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문제 정의
- 본 연구에서는 생약제제의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 방제학에서 補氣의 기본 처방으로 사용되는 사군자탕을 선정하여 HPLC-PDA를 이용하여 정량법의 확립과 분석법에 대한 validation을 실시하였다.
제안 방법
- 분석법 Validation − 확립된 동시분석법에 대하여 직선성 (linearity), 범위 (range), 검출한계 (LOD), 정량한계 (LOQ), 재현성 (repeatability), 회수율 (recovery) 및 정밀성 (precision) 등을 판단하여 분석방법을 검증하였다.
- HPLC 분석조건 − 사군자탕 내 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin의 함량을 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC20A 시스템을 사용하여 측정하였다.
- 검액의 조제 − 사군자탕의 구성한약재를 Table I과 같이 무게 비율로 배합하여 약탕기 (Cosmos 660, Inchon, Korea)에 넣고, 물을 시료의 10배로 첨가하여 100°C에서 2시간 전탕한 후 농축 및 동결건조 하여 22.3%의 수율로 추출물을 얻었다.
- Liquiritin과 glycyrrhizin의 검량선은 2.34~300.00 ug/mL 및 3.91~500.00 ug/mL로 피크 면적에 대하여 각각 작성하였으며, 상관계수 r2를 구하여 양호한 직선성을 나타내는지 확인하였다. 검출한계와 정량한계는 신호 (Signal, S) 대 잡음 (Noise, N)의 비를 이용하여 각각 3과 10을 기준으로 정하였다.
- 피크면적과 머무름 시간의 재현성은 표준용액을 가지고 시간의 변화에 따른 기계의 변화정도를 보기 위하여 6회 주입하여 면적과 머무름 시간의 재현성을 확인하였다.
- 정확성 평가를 위한 회수율 시험은 사군자탕 시료에 측정하고자 하는 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin의 일정 농도 (저, 중 및 고농도)를 첨가한 후 분석을 통해 첨가된 주요성분의 양을 확인하였다. 즉, 동결건조 된 사군자탕 200 mg을 정확하게 측정 한 후 주요성분인 liquiritin의 최종 농도 16, 40, 80 ug/mL과 glycyrrhizin의 최종 농도 20, 50, 100 ug/mL가 되도록 첨가하여 검액의 조제 방법과 동일하게 전처리하여 분석하였다.
- 분석조건의 확립 − 사군자탕의 구성 약재 중 감초의 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin을 분석 대상으로 1.0% acetic acid가 함유된 water와 1.0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다.
- 정확성 평가를 위한 회수율 시험은 사군자탕 시료에 측정하고자 하는 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin의 일정 농도 (저, 중 및 고농도)를 첨가한 후 분석을 통해 첨가된 주요성분의 양을 확인하였다. 즉, 동결건조 된 사군자탕 200 mg을 정확하게 측정 한 후 주요성분인 liquiritin의 최종 농도 16, 40, 80 ug/mL과 glycyrrhizin의 최종 농도 20, 50, 100 ug/mL가 되도록 첨가하여 검액의 조제 방법과 동일하게 전처리하여 분석하였다. 회수율은 다음과 같은 식에 의해 계산하였다.
- 확립된 분석법의 정밀성은 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성으로 상대표준편차 (%RSD)로 판단한다. 정밀성 평가는 일내 (intra-day)와 일간 (inter-day) 시험을 통하여 실시하였다. 각각의 실험은 3가지 농도의 혼합표준용액을 3회 반복실험을 통하여 얻은 결과의 상대표준편차를 구하여 평가하였다.
- 사군자탕을 구성하는 인삼, 백출, 복령 및 감초의 4가지 구성 약재 중 감초의 주요 성분인 liquiritin과 glycyrrhizin에 대하여 동시분석하고 직선성, 정확성 및 정밀성 등의 실험을 통하여 분석법에 대한 검증을 실시하였다. 그 결과 두 물질의 성분 함량은 liquiritin이 7.
- 사군자탕에서의 Liquiritin과 Glycyrrhizin의 함량분석 − 확립된 분석법을 이용하여 사군자탕의 감초 성분인 liquiritin 과 glycyrrhizin을 동시 분석하였다.
대상 데이터
- 실험재료 − 본 실험에 사용된 사군자탕의 구성 한약재인 인삼 (Ginseng Radix), 복령은 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서 구입하였으며, 백출 (Atractylodis Rhizoma)과 감초 (Glycyrrhizae Radix)는 (주)HMAX (Chungbuk, Korea)에서 각각 구입하였다.
- 분석에 사용 된 칼럼은 Gminin C18 (5 um, 4.6×150 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40°C로 유지하였다.
- 시약 및 기기 − 표준물질인 liquiritin과 glycyrrhizin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, 각 표준물질의 순도는 98% 이상이었다.
- (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, 각 표준물질의 순도는 98% 이상이었다. HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 특급시약으로 Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- 0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다. PDA 검출 파장은 glycyrrhizin은 254 nm, liquiritin 은 280 nm에서 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 두 성분은 11.
- 함량분석을 위한 HPLC는 LC-20A 시스템 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고, 시스템은 pump (LC20AT), on-line degasser (DGU-20A3), column oven (CTO20A), autosampler (SIL-20AC) 및 PDA detector (SPDM20A)로 구성되어 있다. 분석 data는 LCsolution software (Version 1.
데이터처리
- 정밀성 평가는 일내 (intra-day)와 일간 (inter-day) 시험을 통하여 실시하였다. 각각의 실험은 3가지 농도의 혼합표준용액을 3회 반복실험을 통하여 얻은 결과의 상대표준편차를 구하여 평가하였다.
성능/효과
- 회수율 (Recovery) − 사군자탕에 표준물질의 서로 다른 3가지 농도로 첨가한 후 측정한 회수율 시험 결과 liquiritin 은 91.85 ~ 105.52%로 나타났으며, 상대표준편차도 3.72% 이하로 나타났다.
- 재현성 (Repeatability) − Liquiritin과 glycyrrhizin 두 성분의 Peak 면적과 머무름시간 (retention time)에 대한 측정재현성은 두 성분 모두 상대표준편차 (RSD)가 1.00% 이내로 양호한 재현성을 나타내었다 (Table IV).
- 분석방법의 직선성 (Linearity), 검출한계 (LOD) 및 정량한계 (LOQ) − Liquiritin의 peak 면적에 대한 검량선은 2.34 ~ 300.00 ug/mL의 농도 범위에서 상관계수 (r2) = 0.9999의 직선성을 나타내었으며, glycyrrhizin은 3.91 ~ 500.00 ug/mL의 농도 범위에서 상관계수 (r2) = 0.9998의 양호한 직선성을 나타내었다.
- 9998의 양호한 직선성을 나타내었다. 또한 두 성분의 검출한계 (LOD)는 0.11 ug/mL과 0.14 ug/mL로 각각 나타났으며, 정량한계 (LOQ)는 0.35 ug/mL과 0.48 ug/mL로 각각 나타났다 (Table III).
- 사군자탕을 구성하는 인삼, 백출, 복령 및 감초의 4가지 구성 약재 중 감초의 주요 성분인 liquiritin과 glycyrrhizin에 대하여 동시분석하고 직선성, 정확성 및 정밀성 등의 실험을 통하여 분석법에 대한 검증을 실시하였다. 그 결과 두 물질의 성분 함량은 liquiritin이 7.94 - 8.07 mg/g, glycyrrhizin이 13.66 - 13.91 mg/g으로 함유되어 있었다.
- 정밀성 (Precision) − 직선성 범위 내에서의 일정한 3가지 농도에서 측정한 일내 (intra-day)와 일간 (inter-day) 시험 결과 일내는 0.17 ~ 3.54%의 상대표준편차를 나타내었으며, 일간은 0.07 ~ 3.09%의 상대표준편차를 나타내었다 (Table VI).
후속연구
- 이상의 결과로 설정된 분석법은 사군자탕의 정량분석에 있어서 중요한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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