, 소, 닭의 분변시료 중의 호기성세균(Aerobic Bacteria)을 분리하였고, 총 대장균군(Total Coliform : TC)과 분원성대장균군(Fecal Coliform : FC)을 조사하여 TC와 FC에서 대장균 균주를 분리하였다. 분리 균주수는 호기성세균 67균주, 대장균 34균주이었다.
- 대장균 시험은 시료 100 ml를 Membrane Filter (Diameter 47 mm, Pore Size 0.45 µm)로 여과한 다음 여과지를 MacConkey Agar(Difco) 배지에 접종 하여 35±1℃에서 24~48시간 동안 배양한 후 적갈색 또는 핑크색의 집락을 계수(CFU/g)하였다.
- 대장균의 분리는 적갈색 또는 핑크색의 집락을 Durham Tube가 포함된 유당배지(Lactose Broth)에 접종하여 35±1℃에서 48±3시간 동안 배양 후 가스 발생이 확인되는 균주에 대해 Gram 염색 결과에 따라 Gram(−), 무아포성 간균이 증명되면 완전 시험을 통해 최종 확인하였다.
- 분원성대장균 시험은 시료 100 ml를 Membrane Filter(Diameter 47 mm, Pore Size 0.45 µm)로 여과한 다음, m-FC Agar(Difco) 배지에 접종 후 배양 온도에 미치는 실험실의 공기의 영향을 최소화하기 위하여 방수되는 플라스틱 백에 밀봉하여 44.5±0.2℃의 water bath에서 24±2시간 동안 배양한 후에 짙은 푸른색을 띠는 집락을 계수(CFU/g)하였다.
- 염기서열 분석 결과는 National Center For Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 이용하여 16S rRNA Database 정보와 유사한 염기서열을 비교하였고 각각 계통분류학적 위치를 계(Domain) > 문(Phylum) > 강(Class) > 목(Order) > 과(Family) 단계에 이은 ‘속(Genus)’ 단계에서 해당 미생물을 판단하였다.
- 충남 A지역 축산 농가의 주요 축종인 소, 돼지, 닭 농가를 무작위로 선택하여 각각의 농가로부터 돈분, 우분, 계분의 샘플을 무균 팩에 각각 약 300 g씩 채취하였으며, 퇴비는 각 지역에서 생산된 돈분퇴비, 우분퇴비, 계분퇴비의 샘플을 채취하였다. 채취된 시료는 무균 팩에 담아 냉장상태로 보관하여 실험실로 운반한 후, 냉장보관하면서 24시간 이내에 시험 하였다.10,11)
- 채취한 각각의 시료 1 mg를 멸균생리식염수(0.85% NaCl)에 넣고 충분히 교반 후 상등액을 멸균된 희석수에 10배수로 희석한 후 각 단계별 1ml를 N/A (Difco BactoTM Nutrient Agar)배지에 접종하여 35℃에서 24시간 배양 후, 각 시료별 15~20개의 특정 집락을 선별한 후 각 집락별로 3차에 걸쳐 계대 배양을 반복하여 순수 분리하였다.12)
- 총 대장균군 시험은 시료 100 ml를 Membrane Filter(Diameter 47 mm, Pore Size 0.45 µm)로 여과한 다음, 여과지를 m-Endo Agar LES(Difco) 배지에 접종하여 35±0.5℃에서 24±2시간 동안 배양한다음 암적색의 금속광택을 발하는 집락을 계수(CFU/ g)하였다.
대상 데이터
- 반응에 사용한 Universal Primer는 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3')이며, 염기서열 분석에는 ABI Prism 3730XL Analyzer(96 Capillary Type)를 이용 하였다.
- 충남 A지역 축산 농가의 주요 축종인 소, 돼지, 닭 농가를 무작위로 선택하여 각각의 농가로부터 돈분, 우분, 계분의 샘플을 무균 팩에 각각 약 300 g씩 채취하였으며, 퇴비는 각 지역에서 생산된 돈분퇴비, 우분퇴비, 계분퇴비의 샘플을 채취하였다. 채취된 시료는 무균 팩에 담아 냉장상태로 보관하여 실험실로 운반한 후, 냉장보관하면서 24시간 이내에 시험 하였다.
성능/효과
- 1. 가축분변의 미생물학적 분석결과 호기성세균의경우 우분퇴비에서 1.5×105 CFU/g로 가장 많은 개체수를 나타내었다.
- 2. 총 대장균의 경우는 돈분에서 1.1×107 CFU/g로 가장 많은 개체수를 보였고, 계분퇴비에서 각각 1.0×104 CFU/g로 가장 적은 개체수를 나타내었다.
- 3) 장내세균의 한 종류로 존재하는 대장균군(coliform bacteria)의 분포상황을 파악함으로써 배설물 오염에 의한 병원성 미생물의 존재 가능성을 확률적으로 나타낼 수 있다.
- 3. 분원성대장균은 돈분에서 1.0×105 CFU/g로 가장 많은 개체수를 보였고, 계분퇴비에서 1.0×103 CFU/g로 가장 적은 개체수를 나타내었으며, 총 대장균과 분원성대장균 분포가 퇴비에서보다 모든 분변시료에서 높은 개체수를 보였다.
- 4. 호기성세균에서 분리된 67종의 균주 중 시료 별로 항생제 내성률이 높은 다제 내성균주의 16S rRNA Sequencing 결과 Shigella boydii, Staphylococcus lentus, Acinetobacter sp., Brevibacterium luteolum 등으로 판별되었다.
- 8) 전 세계적으로 세균의 항생제 내성이 문제 되고 있으며 국내에서도 항생제 내성률이 세계적으로 손꼽을 정도로 높은 실정이어, 내성균 문제는 심각한 상황으로 발전될 가능성을 지니고 있다.9) 지표미생물은 지표수의 수질을 결정하는 중요한 기준이지만, 축분에서 발생하는 지표미생물의 특성에 관한 자료가 많지 않다.
- 각각의 가축분변 및 퇴비 시료에서 분원성대장균의 분포정도를 조사한 결과 돈분에서 최대 1.0×105 CFU/g로 조사되었고, 계분 퇴비에서 1.0×103 CFU/ g로 가장 낮은 분포를 보였다.
- 각각의 가축분변 및 퇴비 시료에서 총 대장균군의 개체수 분포정도를 조사한 결과는 계분퇴비가 1.0×104 CFU/g로 가장 적었으며, 돈분 분변에서 1.1×107 CFU/g으로 가장 높은 개체수를 나타내었다.
- 각각의 가축분변 및 퇴비 시료에서 호기성세균의 분포정도를 조사한 결과 최소 1.0×104 CFU/g에서최대 1.5×105 CFU/g의 분포를 나타내었다.
- 각각의 검체에서 분리한 호기성균주 중 다제 내성균 5종을 선별하여, FF-8, SF-5, SC-2, CC-9A, CF-5로 명명하였다.
- 5×105 CFU/g로 가장 많은 개체수를 나타내었다. 개체수 분포정도는 우분퇴비, 돈분 퇴비, 계분퇴비의 순 이였으며, 우분과 돈분은 퇴비에서, 계분은 분변에서 각기 더 높았다.
- 돈분에서는 호기성세균 11균주, 대장균 8균주, 돈분 퇴비에서는 호기성세균 12균주, 대장균 12균주를 분리하였고, 우분에서는 호기성세균 15균주, 대장균 1균주, 우분퇴비에서는 호기성세균 16균주, 대장균 1균주를 분리하였다. 계분에서는 호기성세균 13균주, 대장균 1균주, 계분퇴비에서는 대장균 11균주를 분리하였다.
- 가축분변유래 항생제 내성균 분포를 조사하기 위하여 축산농가에서 채취한 각각의 돼지, 소, 닭의 분변시료 중의 호기성세균(Aerobic Bacteria)을 분리하였고, 총 대장균군(Total Coliform : TC)과 분원성대장균군(Fecal Coliform : FC)을 조사하여 TC와 FC에서 대장균 균주를 분리하였다. 분리 균주수는 호기성세균 67균주, 대장균 34균주이었다.
- 분리된 균주의 형태적 특성을 확인하기 위하여 그람 염색을 하였으며, 광학현미경(Olympus BX50)을 이용하여 관찰한 결과 Gram(−) 구균, Gram(−) 간균등으로 확인되었다.
- 0×103 CFU/ g로 가장 낮은 분포를 보였다. 분변과 퇴비를 비교했을 때 총 대장균군에서와 마찬가지로 퇴비보다 분변에서 모두 높은 개체수를 보였다. 전체 분석결과를 Table 2에 나타내었다.
- 분포정도를 살펴보면 가장 많은 개체수를 나타낸 것은 우분퇴비이며, 가장 적은 개체수를 나타낸 것은 계분 퇴비이었다. 분변과 퇴비에서의 호기성세균수를 비교하면 우분과 돈분은 퇴비에서, 계분의 경우에는 분변에서 각기 더 높은 개체수 분포를 보였다. 분석결과는 Table 2에 나타내었다.
- 총 대장균군과 분원성대장균 분포 분석결과 분변과 퇴비를 비교했을 때 모두 퇴비보다 분변에서 높은 개체수를 보였다. 이는 퇴비화 과정에서의 온도 관련 살균효과에 기인한 것으로 판단된다.
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