Gyejibokryeong-hwan (GJBRH) has been used for treatment of patients with climacteric syndrome. In this study, an ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer (UPLC-ESI-MS) method was established for the simultaneous quantification of seven marker compounds in GJB...
Gyejibokryeong-hwan (GJBRH) has been used for treatment of patients with climacteric syndrome. In this study, an ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer (UPLC-ESI-MS) method was established for the simultaneous quantification of seven marker compounds in GJBRH extract. In addition, we assessed the antioxidant effects of GJBRH. All analytes were separated by gradient elution using two mobile phases on a UPLC BEH $C_{18}$ column and maintained at $45^{\circ}C$. The antioxidant activities of GJBRH were evaluated by measuring free radical scavenging activities on 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) and 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). The inhibitory effects on low-density lipoprotein (LDL) oxidation were evaluated by the formation of thiobarbituric acid relative substances (TBARS) and relative electrophoretic mobility (REM). Regression equations of the seven compounds were acquired with $r^2$ values ${\geq}0.9988$. The amounts of the seven compounds, amygdalin, albiflorin, paeoniflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, and paeonol in GJBRH water extract were 21.71, 2.16, 17.17, 1.97, 0.40, 0.78, and 3.42 mg/g, respectively. The GJBRH showed the radical scavenging activity in a dose-dependent manner. The concentration required for 50% reduction ($RC_{50}$) against ABTS and DPPH radicals were $54.18{\mu}g/mL$ and $79.53{\mu}g/mL$. Furthermore, GJBRH reduced the oxidation properties of LDL induced by $CuSO_4$.
Gyejibokryeong-hwan (GJBRH) has been used for treatment of patients with climacteric syndrome. In this study, an ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer (UPLC-ESI-MS) method was established for the simultaneous quantification of seven marker compounds in GJBRH extract. In addition, we assessed the antioxidant effects of GJBRH. All analytes were separated by gradient elution using two mobile phases on a UPLC BEH $C_{18}$ column and maintained at $45^{\circ}C$. The antioxidant activities of GJBRH were evaluated by measuring free radical scavenging activities on 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) and 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). The inhibitory effects on low-density lipoprotein (LDL) oxidation were evaluated by the formation of thiobarbituric acid relative substances (TBARS) and relative electrophoretic mobility (REM). Regression equations of the seven compounds were acquired with $r^2$ values ${\geq}0.9988$. The amounts of the seven compounds, amygdalin, albiflorin, paeoniflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, and paeonol in GJBRH water extract were 21.71, 2.16, 17.17, 1.97, 0.40, 0.78, and 3.42 mg/g, respectively. The GJBRH showed the radical scavenging activity in a dose-dependent manner. The concentration required for 50% reduction ($RC_{50}$) against ABTS and DPPH radicals were $54.18{\mu}g/mL$ and $79.53{\mu}g/mL$. Furthermore, GJBRH reduced the oxidation properties of LDL induced by $CuSO_4$.
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문제 정의
본 연구에서는 골반 혈관의 염증, 월경 및 하혈 등과 같은 鬱血로 인한 下服桶, 月經不順 및 月經痛 등의 부인과 질환에 널리 사용되는 대표 처방인 桂枝茯笭丸을 선정하여 이에 대한 효율적인 품질관리에 대한 기초 자료를 제공하고자 주요 성분에 대한 함량분석을 실시하였다. 본 처방의 구성 생약의 성분에 관한 연구는 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde 등과 같은 coumarin 계열16,17)과 茯笭의 pachymic acid와 dehydropachymic acid 등과 같은 triterpenoid 계열18,19)이 분리 보고되었다.
이와 같이 처방을 구성하는 각각의 생약 성분에 대하여 고성능액체크로마토그래피를 이용한 분석법21-26)은 많이 보고가 되어 있으나 복합제제인 처방의 분석에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 구성 생약의 주요 성분들, 즉 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 牧丹皮의 paeonol, 芍藥의 albiflorin과 paeoniflorin 및 桃仁의 amygdalin 등 7종의 성분을 대상으로 질량분석기가 결합된 초고성능 액체크로마토그래피(ultraperformance liquid chromatography-electrospray ionizationmass spectrometer; UPLC-ESI-MS)를 이용하여 함량분석을 실시하고 본 처방에 대한 항산화 효과와 LDL 산화 억제 효과를 통한 동맥경화질환의 예방 및 치료의 적용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
각 성분의 분리를 위한 칼럼은 UPLC BEH C18(2.1×100 mm, 1.7 µm, Waters, Milford, MA, USA) 칼럼을 이용하였으며, 칼럼 온도는 45℃를 유지하였다.
UPLC 및 LC-MS/MS 분석 조건 − 桂枝茯笭丸 내 주요 성분인 amygdalin, albiflorin, paeoniflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol의 함량분석을 위해 Waters(Milford, MA, USA)사의 질량분석기가 결합된 UPLC를 사용하여 분석 하였다.
검액의 조제 − LC-MS/MS 정량분석을 위하여 동결건조된 추출물 100 mg을 정확히 취한 후 물을 넣어 5 mL로 맞춘 후 5분간 초음파 추출하였다.
7종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기(ACQUITY TQD LC-MS/ MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 Waters MassLynx software(version 4.
0 µL였다(Table II). 또한 각 성분의 MS분석을 위해 ESI가 결합된 탠덤 사중극자 질량 분석기(ACQUITY TQD, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 양이온 모드와 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 MS 검출을 위해 capillary voltage(3.
검량선 작성 − Amygdalin, albiflorin, paeoniflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol 등 7종의 표준품에 대한 검량선은 5, 10, 50, 100 및 500 ng/mL 의 농도로 희석하여 피크 면적과 농도에 대해서 작성하였다.
TBARS 측정 − 산화 반응이 끝난 LDL 50 µg을 취하여 TBARS Assay Kit(BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 측정하였다.
ABTS 라디칼 소거능 측정 − ABTS 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS+· cation decol orization assay 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다.
USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
15 mM의 DPPH 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 DMSO를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
를 첨가함으로써 시작하였고, 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 후 thiobarbituric acid reacting substance(TBARS)의 형성과 relative electrophoretic mobility(REM)을 측정하였다.
TBARS 측정 − 산화 반응이 끝난 LDL 50 µg을 취하여 TBARS Assay Kit(BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 malondialdehyde(MDA) 표준곡선에 대입시켜 MDA 양으로 환산하였다.
桂枝茯笭丸의 구성 약재 중 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 牧丹皮의 paeonol, 芍藥의 albiflorin과 paeoniflorin 및 桃仁의 amygdalin 등 7종의 성분을 LC-MS/MS를 이용하여 동시 정량을 실시하였다. 역상 UPLC 조건에서 UPLC BEH C18 칼럼을 이용하여 모든 성분의 분리를 위해 물과 아세토나이트릴의 조건을 이용하여 ESI 방법의 양이온 모드와 음이온 모드에서 Table II와 III의 조건을 이용하여 검출하였다.
桂枝茯笭丸의 구성 약재 중 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 牧丹皮의 paeonol, 芍藥의 albiflorin과 paeoniflorin 및 桃仁의 amygdalin 등 7종의 성분을 LC-MS/MS를 이용하여 동시 정량을 실시하였다. 역상 UPLC 조건에서 UPLC BEH C18 칼럼을 이용하여 모든 성분의 분리를 위해 물과 아세토나이트릴의 조건을 이용하여 ESI 방법의 양이온 모드와 음이온 모드에서 Table II와 III의 조건을 이용하여 검출하였다. 또한 피크 꼬리 끌림 현상을 줄이고 각 성분의 이온에 대한 검출 감도를 향상시키기 위하여 0.
역상 UPLC 조건에서 UPLC BEH C18 칼럼을 이용하여 모든 성분의 분리를 위해 물과 아세토나이트릴의 조건을 이용하여 ESI 방법의 양이온 모드와 음이온 모드에서 Table II와 III의 조건을 이용하여 검출하였다. 또한 피크 꼬리 끌림 현상을 줄이고 각 성분의 이온에 대한 검출 감도를 향상시키기 위하여 0.1% 개미산을 첨가하였다. 최적의 이동상을 이용하여 기울기 용매로 분리를 실시하였으며, 칼럼온도는 45℃, 유속은 분당 0.
1% 개미산을 첨가하였다. 최적의 이동상을 이용하여 기울기 용매로 분리를 실시하였으며, 칼럼온도는 45℃, 유속은 분당 0.3 mL로 하여 모든 성분을 6분 이내로 분리하였다.
桂枝茯笭丸을 설정된 LC-MS/MS 분석법으로 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다. MS를 이용한 각 성분의 확인은 albiflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol 5종은 양이온 모드에서 m/z 480.
桂枝茯笭丸의 항산화 활성을 평가하고자 추출물을 농도 별로 조제한 후 ABTS와 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다.
LDL 산화 억제 활성을 검색하고자 Cu2+에 의해 LDL 산화를 유도하고, 추출물을 처리하여 LDL 산화 정도를 비교 분석하였다. TBARS assay 결과 桂枝茯笭丸 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 저해효과를 나타냈으며, IC50 값이 75.
桂枝茯笭丸을 구성하는 桂枝, 茯笭, 牧丹皮, 芍藥 및 桃仁의 5가지 구성 생약 중 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 牧丹皮의 paeonol, 芍藥의 albiflorin과 paeoniflorin 및 桃仁의 amygdalin 등 7종의 성분에 대하여 LC-MS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 桃仁과 芍藥의 주요 성분인 amygdalin과 paeoniflorin이 21.
桂枝茯笭丸 물 추출물 조제 − 桂枝茯笭丸을 구성하는 한약재를 Table I과 같이 같은 비율로 배합한 후 총 시료 양을 5.0 kg으로 맞춘 후 초고속진공저온추출기(Cosmos 660, Kyungseo Machine Co., Incheon, Korea)에 넣고, 물을 시료의 10배(50 L)로 첨가하여 100℃에서 2시간 전탕 한 후 표준체(No. 270, 53 µm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 이용하여 여과하였다.
또한 각 성분의 MS분석을 위해 ESI가 결합된 탠덤 사중극자 질량 분석기(ACQUITY TQD, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 양이온 모드와 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 MS 검출을 위해 capillary voltage(3.3 kV), extract voltage(3 V), source temperature(120℃), RF lens(0.3 V), desolvation temperature(300℃), desolvation gas(600 L/h), cone gas(50 L/h) 및 collision gas(0.14 mL/min) 등에 대한 조건을 설정하여 multiple reaction monitoring(MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다(Table II).
대상 데이터
실험재료 − Table I과 같이 본 실험에 사용된 桂枝茯笭丸을 구성하는 5종의 한약재는 모두 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 동국대학교 한의과대학 이제현 교수(Gyeongju, Korea)와 대전대학교 한의과대학 서영배 교수(Daejeon, Korea) 등 2인의 전문가로부터 감정 후 사용하였다.
시약 및 기기 − Amygdalin, coumarin, dimethyl sulfoxide (DMSO), 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) 및 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 SigmaAldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, albiflorin, paeoniflorin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, albiflorin, paeoniflorin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 이들 표준물질의 순도는 모두 98.
0% 이상이었다. LC-MS/MS 분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
7종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기(ACQUITY TQD LC-MS/ MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 Waters MassLynx software(version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하여 수집 및 처리하였다.
시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
데이터처리
실험결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
성능/효과
LC-MS/MS를 이용하여 농도에 따른 ESI 방법의 MRM 모드에서 amygdalin, albiflorin, paeoniflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol 7종의 성분에 대한 피크면적과 농도에 따른 검량선 작성 결과 상관 계수(r2)값이 0.99이상으로 양호한 직선성을 각각 나타내었다(Table III).
桂枝茯笭丸을 설정된 LC-MS/MS 분석법으로 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다. MS를 이용한 각 성분의 확인은 albiflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol 5종은 양이온 모드에서 m/z 480.9, 146.8, 148.9, 132.8 및 166.9의 [M+H]+ 형태의 분자이온 피크를 각각 확인하였으며, amygdalin과 paeoniflorin은 음이온 모드에서 m/z 456.1과 m/z 479.3의 [M-H]- 형태의 분자이온 피크를 확인하였다(Fig. 2). LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 amygdalin의 MRM 조건은 m/z 456.
8로 설정한 후 정량을 실시하였다. 이상과 같이 설정된 桂枝茯笭丸의 LC-MS/MS MRM 분석법에 의해 분석한 결과 amygdalin, albiflorin, paeoniflorin, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol은 1.16분, 1.34분, 1.39분, 2.15분, 2.26분, 2.53분 및 2.63분에서 각각 검출되었다(Table IV 및 Fig. 3). 함량 분석 결과 桂枝茯笭丸 추출물 중 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde의 함량이 1.
桂枝茯笭丸 추출물 25, 50, 100 및 200 µg/mL 농도에서 각각 28.13, 52.29, 87.17 및 99.72%의 라디칼 소거활성을 나타냈으며, 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(RC50)은 54.18 µg/mL로 관찰되었다.
추출물 25, 50, 100 및 200 µg/mL 농도에서 각각 18.94, 37.63, 59.34 및 82.24%의 라디칼 소거활성을 나타냈으며, RC50는 79.53 µg/mL로 관찰되었다.
桂枝茯笭丸의 항산화 활성을 평가하고자 추출물을 농도 별로 조제한 후 ABTS와 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다. 桂枝茯笭丸 추출물 25, 50, 100 및 200 µg/mL 농도에서 각각 28.
4A). DPPH 라디칼의 소거활성 또한 ABTS 라디칼의 소거활성과 유사하게 농도의존적인 증가를 나타냈다. 추출물 25, 50, 100 및 200 µg/mL 농도에서 각각 18.
TBARS assay 결과 桂枝茯笭丸 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 저해효과를 나타냈으며, IC50 값이 75.81 µg/mL으로 계산되었다(Fig. 5).
桂枝茯笭丸을 37.5, 75 및 150 µg/mL 농도로 처리하였을 때 산화 LDL의 REM이 각각 19.73, 63.34 및 73.73% 감소되었다.
桂枝茯笭丸을 구성하는 桂枝, 茯笭, 牧丹皮, 芍藥 및 桃仁의 5가지 구성 생약 중 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 牧丹皮의 paeonol, 芍藥의 albiflorin과 paeoniflorin 및 桃仁의 amygdalin 등 7종의 성분에 대하여 LC-MS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 桃仁과 芍藥의 주요 성분인 amygdalin과 paeoniflorin이 21.71 mg/g과 17.17 mg/g으로 다른 성분에 비해 많이 함유 되어 있음을 확인하였다. 또한 桂枝茯笭丸의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성은 용량이 높을수록 높은 활성을 나타내었으며, LDL 산화 억제 활성 역시 고농도로 처리할 경우 LDL의 산화정도를 나타내는 지표인 TBARS와 REM이 더 감소됨을 알 수 있었다.
17 mg/g으로 다른 성분에 비해 많이 함유 되어 있음을 확인하였다. 또한 桂枝茯笭丸의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성은 용량이 높을수록 높은 활성을 나타내었으며, LDL 산화 억제 활성 역시 고농도로 처리할 경우 LDL의 산화정도를 나타내는 지표인 TBARS와 REM이 더 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 桂枝茯笭丸이나 이와 관련된 한약제제의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되며, 桂枝茯笭丸의 우수한 항산화 활성과 LDL의 산화 억제활성을 통해 산화적 스트레스에 의한 동맥 경화질환의 초기단계를 예방하는데 활용할 수 있을 것으로 기대 된다.
함량 분석 결과 桂枝茯笭丸 추출물 중 桂枝의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde의 함량이 1.97±0.09, 0.40±0.03 및 0.78±0.05 mg/g으로 각각 검출되었으며, 牧丹皮의 paeonol과 桃仁의 amygdalin이 3.42±0.29 및 21.76±0.67 mg/g으로 각각 나타났다.
후속연구
또한 桂枝茯笭丸의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성은 용량이 높을수록 높은 활성을 나타내었으며, LDL 산화 억제 활성 역시 고농도로 처리할 경우 LDL의 산화정도를 나타내는 지표인 TBARS와 REM이 더 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 桂枝茯笭丸이나 이와 관련된 한약제제의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되며, 桂枝茯笭丸의 우수한 항산화 활성과 LDL의 산화 억제활성을 통해 산화적 스트레스에 의한 동맥 경화질환의 초기단계를 예방하는데 활용할 수 있을 것으로 기대 된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
桂枝茯笭丸은 어떤 치료제로 알려져 있는가?
桂枝茯笭丸은 張仲景의『金匱要略』에 최초로 수록된 처방으로 桂枝(Cinnamomi Ramulus), 茯笭(Poria Sclerotium), 牧丹皮(Moutan Radicis Cortex), 芍藥(Paeoniae Radix) 및桃仁(Persicae Semen)의 5종 한약재로 구성되어 있으며, 하복부의 瘀血로 인한 痛症을 치료하는 기본 방제로 알려져 있다.1) 본 처방은 항암,2-4) 진통, 항염, 항경련 및 근이완,5,6)항혈전,7) 항동맥경화,8,9) 항혈소판10) 및 신장보호11) 효과 등과 같은 다양한 실험적 생리활성 연구가 진행 및 보고되었으며, 교통사고 등 외상으로 유발된 瘀血 변증에 대한 효과,12) 원발성 생리통에 대한 치료 효과1,13) 및 여성의 폐경 후 삶의 질 개선 효과14,15) 등의 증례보고와 임상연구도 보고되었다.
桂枝茯笭丸은 어떻게 구성되는가?
桂枝茯笭丸은 張仲景의『金匱要略』에 최초로 수록된 처방으로 桂枝(Cinnamomi Ramulus), 茯笭(Poria Sclerotium), 牧丹皮(Moutan Radicis Cortex), 芍藥(Paeoniae Radix) 및桃仁(Persicae Semen)의 5종 한약재로 구성되어 있으며, 하복부의 瘀血로 인한 痛症을 치료하는 기본 방제로 알려져 있다.1) 본 처방은 항암,2-4) 진통, 항염, 항경련 및 근이완,5,6)항혈전,7) 항동맥경화,8,9) 항혈소판10) 및 신장보호11) 효과 등과 같은 다양한 실험적 생리활성 연구가 진행 및 보고되었으며, 교통사고 등 외상으로 유발된 瘀血 변증에 대한 효과,12) 원발성 생리통에 대한 치료 효과1,13) 및 여성의 폐경 후 삶의 질 개선 효과14,15) 등의 증례보고와 임상연구도 보고되었다.
표준물질의 순도가 98% 이상인 시약은 무엇인가?
시약 및 기기 − Amygdalin, coumarin, dimethyl sulfoxide (DMSO), 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) 및 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 SigmaAldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, albiflorin, paeoniflorin, cinnamic acid, cinnamaldehyde 및 paeonol은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
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