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문제 정의
- 최근에 흰민들레의 피부관련 생리활성 연구에서 여러 가지 가능성을 확인하여 보고 한 바가 있었으나 열수추출물과 그 분획물을 대상으로 한 결과로서 일반적으로 활성이 더 높다고 알려진 에탄올 추출물을 대상으로 한 추가적인 연구를 진행하였다 (Lee and Im, 2011). 본 연구에서는 흰 민들레 75% 에탄올 추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성을 비롯한 tyrosinase 저해활성과 일반 병원성 세균 및 항생제 내성균에 대한 항균 활성, 세포독성 등을 조사하여 약용 작물 유래의 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
가설 설정
- 3)Negative control : 50% methanol(solvent). 4)Gentamycin was used as a positive control.
제안 방법
- , 2000). 1㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0~500 ㎍/㎖ 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- Nitric oxide 소거능은 Marcocci 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다 (Marcocci et al., 1994). 10mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate 50 ㎕와 증류수에 일정농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합한 후 25℃에서 150분 동안 반응시켰다.
- 7 세포를 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕ 씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 그 후 1N HCl 20 ㎕을 가하여 반응을 정지 시키고 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- 그 후 1N HCl 20 ㎕을 가하여 반응을 정지 시키고 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법을 변형하여 측정하였다 (Jung et al., 1995). 0.
- 건조된 흰민들레 시료 300 g을 blender를 사용하여 마쇄한후 75% 에탄올 10 ℓ를 추출 용매로 하여 60℃에서 3시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화된 추출물 88 g (수율 29.
- 2 mM pyrogallol 20 ㎕를 가하고 25℃에서 10분간 반응시켰다. 그 후 1N HCl 20 ㎕을 가하여 반응을 정지 시키고 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕ 씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 ㎕와 200 µM DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 methanol을 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 소거능을 산출하였으며, 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 추가적으로 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였다.
- 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 ㎕와 200 µM DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 건조된 흰민들레 시료 300 g을 blender를 사용하여 마쇄한후 75% 에탄올 10 ℓ를 추출 용매로 하여 60℃에서 3시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화된 추출물 88 g (수율 29.3%)을 얻 었으며, 이 중 50 g을 증류수 1 ℓ에 분산시킨 후 동량의 hexane, chloroform (CHCl3), ethylacetate (EtOAc), butanol (BuOH)을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였는데, hexane, chloroform, ethylacetate, butanol 및 aqueous 분획의 수율은 각각 10.
- 페놀성 화합물중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다 (Moreno et al., 2000). 1㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 1㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0~500 ㎍/㎖ 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96-well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid를 0~500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물의 함량을 ㎎/ g tannic acid로 나타내었다.
- 추출물 및 분획물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay를 이용하여 측정하였다. 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 100 ㎕ 씩 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 0.5, 1, 3 ㎎이 되도록 paper disc (직경 6 ㎜)에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 흰민들레 (T. coreanum)는 2011년 5월 전라남도 영광 지역에 자생하는 것을 채집한 것으로 수세 후 50에서 건조시킨 다음 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- 세포독성 실험에 사용된 Raw 264.7 세포주는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 항균 실험에 사용된 Staphylococcus aureus (KCTC 3881), Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917)와 항생제 내성균주인 MRSA (CCARM 3696)를 nutrient agar 및 broth 배지를 사용하여 37℃의 통기적 환경에서 배양하였다.
데이터처리
- * Different superscript letters in the same concentration without gentamycin show significant differences at p < 0.05 by one-way ANOVA.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (mean ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 추출물 및 분획물의 페놀성 화합물 함량을 측정하였다. Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96-well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- SOD 유사활성 측정은 Marklund와 Marklund (1975)의 방법에 따라 pyrogallol의 생성량을 측정하여 나타내었다. 각 농도별 시료액 40 ㎕ 에 pH 8.
- 추출물 및 분획물의 세포독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다 (Shin et al., 2003). 배양된 Raw 264.
- 추출물 및 분획물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay를 이용하여 측정하였다. 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 100 ㎕ 씩 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 0.
성능/효과
- 1에 나타내었다. 100 ㎍/㎖의 시료 농도에서 추출물의 DPPH radical 소거능은 27.76%로 나타났으나 ethyl acetate 분획의경우 89.90%의 소거능을 보였으며, butanol 분획에서도 60.77%의 DPPH radical 소거능을 가지는 것으로 나타났다. 한편, hexane이나 chloroform, aqueous 분획의 경우 추출물보다 낮은 소거능을 가지는 것으로 나타났다.
- 3에 내타내었다. 100 ㎍/㎖의 시료 농도에서 추출물의 소거능은 10.04%에 불과했지만 ethyl acetate 분획과 butanol 분획, chloroform 분획의 소거능은 각각 62.45%, 49.61%, 46.13%로 나타났다. 특히 ethyl acetate 분획은 실험이 실시된 모든 농도에서 positive control로 사용된 ascorbic acid 보다 높은 NO 소거능을 보여주었다.
- 2에 나타내었다. 200 ㎍/㎖의 시료 농도에서 ethyl acetate 분획이 23.73%의 유사활성을 나타냄으로써 추출물과 분획물들 중 가장 높은 활성을 보였다. 이와 같은 SOD 유사활성은 positive control로 사용된 ascorbic acid에 비해서는 낮았지만 꾸지뽕나무 추출물이나 매자나무 수피 추출물을 대상으로 한 연구에서 보고한 SOD 유사활성 결과보다는 높은 수준임을 알 수 있었다 (Ling et al.
- 07%의 저해 활성을 보여주었다. 50%의 tyrosinase 저해 활성을 가지는데 필요한 시료 농도를 나타내는 IC50에서 positive control 로 사용된 ascorbic acid의 148.97 ㎍/㎖ 와 유사한 수준인 153.11 ㎍/㎖의 수치를 나타내 ethyl acetate 분획이 tyrosinase 의 저해제로서 작용이 강력함을 알 수 있었다. 반면 ethyl acetate와 butanol 분획을 제외한 추출물과 다른 분획들은 tyrosinase에 대해 저해 활성을 거의 나타내지 못하거나 낮은 수준의 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었으며 positive control로 사용된 ascorbic acid의 경우 농도에 따라 급격한 활성의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- 모든 균주에 대해 가장 높은 항균활성을 나타낸 것은 ethyl acetate 분획이었는데 실험이 실시된 모든 농도에서 항균 활성을 보여주었으며, 항균 작용의 결과로 생성되는 저해환 역시 농도 의존적인 증가를 나타냈다. Chloroform과 butanol 분획이 일부 농도에서 항균 활성을 보였으나 ethyl acetate 분획의 활성보다 현저히 낮은 수준이었다. 또한 실험이 실시된 모든 균주 및 농도 조건에서 추출물과 hexane 및 aqueous 분획은 항균 활성을 전혀 나타내지 못했다.
- 한편, hexane이나 chloroform, aqueous 분획의 경우 추출물보다 낮은 소거능을 가지는 것으로 나타났다. Table 2에 나타낸 바와 같이 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료 농도를 나타내는 SC50에서 추출물과 hexane, chloroform 및 aqueous 분획은 실험이 실시된 농도 범위에서 산출할 수 없을 정도로 낮은 소거능을 가진 것으로 나타났으나 ethyl acetate와 butanol 분획은 각각 38.40 ㎍/㎖와 82.28 ㎍/㎖의 SC50을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 DPPH radical 소거능은 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50인 14.
- 90 ㎎/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. 또한 butanol 분획의 polyphenol과 flavonoid 함량이 각각 223.81 ㎎/g과 56.83 ㎎/g으로 나타나 ethyl acetate 분획 다음으로 높은 함량을 가지는 분획으로 나타났다. 한편, hexane 분획이나 aqueous 분획의 경우 활성을 나타낼수 있는 polyphenol과 flavonoid 함량이 추출물의 함량보다 현저히 낮아 생리활성이 낮을 것으로 추측되었다.
- 4에 나타내었다. 모든 균주에 대해 가장 높은 항균활성을 나타낸 것은 ethyl acetate 분획이었는데 실험이 실시된 모든 농도에서 항균 활성을 보여주었으며, 항균 작용의 결과로 생성되는 저해환 역시 농도 의존적인 증가를 나타냈다. Chloroform과 butanol 분획이 일부 농도에서 항균 활성을 보였으나 ethyl acetate 분획의 활성보다 현저히 낮은 수준이었다.
- 11 ㎍/㎖의 수치를 나타내 ethyl acetate 분획이 tyrosinase 의 저해제로서 작용이 강력함을 알 수 있었다. 반면 ethyl acetate와 butanol 분획을 제외한 추출물과 다른 분획들은 tyrosinase에 대해 저해 활성을 거의 나타내지 못하거나 낮은 수준의 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었으며 positive control로 사용된 ascorbic acid의 경우 농도에 따라 급격한 활성의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실험이 실시된 가장 낮은 농도에서는 ascorbic acid의 활성보다 ethyl acetate와 butanol 분획의 저해활성이 통계적으로도 유의한 수준으로 높게 나타난 것을 볼 수 있는데, 이는 낮은 농도를 적용하는 단계에서 ascorbic acid와 같은 단일 물질과는 다르게 여러 성분이 복합적으로 혼재되어 있는 분획물이나 추출물이 생리활성 측면에서 유리하게 작용할 수 있음을 시사하는 결과라고 판단된다.
- , 2010). 분 획물 중에서는 ethyl acetate 분획에서 polyphenol과 flavonoid 함량이 각각 427.81 ㎎/g과 148.90 ㎎/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. 또한 butanol 분획의 polyphenol과 flavonoid 함량이 각각 223.
- 3%)을 얻 었으며, 이 중 50 g을 증류수 1 ℓ에 분산시킨 후 동량의 hexane, chloroform (CHCl3), ethylacetate (EtOAc), butanol (BuOH)을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였는데, hexane, chloroform, ethylacetate, butanol 및 aqueous 분획의 수율은 각각 10.54%, 2.29%, 1.62%, 10.37% 및 75.18%로 나타났다.
- 흰민들레 75% 에탄올 추출물과 분획물의 tyrosinase 저해 활성을 Table 3에 나타내었다. 실험이 실시된 모든 농도에서 ethyl acetate 분획의 저해 활성이 가장 높게 나타났는데, 500 ㎍/㎖ 농도에서는 97.07%의 저해 활성을 보여주었다. 50%의 tyrosinase 저해 활성을 가지는데 필요한 시료 농도를 나타내는 IC50에서 positive control 로 사용된 ascorbic acid의 148.
- 이상의 결과로부터 국내에 자생하고 있으며 쉽게 재배할 수있는 것으로 알려진 흰민들레의 75% 에탄올 추출물과 용매별 분획물 중 ethyl acetate 분획이 높은 polyphenol 및 flavonoid 함량을 바탕으로 하여 항산화 및 항균 활성, tyrosinase 저해 활성 등에서 우수한 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 자료를 바탕으로 추가적인 연구를 실시한다면 흰민들레 추출물 및 분획물이 관련 분야의 기능성 소재 개발에 유용한 자원으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 28 ㎍/㎖의 SC50을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 DPPH radical 소거능은 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50인 14.02㎍/㎖를 100.00%로 하여 환산한 relative activity에서 각각 36.51%와 17.4%에 해당하는 항산화 활성을 보이는 것으로 평가할 수 있었다.
- 5에 나타내었다. 전반 적으로 100% 전후의 양호한 세포생존율을 보였으나 실험이 실시된 가장 높은 농도인 500 ㎍/㎖에서 chloroform 분획과 ethyl acetate 분획의 세포생존율이 다소 낮은 수준인 60.04%와 82.60%로 나타났다. 그러나 그보다 낮은 농도 조건에서는모든 시료에서 96.
- 13%로 나타났다. 특히 ethyl acetate 분획은 실험이 실시된 모든 농도에서 positive control로 사용된 ascorbic acid 보다 높은 NO 소거능을 보여주었다.
- 반면 ethyl acetate와 butanol 분획을 제외한 추출물과 다른 분획들은 tyrosinase에 대해 저해 활성을 거의 나타내지 못하거나 낮은 수준의 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었으며 positive control로 사용된 ascorbic acid의 경우 농도에 따라 급격한 활성의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실험이 실시된 가장 낮은 농도에서는 ascorbic acid의 활성보다 ethyl acetate와 butanol 분획의 저해활성이 통계적으로도 유의한 수준으로 높게 나타난 것을 볼 수 있는데, 이는 낮은 농도를 적용하는 단계에서 ascorbic acid와 같은 단일 물질과는 다르게 여러 성분이 복합적으로 혼재되어 있는 분획물이나 추출물이 생리활성 측면에서 유리하게 작용할 수 있음을 시사하는 결과라고 판단된다. 한편, tyrosinase 저해 활성 결과는 DPPH radical 소거능이나 SOD 유사활성 등의 결과와도 비슷한 양상임을 알 수 있는데, Table 1에 나타난 polyphenol이나 flavonoid 함량의 차이가 다양한 생리 활성에도 영향을 준 결과라고 판단된다.
- 또한 실험이 실시된 모든 균주 및 농도 조건에서 추출물과 hexane 및 aqueous 분획은 항균 활성을 전혀 나타내지 못했다. 한편, ethyl acetate 분획이 항생제 내성균주인 MRSA에 대해 positive control 사용된 gentamycin과 비교해서 통계적으로 유의한 정도로 높은 수준의 항균 활성을 나타낸 것은 천연물 유래 항생제 개발과 관련해서 주목할 만한 것으로 판단되었다.
- 83 ㎎/g으로 나타나 ethyl acetate 분획 다음으로 높은 함량을 가지는 분획으로 나타났다. 한편, hexane 분획이나 aqueous 분획의 경우 활성을 나타낼수 있는 polyphenol과 flavonoid 함량이 추출물의 함량보다 현저히 낮아 생리활성이 낮을 것으로 추측되었다.
- 77%의 DPPH radical 소거능을 가지는 것으로 나타났다. 한편, hexane이나 chloroform, aqueous 분획의 경우 추출물보다 낮은 소거능을 가지는 것으로 나타났다. Table 2에 나타낸 바와 같이 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료 농도를 나타내는 SC50에서 추출물과 hexane, chloroform 및 aqueous 분획은 실험이 실시된 농도 범위에서 산출할 수 없을 정도로 낮은 소거능을 가진 것으로 나타났으나 ethyl acetate와 butanol 분획은 각각 38.
후속연구
- 이상의 결과로부터 국내에 자생하고 있으며 쉽게 재배할 수있는 것으로 알려진 흰민들레의 75% 에탄올 추출물과 용매별 분획물 중 ethyl acetate 분획이 높은 polyphenol 및 flavonoid 함량을 바탕으로 하여 항산화 및 항균 활성, tyrosinase 저해 활성 등에서 우수한 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 자료를 바탕으로 추가적인 연구를 실시한다면 흰민들레 추출물 및 분획물이 관련 분야의 기능성 소재 개발에 유용한 자원으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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