포도주에서 분리한 Saccharomyces cerevisiae JS59가 생성하는 Invertase의 정제 및 특성 Purification and Characterization of an Invertase Produced with Saccharomyces cerevisiae JS59 Isolated from Home-made Wine원문보기
전화당(invert sugar)을 생산하기 위하여 포도주로부터 분리한 효모가 생산하는 invertase의 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 포도주로부터 분리한 효모는 지방산 분석을 통하여 Saccharomyces cerevisiae JS59로 잠정 동정되었다. 본 균주가 생성하는 invertase를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-200 column chromatography 법으로 정제하였을 때 단일성을 보였으며, specific activity가 7620.9 unit/mg, 최종 회수율은 13.9로 약 14배 정제된 효소를 얻었다. 본 효소의 $K_m$ 값은 11.5 mM이었다. SDS-PAGE로부터 분자량은 38.5 kDa으로 나타났다. 정제된 invertase의 최적 pH는 5였고, pH 4에서도 94%의 높은 효소활성을 나타냈으며 4에서 6까지의 pH영역에서 안정하였고, $55^{\circ}C$에서 최적 활성을 나타내었으며 $50^{\circ}C$까지는 안정하였다. $Ag^{2+}$와 $Hg^{2+}$에 의해서 저해를 받았고, $Co^{2+}$, $Mn^{2+}$에 의해서는 효소활성이 증가되었으며, 기질과 효소 반응물을 thin layer chromatography로 분석한 결과, 본 효소는 기질인 sucrose를 완전히 분해하여 환원당을 생성함이 확인되었다.
전화당(invert sugar)을 생산하기 위하여 포도주로부터 분리한 효모가 생산하는 invertase의 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 포도주로부터 분리한 효모는 지방산 분석을 통하여 Saccharomyces cerevisiae JS59로 잠정 동정되었다. 본 균주가 생성하는 invertase를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-200 column chromatography 법으로 정제하였을 때 단일성을 보였으며, specific activity가 7620.9 unit/mg, 최종 회수율은 13.9로 약 14배 정제된 효소를 얻었다. 본 효소의 $K_m$ 값은 11.5 mM이었다. SDS-PAGE로부터 분자량은 38.5 kDa으로 나타났다. 정제된 invertase의 최적 pH는 5였고, pH 4에서도 94%의 높은 효소활성을 나타냈으며 4에서 6까지의 pH영역에서 안정하였고, $55^{\circ}C$에서 최적 활성을 나타내었으며 $50^{\circ}C$까지는 안정하였다. $Ag^{2+}$와 $Hg^{2+}$에 의해서 저해를 받았고, $Co^{2+}$, $Mn^{2+}$에 의해서는 효소활성이 증가되었으며, 기질과 효소 반응물을 thin layer chromatography로 분석한 결과, 본 효소는 기질인 sucrose를 완전히 분해하여 환원당을 생성함이 확인되었다.
The microorganism producing an invertase (E.C. 3.2.1.26) was isolated from wine and tentatively identified as Saccharomyces cerevisiae by cellular fatty acid analysis. The invertase was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitant, dialysis, ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-...
The microorganism producing an invertase (E.C. 3.2.1.26) was isolated from wine and tentatively identified as Saccharomyces cerevisiae by cellular fatty acid analysis. The invertase was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitant, dialysis, ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-50, and gel chromatography on Sephadex G-200 from the culture supernatant of Saccharomyces cerevisiae JS59. The specific activity and the purification fold of the purified invertase were 7620.9 unit/mg protein and 13.9, respectively. The molecular weight of the purified invertase was estimated to be 38.5 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH and temperature for the invertase activity were pH 5 and $55^{\circ}C$, respectively. The invertase activity was relatively stable at pH 4~6 and temperature $55^{\circ}C$. The activity of invertase was inhibited by $Ag^{2+}$ and $Hg^{2+}$, but on the contrary, activated by $Co^{2+}$ and $Mn^{2+}$. Michaelis constant ($K_m$) for invertase reaction in sucrose solution was 11.5 mM. TLC analysis of the products produced in sucrose solution during invertase reaction showed the progressive presence of glucose and fructose in accordance with sucrose hydrolysis.
The microorganism producing an invertase (E.C. 3.2.1.26) was isolated from wine and tentatively identified as Saccharomyces cerevisiae by cellular fatty acid analysis. The invertase was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitant, dialysis, ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-50, and gel chromatography on Sephadex G-200 from the culture supernatant of Saccharomyces cerevisiae JS59. The specific activity and the purification fold of the purified invertase were 7620.9 unit/mg protein and 13.9, respectively. The molecular weight of the purified invertase was estimated to be 38.5 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH and temperature for the invertase activity were pH 5 and $55^{\circ}C$, respectively. The invertase activity was relatively stable at pH 4~6 and temperature $55^{\circ}C$. The activity of invertase was inhibited by $Ag^{2+}$ and $Hg^{2+}$, but on the contrary, activated by $Co^{2+}$ and $Mn^{2+}$. Michaelis constant ($K_m$) for invertase reaction in sucrose solution was 11.5 mM. TLC analysis of the products produced in sucrose solution during invertase reaction showed the progressive presence of glucose and fructose in accordance with sucrose hydrolysis.
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문제 정의
Invertase는 미생물과 고등식물 등에 널리 분포되고 있으며 미생물을 이용하여 이들로부터의 효과적인 추출(7,8)과 정제 및 특성(9,10), 고정화(11) 및 분자생물학적 연구(12,13) 등의 분야의 연구가 비교적 활발히 진행되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 invert sugar 생산에 이용하기 위하여 가정에서 제조한 포도주로부터 Saccharomyces 속을 분리하여 이를 지방산분석을 통해 동정하고 이 효모가 생성하는 invertase를 분리, 정제하고 정제한 invertase의 여러 특성을 조사하였다.
제안 방법
AgNO3, BaCl2, CaCl2, CoCl2, CuSO4, FeSO4, HgCl2, KH2PO4, MgSO4, MnSO4, PbCl2, ZnCl2의 금속이온을 각각 2.0 mM 농도로 제조한 후 이 금속이온 용액 0.5 mL를 효소액 0.5 mL에 첨가하여(1.0 mM) 50℃에서 30분간 방치시킨 후, 잔존활성을 측정하여 invertase 활성에 미치는 금속이온의 영향을 조사하였다.
Glucose 표준곡선으로부터 측정값에 대한 glucose 양으로 계산하여 효소액 1 mL당 glucose μmol 수로 나타내었고, 1분간에 glucose 1 μmol을 생성하는 능력을 1 unit으로 하였다.
Invertase에 대한 pH의 영향을 조사하기 위해 pH 3.0은 10 mM citrate buffer, pH 4.0와 5.0는 10 mM acetate buffer, pH 6.0와 7.0은 10 mM phosphate buffer 용액에 효소액을 처리하여 invertase 활성을 측정하였으며, 또한 실온에서 각각의 pH에서 30분 동안 방치한 효소액의 invertase 활성을 측정하여 pH 안정성을 비교하였다.
Invertase에 대한 온도의 영향을 조사하기 위하여 25℃부터 60℃까지 5℃ 간격으로 invertase 활성을 측정하였고, 또한 각각의 온도에서 효소를 30분간 방치 후 55℃에서 10분간 반응시켜 invertase 활성을 측정하여 온도 안정성을 비교하였다.
반응용액 5 μL를 pre-coated Kiesel 60 silica plate(Merck AG, Darmstadt, Germany)(20×10 cm)에 점적한 후, n-butanol : acetic acid : ethyl ether : 증류수를 9:6:3:1의 비율로 혼합한 전개용매로 실온에서 2시간 전개시켰다. Plate를 완전히 건조시킨 후 발색제(H2SO4/phenol/ethanol, 5:3:92, v/w/v)를 뿌리고 110℃에서 15분 이상 발색시켜 표준물질과 비교하여 그 반응산물을 확인하였다.
Sucrose 3%, polypepton 0.5%, KH2PO4 0.5%, yeast extract 0.3%, MgSO4·7H2O 0.05%(pH 7.0)의 배지조성을 갖는 액체배지를 이용하여 분리된 효모를 1백금이 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 seed culture 1%를 같은 조성의 액체배지에 접종한 후 30℃의 shaking incubator(200 rpm)에서 48시간 배양하였으며, 배양액 1 L를 10,000×g으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취하여 조효소액으로 사용하였다.
염이 제거된 효소액을 동결건조 시킨 후, 이를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)로 다시 녹이고, 동일 buffer로 미리 평형화시킨 DEAEsephadex A-50 ion exchange column(3.0 cm×50 cm)에 주입하고, 전개 시 유속은 0.4 mL/min로 NaCl 용액(0.1～0.5 M)을 사용하여 gradient법으로 3 mL씩 분획하여 활성부위를 용출시켰다.
Saccharomyces cerevisiae JS59가 생성하는 invertase의 정제를 위하여 이 효모를 30℃에서 48시간 배양시킨 배양액을 10,000×g에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하여 crude enzyme을 얻었다. 이를 ammonium sulfate 80～100%의 농도로 침전물을 형성하고, 이 침전물을 회수하여 소량의 0.1 M phosphate buffer(pH 7.0)에 녹이고, cellulose membrane을 이용하여 24시간 동안 투석하였다. 염이 제거된 효소액을 동결건조 시킨 후, 이를 20 mM phosphate buffer(pH 7.
정제된 효소액을 이용하여 1～10 mg/mL의 기질 농도에 따른 invertase 활성을 측정하여 각 농도에서의 invertase 활성을 Lineweaver-Burke plot(18)으로 작성하였으며, 이를 이용하여 Km 값을 측정하였다.
5 mL를 혼합한 반응액을 55℃ water bath에서 10분간 반응시킨 후 생성된 환원당을 DNS법(15)으로 정량하였다. 즉 반응액 0.2 mL에 DNS 시약 0.3 mL를 가하고 끓는 물에 5분간 중탕한뒤 실온에서 식히고 증류수 10 mL로 희석하여 spectrophotometer 540 nm에서 흡광도를 조사하여 invertase 활성을 측정하였으며 이를 상대값(relative activity)로 나타내었다. Glucose 표준곡선으로부터 측정값에 대한 glucose 양으로 계산하여 효소액 1 mL당 glucose μmol 수로 나타내었고, 1분간에 glucose 1 μmol을 생성하는 능력을 1 unit으로 하였다.
추출된 시료의 fatty acid methyl esters는 capillary column(25 m×0.2 mm, phenyl methyl silicone fused silica)과 FID detector를 갖춘 gas chromatography(Agilent 6890 series, Agilent Co. Ltd., Palo Alto, CA, USA)에 의해 분석되었으며, 이의 profile은 Microbial Identification System Software(Microbial ID, Inc., Newark, DE, USA)로 동정하였다.
포도주로부터 분리된 효모의 cellular fatty acid 조성을 측정하기 위하여 Saboraud dextrose agar(Difco Co. Ltd., Detroit, MI, USA)에서 배양한 세포들을 집균 하고, 이들 세포의 지질로부터 fatty acid를 유리시키기 위해 배양균체 약 50 mg(wet weight)에 50% methanol과 15% NaOH를 첨가하여(NaOH 45 g, MeOH 150 mL, ddw 150 mL) 100℃에서 30분간 가열하여 용해시켰다. 이와 같이 지방산에 methyl ester를 형성시키고 수용상에서 유기상으로 fatty acid를 추출한 후(hexane/methyl tert-butyl ether, 1:1), 유기추출물을 수용상(NaOH 10.
효모 분리를 위해 각각의 포도주 10 g에 멸균 생리식염수 90 mL를 첨가하여 30분간 진탕시켜 10-3～10-5으로 희석한 후 sucrose 3%, polypepton 0.5%, KH2PO4 0.5%, yeast extract 0.3%, MgSO4·7H2O 0.05%, agar 1.5%(pH 7.0)로 조제한 평판 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후 콜로니를 형성시켰다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 균주는 가정에서 만든 포도주로부터 분리한 효모를 사용하였다. 효모 분리를 위해 각각의 포도주 10 g에 멸균 생리식염수 90 mL를 첨가하여 30분간 진탕시켜 10-3～10-5으로 희석한 후 sucrose 3%, polypepton 0.
0)로 조제한 평판 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후 콜로니를 형성시켰다. 이들 분리된 순수 콜로니들 중에서 invertase 활성이 높은 것으로 나타난 효모를 선별하여 사용하였다.
데이터처리
기질의 농도에 따른 효소활성과의 관계를 조사하기 위해 정제된 invertase를 이용하여 1～10 mg/mL의 기질(sucrose) 농도에 따른 효소활성을 측정하여 각 농도에서의 효소활성을 Lineweaver-Burk plot(17)으로 나타내어, Km값을 측정한 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 그 결과 Km값은 11.
이론/모형
Invertase 정제과정 중의 단백질 농도는 Lowry와 Rosebrough 법(16)에 준하여 정량하였으며, bovine serum albumin(BSA)을 표준물질로 사용하였다.
Invertase 활성 측정은 효소액 0.5 mL와 0.1 M acetate buffer(pH 5.0) 1 mL 그리고 0.2 M sucrose 용액 0.5 mL를 혼합한 반응액을 55℃ water bath에서 10분간 반응시킨 후 생성된 환원당을 DNS법(15)으로 정량하였다. 즉 반응액 0.
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE, Mini-PROTEAN®, Bio-rad Ltd., Hercules, CA, USA)는 Laemmli의 방법(17)에 따라 10% acrylamide gel을 만들어 사용하였고, size marker(Bio-rad Co. Ltd., Hercules, CA, USA)의 표준 단백질은 myosin (M.W. 211,806), β-galactosidase(M.W. 121,020), bovine serum albumin(M.W. 100,216), ovalbumin(M.W. 54,395), carbonic anhydrase(M.W. 38,708), soybean trypsin inhibitor(M.W. 29,806), lysozyme(M.W. 20,040)을 사용하여 이동도(Rf)에 대한 분자량과의 관계로부터 분자량을 산출하였다.
성능/효과
정제된 invertase의 최적 pH는 5였고, pH 4에서도 94%의 높은 효소활성을 나타냈으며 4에서 6까지의 pH영역에서 안정하였고, 55℃에서 최적 활성을 나타내었으며 50℃까지는 안정하였다. Ag2+와 Hg2+에 의해서 저해를 받았고, Co2+, Mn2+에 의해서는 효소활성이 증가되었으며, 기질과 효소 반응물을 thin layer chromatography로 분석한 결과, 본 효소는 기질인 sucrose를 완전히 분해하여 환원당을 생성함이 확인되었다.
포도주로부터 분리된 효모의 MIS(microbial identification system)를 이용한 지방산의 분석결과는 Table 1과 같다. 균체의 지방산 조성은 C10:0가 3.63%, C12:0가 2.94%, C14:0가 1.67%, C16:0가 12.71%, C16:1가 51.10%, C18:0가 1.82%, C18:1는 26.12%가 포함되었으며, C16:1와 C18:1의 함량이 가장 높았다. 이상의 실험 결과 본 실험에서 분리된 균주는 60.
0이었다고 보고하였다. 그러나 본 연구에서 S. cerevisiae JS59로부터 분리 정제한 invertase는 알칼리 영역에 비해 산성 영역에서 더 안정한 것으로 나타나 acidophilic invertase임을 확인할 수 있었다.
3). 그리고 정제된 invertase의 분자량을 결정하기 위해 SDS-PAGE 상에 나타난 표준단백질의 상대이동거리(Rf 값)를 측정하여 이동도와 표준단백질의 분자량과의 관계식을 이용하여 분자량을 산출한 결과 본 연구에서 정제한 invertase는 Fig. 4에서와 같이 M.W. 38,500으로 나타났다.
1과 같다. 그림에서와 같이 NaCl의 농도를 0.1～0.5 M linear gradient하게 하였을 때 단백질 peak가 나타난 곳 중 효소활성이 높은 fraction No. 39～44를 모아 동결건조를 통해 농축시킨 후, 동일 buffer로 미리 평형화시킨 Sephadex G-200 gel filtration column에 주입하여 fraction을 받은 결과를 Fig. 2에 나타내었으며, 최종적으로 단일 단백질 peak를 확인할 수 있었으며, 단백질 peak와 활성이 가장 높은 fraction No. 33～37을 모아 SDSPAGE를 통해 단일성을 확인하였다. 이상의 정제과정에 따른 invertase의 정제결과를 Table 2에 나타내었다.
금속 이온 중 Ag2+, Hg2+, Cu2+, Zn2+의 농도가 각각 1.0 mM 이 되도록 첨가하여 효소활성을 측정하였을 때, 각각 0%, 0%, 42%, 53%로 나타나 효소활성이 감소하였으며, Co2+, Mn2+에 의해서는 효소의 활성이 50% 가량 촉진되었다. 그밖에 다른 금속이온들에 의해서는 효소의 활성이 큰 영향을 받지는 않았다.
0에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, pH 4에서는 최대효소활성의 94%의 효소활성이었고, pH 6에서는 65%의 효소활성을 나타내었다. 또한 pH 3과 7에서는 각각 2%와 4%의 상대 효소활성을 보여 pH 4.0과 5.0 약산성 부근에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 Hong과 Lee(27)가 Aspergillus niger가 생산하는 invertase의 정제와 특성에서 정제된 효소의 최적 pH가 5.
9 unit/mg protein을 나타내어 정제단계가 진행되면서 specific activity가 증가하였다. 또한 정제 단계에 따른 정제 배수는 최종적으로 13.9배를 보였으며, 회수율은 13.8%를 나타냈다.
또한 정제한 invertase의 단일성 및 분자량 측정을 위하여 각 정제 단계에서 높은 invertase 활성을 나타낸 fraction들을 모아서 SDS-PAGE를 한 결과 각 정제단계에서 불순 단백질의 band가 제거되며 major band는 농축되어 Sephadex G-200의 fraction은 molecular weight 37,000～38,000 부근에서 공통된 단일 band를 확인함으로써 각 정제단계별 동일 효소가 정제되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 그리고 정제된 invertase의 분자량을 결정하기 위해 SDS-PAGE 상에 나타난 표준단백질의 상대이동거리(Rf 값)를 측정하여 이동도와 표준단백질의 분자량과의 관계식을 이용하여 분자량을 산출한 결과 본 연구에서 정제한 invertase는 Fig.
포도주로부터 분리한 효모는 지방산 분석을 통하여 Saccharomyces cerevisiae JS59로 잠정 동정되었다. 본 균주가 생성하는 invertase를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-200 column chromatography 법으로 정제하였을 때 단일성을 보였으며, specif activity가 7620.9 unit/mg, 최종 회수율은 13.9로 약 14배 정제된 효소를 얻었다. 본 효소의 Km 값은 11.
12%가 포함되었으며, C16:1와 C18:1의 함량이 가장 높았다. 이상의 실험 결과 본 실험에서 분리된 균주는 60.4%의 fatty acid homology를 보이는 Saccharomyces cerevisiae로 분류되어 잠정 동정하고 Saccharomyces cerevisiae JS59로 명명하였다.
5와 같다. 정제된 invertase는 pH 5.0에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, pH 4에서는 최대효소활성의 94%의 효소활성이었고, pH 6에서는 65%의 효소활성을 나타내었다. 또한 pH 3과 7에서는 각각 2%와 4%의 상대 효소활성을 보여 pH 4.
5 kDa으로 나타났다. 정제된 invertase의 최적 pH는 5였고, pH 4에서도 94%의 높은 효소활성을 나타냈으며 4에서 6까지의 pH영역에서 안정하였고, 55℃에서 최적 활성을 나타내었으며 50℃까지는 안정하였다. Ag2+와 Hg2+에 의해서 저해를 받았고, Co2+, Mn2+에 의해서는 효소활성이 증가되었으며, 기질과 효소 반응물을 thin layer chromatography로 분석한 결과, 본 효소는 기질인 sucrose를 완전히 분해하여 환원당을 생성함이 확인되었다.
6과 같다. 정제된 invertase의 최적 활성 온도는 55oC이었으며, 이때의 효소활성을 100으로 하였을 때 50℃에서는 87%의 효소활성을 나타내었고 이보다 낮은 온도인 30, 40℃에서는 효소활성이 각각 52%, 69%로 떨어졌으며, 최적 온도보다 높은 60℃에서는 30%로 떨어졌다. 이러한 결과는 Emel과 Sibel(32) 및 Bahar과 Tuncel(33)의 연구에서의 최적 온도 55℃와 일치하는 것으로 보아 고온성 invertase임을 추정할 수 있다.
전화당(invert sugar)을 생산하기 위하여 포도주로부터 분리한 효모가 생산하는 invertase의 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 포도주로부터 분리한 효모는 지방산 분석을 통하여 Saccharomyces cerevisiae JS59로 잠정 동정되었다. 본 균주가 생성하는 invertase를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-200 column chromatography 법으로 정제하였을 때 단일성을 보였으며, specif activity가 7620.
한편 각 pH의 효소 용액을 25℃에서 30분간 방치 후 잔존 효소활성을 측정한 pH 안정성 결과는 pH 5.0에서는 100% 잔존 활성을 나타냈으나, pH 3.0, 4.0에서의 잔존 효소활성은 각각 0%, 88%이었으며, pH 6.0, 7.0에서는 각각 64%, 4%의 잔존 효소활성을 보여, pH 4와 5에서 비교적 안정한 것으로 나타났다. Ester와 Michele(29), Sanjay와 Sugunan(30)은 invertase의 pH 안정성 범위가 pH 4.
한편 각 온도에서 30분간 방치 후 온도 안정성을 조사한결과, 정제된 invertase를 50℃ 이하에서 30분간 열처리했을때, 효소활성은 100%의 높은 잔존 효소활성을 나타내었으며, 55℃에서도 97%를 유지해 열에 대한 안정성을 보였으나, 60℃ 이상의 온도에서는 온도 상승과 함께 잔존 효소활성이 45% 이하로 크게 떨어졌다. 이는 온도가 높아짐에 따라 효소의 변성이 급격히 일어나 효소활성이 감소된 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
현재까지 분리된 많은 효모는 어떤 효소를 분비하고 있는가?
효모는 모든 주정발효의 주 역할을 차지하고 있고, 또한 여러 가지 중요한 효소를 생산함으로써 산업에 이용되고 있으며(2), 특히 효모는 알코올 발효능이 강한 종류가 많아, 이들은 옛날부터 주류의 양조, 알코올 제조, 제빵 등에 이용되어 왔다. 현재까지 분리된 많은 효모는 protease, amylase, lipase 등의 효소를 분비하고 있다(1). 효소는 살아있는 생물세포에서 생산되는 생물학적 반응촉매제로서 작용하는 단백성 물질로서 치즈의 응고, 맥주양조 등에 이용되며 그 산업적 이용에서 가치를 더하고 있다(3).
전화당(invert sugar)을 생산하기 위하여 포도주로부터 분리한 효모가 생산하는 invertase의 특성을 조사한 결과는 어떻게 나왔는가?
전화당(invert sugar)을 생산하기 위하여 포도주로부터 분리한 효모가 생산하는 invertase의 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 포도주로부터 분리한 효모는 지방산 분석을 통하여 Saccharomyces cerevisiae JS59로 잠정 동정되었다. 본 균주가 생성하는 invertase를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-200 column chromatography 법으로 정제하였을 때 단일성을 보였으며, specif activity가 7620.9 unit/mg, 최종 회수율은 13.9로 약 14배 정제된 효소를 얻었다. 본 효소의 Km 값은 11.5 mM이었다. SDS-PAGE로부터 분자량은 38.5 kDa으로 나타났다. 정제된 invertase의 최적 pH는 5였고, pH 4에서도 94%의 높은 효소활성을 나타냈으며 4에서 6까지의 pH영역에서 안정하였고, 55℃에서 최적 활성을 나타내었으며 50℃까지는 안정하였다. Ag2+와 Hg2+에 의해서 저해를 받았고, Co2+, Mn2+에 의해서는 효소활성이 증가되었으며, 기질과 효소 반응물을 thin layer chromatography로 분석한 결과, 본 효소는 기질인 sucrose를 완전히 분해하여 환원당을 생성함이 확인되었다.
효소란 무엇인가?
현재까지 분리된 많은 효모는 protease, amylase, lipase 등의 효소를 분비하고 있다(1). 효소는 살아있는 생물세포에서 생산되는 생물학적 반응촉매제로서 작용하는 단백성 물질로서 치즈의 응고, 맥주양조 등에 이용되며 그 산업적 이용에서 가치를 더하고 있다(3). Invertase는 sucrose의 β-D-fructo furanoside 결합을 가수분해하여 fructose와 glucose를 생성하고 raffinose를 분해하여 fructose와 melibiose를 생성할 뿐만 아니라 fructotransferase 반응을 촉매 하는 기능을 가진 효소로서 특히 sucrose로부터 invert sugar를 생성하므로 식품 공업에서 감미료 제조에 유용하게 이용되고 있다(4).
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