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문제 정의
- 본 연구에서 분리된 nonylphenol 분해 컨소시엄 균주 SW-3의 nonylphenol 분해활성과 생육도와 관계를 조사하기 위하여 100 ppm의 nonylphenol이 첨가된 YNB 배지에서 배양시간의 경과에 따른 균의 생육도와 nonylphenol 분해활성을 조사하였다. Fig.
- , 2005; Shi and Bending, 2007). 이에 본 연구는 수생 환경에 상재하고 있는 수생 미생물을 이용하여 nonylphenol을 환경 친화적 방법으로 처리할 수 있는 생물학적 처리 기술을 개발하기 위하여 먼저 nonylphenol 분해 미생물 균주 탐색을 실시하고 이 균주들을 이용한 nonylphenol 분해 능력을 확인하고 그 특성에 대하여 알아보기 위하여 연구를 진행하였다.
- , 2007). 이에 본 연구에서는 수생환경 중에서 nonylphenol을 분해할 수 있는 미생물을 분리하기 위하여 nonylphenol가 상대적으로 많이 배출 될 것으로 예상되는 도심 하천을 중심으로 시료를 채취하고(Cho et al., 2004) 집식 배양을 통하여 nonylphenol 분해활성을 나타내는 컨소시엄 균주의 선발을 시도하였다. 본 연구에서는 27주의 컨소시엄 균주를 분리하였으며 이 중 가장 뛰어난 nonylphenol 분해능을 보인 SW-3을 nonylphenol bioremediation을 위한 균주로 최종 선발하고 이 후 연구를 진행하였다(Table 2).
제안 방법
- 45 μm Omnipore Membrane Filter(ADVANTEC, Japan)로 여과하여 그 필터를 nonylphenol 100 ppm이 포함된 100 mL YNB 배지에 넣고 25℃에서 진탕 배양하였으며, 저질의 경우 시료 10 g에 희석수 90 mL를 가하여 혼합한 후, 거즈로 여과하여 nonylphenol 100 ppm이 포함된 YNB 배지 200 mL에 넣고 25℃, 150 rpm의 조건으로 진탕 배양하였다. 3 차례 계대를 거치며 집식 배양을 하여 nonylphenol을 효과적으로 분해할 수 있는 미생물들을 우점화하고 이중에서 가장 뛰어난 분해 효과를 나타낸 배양액으로부터 nonylphenol 분해 컨소시엄을 분리하였고, 이후 선발된 컨소시엄으로부터 nonylphenol 분해 단일 균주 분리를 시도하였다. Nonylphenol 분해 단일 균주는 100 ppm의 endosulfan을 첨가한 YNB 한천배지(상기 YNB배지에 1.
- DNA 추출을 위해 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit(iNtRON, Korea)를 사용하였고, 16S rDNA를 증폭하기 위하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 반응에 27F(5'-GTTTGGATCCTGGCTC AG3'), 492R(5'-AAGGAGGGGATCCAGCC-3') primer(Takara, Japan)를 사용하였다.
- Nonylphenol 분해 균주에 의한 nonylphenol 분해활성과 생육도의 관계를 알아 보기 위하여 분리한 컨소시엄 균주 및 컨소시엄 균주에서 분리한 단일 균주들의 생육도를 측정하였다. 균의 생육도는 100 ppm nonylphenol이 첨가된YNB 배지에 전 배양액 1%를 접종한 후 25℃에서 150 rpm으로 진탕 배양 하면서 배양액을 5일 간격으로 취하여 흡광도의 변화를 600 nm에서 측정하였다.
- Nonylphenol 분해 단일 균주는 100 ppm의 endosulfan을 첨가한 YNB 한천배지(상기 YNB배지에 1.5% 한천을 가한 배지)에 선발된 컨소시엄 배양액 100 μL씩 도말하여 단일 균주를 분리하였다.
- 3). Nonylphenol 분해활성은 컨소시엄 균주의 분해활성과 마찬가지로 배지 중의 nonylphenol 잔류량으로 판단하였다. 단일 균주의 배양기간은 컨소시엄 균주 SW-3의 nonylphenol 분해 활성이 가장 활발한 것으로 조사되었던 배양 15일차를 기준으로 7일 간격으로 단일 균주에 의한 nonylphenol 분해활성을 조사하였다.
- Nonylphenol을 단일 탄소원으로 첨가한 배지에서 집식 배양을 통해 분리된 균주들 중에서, nonylphenol 분해력이 우수한 분리균을 광학현미경과 주사전자현미경(Hitachi S-2400 scanning electron microscope ; Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)을 이용하여 형태학적 특징을 확인하였으며, 분리균의 생화학적 특성은 그람 염색 후 그 결과에 따라 VITEK Gram Negative Identification card(GNI+)를 이용하여 균 동정을 실시하였다. 또한, 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 각 균주를 동정하였다.
- Nonylphenol을 효과적으로 분해하는 컨소시엄 균주 SW-3에서 순수 분리된 4 종의 단일 균주의 nonylphenol 분해능을 측정하였다(Fig. 3). Nonylphenol 분해활성은 컨소시엄 균주의 분해활성과 마찬가지로 배지 중의 nonylphenol 잔류량으로 판단하였다.
- 이를 52℃에서 2 분간 annealing 한 후 72℃에서 2분간 polymerization 시키고, 다시 94℃에서 2분, 52℃에서 2분, 72℃에서 2분의 cycle을 20회 반복하여 시행하였다. PCR 산물의 염기서열의 결정은 SolGent(Korea)에 의뢰하여 실시하였다. 염기서열 상동성 분석은 미국국립생물정보센터 Data base를 이용하였다(http://www.
- 균을 배양한 후 배양액에 잔존하는 nonylphenol의 생물학적 분해도는 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석하였다(Fujii et al., 2000). HPLC 분석을 위해 실시한 추출방법은 다음과 같다.
- Nonylphenol 분해활성은 컨소시엄 균주의 분해활성과 마찬가지로 배지 중의 nonylphenol 잔류량으로 판단하였다. 단일 균주의 배양기간은 컨소시엄 균주 SW-3의 nonylphenol 분해 활성이 가장 활발한 것으로 조사되었던 배양 15일차를 기준으로 7일 간격으로 단일 균주에 의한 nonylphenol 분해활성을 조사하였다.
- , Tokyo, Japan)을 이용하여 형태학적 특징을 확인하였으며, 분리균의 생화학적 특성은 그람 염색 후 그 결과에 따라 VITEK Gram Negative Identification card(GNI+)를 이용하여 균 동정을 실시하였다. 또한, 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 각 균주를 동정하였다.
- , 그리고 SW-3-D는 Raoultella sp.로 동정하고 각 분리균들의 nonylphenol 분해 특성을 조사하였다.
- 분리 균주들의 그람 염색결과에 따라 BioMerieux Vitek Gram negative identification card(GNI+)를 사용하여 실시한 생화학적 특성은 Table 3에 나타내었다. 보다 정확히 분리 균주의 동정을 위하여 PCR을 이용하여 각 분리 균주들의 16S rDNA를 증폭하여 염기서열 상동성 분석을 실시하였다. 상동성을 조사한 결과, SW-3-A는 Klebsiella sp.
- , 2004) 집식 배양을 통하여 nonylphenol 분해활성을 나타내는 컨소시엄 균주의 선발을 시도하였다. 본 연구에서는 27주의 컨소시엄 균주를 분리하였으며 이 중 가장 뛰어난 nonylphenol 분해능을 보인 SW-3을 nonylphenol bioremediation을 위한 균주로 최종 선발하고 이 후 연구를 진행하였다(Table 2).
- 수생환경에서 분리한 nonylphenol 분해 미생물 컨소시엄 균주로부터 nonylphenol 분해 단일 균주의 분리를 위하여 집식 배양을 통하여 선발된 컨소시엄 균주 SW-3을 탄소원으로 nonylphenol만을 함유한 고체평판배지에 도말하여 25℃에서 2주간 배양하였다. 고체 평판배지에서 다수의 독립 콜로니가 생성 되었으며 이중 배지상에서 확연히 다른 배양학적 특성을 나타내는 4종의 독립 콜로니를 획득하였다(결과 미제시).
- 추출한 샘플을 0.2 μm filter(DISMIC-25AS, ADVANTEC, Japan)로 여과한 후, HPLC(Flexar HPLC System, PerkinElmer, USA)로 분석하였다.
대상 데이터
- Nonylphenol 분해 균주의 분리를 위해 2010년 5월에 부산 소재 인근의 유속이 느리고 수생식물의 분포가 다양한 하천 및 저류지에서 하수, 저질 시료 및 수생식물의 뿌리를 채취하였다.
- 수생환경에서 분리한 nonylphenol 분해 미생물 컨소시엄 균주로부터 nonylphenol 분해 단일 균주의 분리를 위하여 집식 배양을 통하여 선발된 컨소시엄 균주 SW-3을 탄소원으로 nonylphenol만을 함유한 고체평판배지에 도말하여 25℃에서 2주간 배양하였다. 고체 평판배지에서 다수의 독립 콜로니가 생성 되었으며 이중 배지상에서 확연히 다른 배양학적 특성을 나타내는 4종의 독립 콜로니를 획득하였다(결과 미제시).
- 본 연구에 사용한 nonylphenol(Assay >85%)은 Fluka 사(USA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외에 시험에 사용된 시약은 분석용의 특급시약을 구매하여 사용하였다.
- 0 mL/min의 속도로 분석하였고, UV 검출기로 277 nm에서 검출하였다. 분석 시 사용한 용매는 모두 HPLC급을 사용하였다. Nonylphenol의 잔존량은 nonylphenol peak의 감소된 값을 백분율로 환산하여 나타내었다.
- PCR 산물의 염기서열의 결정은 SolGent(Korea)에 의뢰하여 실시하였다. 염기서열 상동성 분석은 미국국립생물정보센터 Data base를 이용하였다(http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/).
이론/모형
- Nonylphenol 분해 능력이 우수한 균을 선발하기 위해 Fujii et al. (2000, 2001)와 Corvini et al. (2004)의 방법을 참고하여 YNB(yeast nitrogen base without amino acids; Difco, USA) 배지를 사용하여 집식 배양을 실시하였다. 시료의 배양은 하수 시료 1,000 mL을 0.
- 분리균의 16S rDNA 염기서열 분석을 위하여 분리균의 chromosomal DNA 추출을 Berns and Thomas (1965)가 기술한 일반적인 방법에 따라 시행하였다. DNA 추출을 위해 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit(iNtRON, Korea)를 사용하였고, 16S rDNA를 증폭하기 위하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 반응에 27F(5'-GTTTGGATCCTGGCTC AG3'), 492R(5'-AAGGAGGGGATCCAGCC-3') primer(Takara, Japan)를 사용하였다.
성능/효과
- EP17와 99%, SW-3-C는 Achromobacter sp. EP17와 100%, 그리고 SW-3-D는Raoultella ornithinolytica strain NB1과 99%로 가장 높은 상동성을 나타내었다(Table 4). 이상의 분리균들의 형태학적 및 생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 분석 결과를 종합하여 분리균 SW-3-A는 Klebsiella sp.
- Nonylphenol을 효과적으로 분해하는 컨소시엄 균주 SW-3에서 순수 분리된 4 종의 단일 균주(SW-3-A, B, C 및 D)를 그람염색을 통한 세균학적 특징과 현미경을 사용한 형태학적 특징을 확인한 결과 분리 균주 4종 모두 그람 음성으로 확인되었으며(결과 미제시), 그람 염색 및 주사전자 현미경을 이용한 분석 결과 SW-3-A와 SW-3-D는 간균(桿菌), SW-3-B와 SW-3-C는 단간균(短桿菌)으로 조사되었다(Fig. 2)
- , 2005), Sphingomonas sp. TTNP3 균주가 25일 간의 배양 후에 80% 이상(Corvini et al., 2004) 그리고 수생환경에서 분리한 미생물 컨소시엄 균주가 45일간의 배양 후에 약 70%의 nonylphenol 분해 활성을 나타낸다는 보고(Fujii et al., 2000) 등으로 볼 때, 본 연구에서 분리한 nonylphenol 분해 컨소시엄 균주 SW-3는 뛰어난 nonylphenol 분해활성을 가지는 것으로 판단된다.
- 그 결과, 분리된 단일 균주에 의한 nonyphenol의 분해능은, 4종의 균주가 배양 1주차에 약 40-45% 정도의 분해율을 보였고(Fig. 3), 배양 2주차에는 SW-3-A는 60%, SW-3-D는 약 70%의 분해활성을 나타내었다. 반면 SW-3-B와 SW-3-C 균주는 nonylphenol 분해율이 55% 정도를 보여 상대적으로 낮은 분해활성이 관찰 되었다(Fig.
- 3). 그러나, 단일 균주 모두 nonylphenol분해효과는 컨소시엄 균주 SW-3의 분해활성에는 못 미치는 결과가 나타났다. 이러한 결과는 nonylphenol을 효과적으로 분해하는 consortium A에서 분리한 단일 균주들의 분해활성이 컨소시엄 균주보다도 떨어진다는 Gioia et al.
- 1). 그리고, 균의 생육속도 감소와 더불어 nonylphenol의 분해속도도 서서히 감소되었지만, 배양 40일 후에는 완전히 분해 되었다. 본 연구 결과와 마찬가지로 nonylphenol 분해 균주인 Sphingomonas sp.
- 선발된 컨소시엄 균주 SW-3은 도심하천의 저질에서 채취한 시료에서 분리된 컨소시엄 균주로 HPLC를 이용한 nonylphenol의 잔류량 분석 결과, 2주간의 배양 후에 100 ppm의 nonylphenol을 85% 이상 분해하는 것으로 나타났다(Table 2). 이러한 결과는 Sphingomonas xenophaga Bayr 균주가 2주 간의 배양 후에 90% 이상의 nonylphenol을 분해한다는 보고(Gabriel et al.
후속연구
- 향후, 미생물을 이용한 환경 친화적인 nonylphenol 분해 기술을 개발하기 위해서는 nonylphenol 분해 컨소시엄 균주 SW-3로부터 추가적으로 nonylphenol 분해력이 높은 단일 균주들의 탐색과 이들 분해 균주들 간의 다양한 조합을 통한 최적의 균주조성을 찾아내어 우수한 분해 활성을 가지고 있는 종균제 개발과 nonylphenol 분해 기작에 대한 연구도 필요할 것으로 판단된다.
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