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문제 정의
- 백지 에탄올추출물이 세포수준에서 멜라닌 생성을 저해하는 것으로 확인되었으나 동물 시험에서의 미백효능에 대한 연구는 아직 확인된 바가 없어 본 실험에서는 백지 에탄올추출물을 도포 전과 도포 5주 후의 brown guinea pig 피부 멜라닌 색소침착 변화 정도 및 백지 에탄올추출물의 미백 효과를 FDA 공인 제품인 hydroquinone과 비교 관찰하기 위하여 육안적 관찰을 하였다.
- 본 연구는 백지 에탄올추출물을 사용하여 세포독성 및 멜라닌세포 형태학적 관찰을 통해 멜라닌합성 억제 정도를 분석하고 brown guinea pig를 이용한 동물 실험에서 백지 에탄올추출물의 미백효과를 검증하여 화장품 천연물 소재로서의 활용 가능성을 검토 하고자 하였다.
제안 방법
- 5, 25. 50 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 37℃, 10% CO2 incubator에서 72시간 배양된 melan-a 세포를 새 배지로 교환 후 도립현미경으로 관찰하였다.
- 자외선(UVB)에 의한 인공색소반의 제작은 Choi 등[22]의 방법으로 수행하였다. Brown guinea pig의 등 부위를 hair clipper로 털을 깍고 깨끗이 면도한 후 염산 케타민(100 mg/kg)으로 마취한 다음, 동물의 등에 조사부위( 12 mm)를 원형으로 뚫은 가죽으로 제작한 천을 덮고 302 nm를 방출하는 sunlamp를 이용하여 자외선을 조사하였다. 자외선은 주 1회, 1회 500 mJ/cm² 씩, 3주간 연속으로 하여 총 1,500 mJ/cm² 조사하였다.
- 자동화 과정은 reaction buffer로 3분간 세척하고 후 3% 2O2에 3분간 담그어 peroxidase의 활성을 억제시킨 후 일차항체 HMB-45를 1:100으로 희석하여 반응시키고 reaction buffer로 세척한 다음 biotin에 20분 반응 후 streptavidin에 25분 반응 시켰다. DAB(diamino-benjidine)에 발색 후 대조염색, 봉입한 다음 광학현미경으로 관찰하였고, 영상 분석 소프트웨어를 이용하여 멜라닌소체 내 gp100 단백질 발현정도를 수치화하여 분석하였다.
- Melan-a 세포에 대한 백지 에탄올추출물의 세포독성 확인 및 실험에 사용할 시료의 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 실시하였다. MTT assay법은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포내로 흡수된 후 미토콘드리아(mitochondrion)의 succinate dehydrogenase에 의해 formazan을 형성하는데 이 물질의 세포내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포생장율을 측정하는 대표적인 방법이다.
- Melan-a 세포에 백지 에탄올추출물을 농도별로 처리하고 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 멜라닌세포는 신경능에서 유래한 수지상세포로서 표피 기저층에 존재하며 한 개의 멜라닌세포와 약 20-40개의 각질형성세포로 이루어진 표피 멜라닌 단위(epidermal melanin unit)를 형성한다.
- 자외선은 주 1회, 1회 500 mJ/cm² 씩, 3주간 연속으로 하여 총 1,500 mJ/cm² 조사하였다. UVB 조사에 의해 형성된 인공색소반에 미백 물질을 도포하는 시점은 색소침착 안정화를 위해 마지막 자외선을 조사한 10일 후부터 실험군은 1%, 2%백지 에탄올추출물을, 양성대조군은 2% 하이드로퀴논을 1일 2회, 주 5일, 매회 30 ㎕ micro pipette을 이용하여 5주간 도포하였다. (1%: 0.
- melan-a 세포를 96-well plate에 적정 세포수(0.5×104 cells/well)로 분주하고 37℃, 10% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음 백지 에탄올추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50, 100㎍/㎖)로 희석시켜 200 ㎕씩 넣은 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
- 06㎎/㎠/일). 대조군은 생리식염수를, 용매 대조군은 용매를 도포 하였다.
- 본 연구는 백지 에탄올추출물의 미백효능을 알아보기 위해 세포수준에서 melan-a 세포를 사용하여 세포독성 및 멜라닌세포 형태학적 변화를 관찰한 시험과 brown guinea pig의 등 부위에 1500 mJ/㎠ 광량의 UVB 조사로 유발시킨 인공색소반(ф 12 mm)에 1일 2회, 주 5일, 매회 30 ㎕씩 총5주간 시료를 도포하여 미백효과를 평가한 동물실험에서 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 색소침착 확인을 위한 육안적 관찰은 실험기간 동안 매주 1회, 5주 동안 실험동물의 피부착색 상태를 용매대조군 도포부위와 시료군 도포부위를 비교하여 상대적인 미백효과를 관찰하였고, 피부표면 상태는 디지털카메라로 촬영하였다.
- HQ(Hydroquinone), DMSO(dimethyl sulfoxide), arbutin은 ACROS 사(USA)의 제품을, Propylene glycol은 (주)동양제철화학(한국)의 제품을, 염산 케타민은 유한양행(한국)의 제품을 사용하였고, 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다. 실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp(UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer(HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였으며, 세포주 관찰은 inverted microscope(CKX41, Olympus, Japan), 조직표본관찰은 fluorescence microscope(Axio imager, Carl Zeiss, Germany)를, 영상분석은 i-solution(IMT i-solution ver. 8.0, Canada)을 사용하였다. 고주영[24] 등은 이러한 시약 및 기기를 사용하여 2% 삼릉 에탄올추출물을 brown guinea pig 피부에 8주간 도포한 결과 확연한 미백 효과가 있음을 보고한바 있다.
- Ltd, Japan)로부터 분양받아 사육실에서 1주일 적응 시킨 후, 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유로이 공급하였고, 사육실온도 22±℃, 습도50±5%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였다. 실험동물은 실험 5주째 되는 날 염산 케타민으로 마취한 후 시료를 도포한 인공색소반 부위를직경 12 mm의 biopsy punch로 절취하여 10%의 중성 포르말린 용액에 12시간 실온에서 고정한 후 조직학적 관찰에 사용하였다.
- 멜라노좀은 멜라닌세포에서만 볼 수 있는 세포내 구조이며, 멜라닌의 생성 중간 산물들이 큰 반응성을 가지고 있어 그 독성으로부터 세포를 보호하기 위하여 멜라노좀 내에서만 멜라닌합성이 일어나는 것으로 보고되고 있다[29]. 이에 본 연구는 HMB-45 염색으로 멜라노좀에 존재하는 gp100의 발현 정도와 분포 형태를 분석하여 멜라닌세포 생성의 변화를 간접적으로 관찰하였다. HMB-45 염색은 S-100 염색과 함께 멜라닌세포 및 멜라노좀에 대한 연구에 민감한 지표로 널리 사용되고 있다.
- 자외선은 주 1회, 1회 500 mJ/cm² 씩, 3주간 연속으로 하여 총 1,500 mJ/cm² 조사하였다.
대상 데이터
- C57BL/6 mice에서 유래한 immortalized cell line인 melan-a 세포를 Dr. Bennett(Cancer Research Center, London, England)으로 부터 분양 받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% PS(penicillin/streptomycin), 200 nM TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 함유된 RPMI -1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 incubator 에서 배양하였다.
- HQ(Hydroquinone), DMSO(dimethyl sulfoxide), arbutin은 ACROS 사(USA)의 제품을, Propylene glycol은 (주)동양제철화학(한국)의 제품을, 염산 케타민은 유한양행(한국)의 제품을 사용하였고, 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다. 실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp(UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer(HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였으며, 세포주 관찰은 inverted microscope(CKX41, Olympus, Japan), 조직표본관찰은 fluorescence microscope(Axio imager, Carl Zeiss, Germany)를, 영상분석은 i-solution(IMT i-solution ver.
- Melan-a 세포를 10% FBS, 1% P/S, 200 nM TPA가 합유된 RPMI-1640 배지에서 37℃, 10% CO2 incubator에서 72시간 동안 안정화 시킨 후 실험에 사용하였다. melan-a 세포를 96-well plate에 적정 세포수(0.
- 약 450~550 g의 brown guinea pig 3마리를 OYC(Oriental Yeast Co. Ltd, Japan)로부터 분양받아 사육실에서 1주일 적응 시킨 후, 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유로이 공급하였고, 사육실온도 22±℃, 습도50±5%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였다.
- 한국식물 추출물은행에서 분양 받은 백지 에탄올추출물(PBC-161A)을 용매[propyleneglycol: ethanol: water (5:3:2)]에 농도별로 용해시켜 사용하였다.
데이터처리
- SPSS(v 15.0) 통계프로그램을 이용하여 일원배치 분산 분석(one-way ANOVA)으로 동질성을 분석하였고, 각 군 간의 비교는 Duncan’s multiple range test로 사후분석을 실시하였다.
- Values with different superscripts in the same row are significantly different (p<0.001) by ANOVA and Duncan's multiple range test.
이론/모형
- 자외선(UVB)에 의한 인공색소반의 제작은 Choi 등[22]의 방법으로 수행하였다. Brown guinea pig의 등 부위를 hair clipper로 털을 깍고 깨끗이 면도한 후 염산 케타민(100 mg/kg)으로 마취한 다음, 동물의 등에 조사부위( 12 mm)를 원형으로 뚫은 가죽으로 제작한 천을 덮고 302 nm를 방출하는 sunlamp를 이용하여 자외선을 조사하였다.
성능/효과
- 1%, 2%의 백지 에탄올추출물 도포군, 2%의 하이드로퀴논 도포군, 용매대조군과 대조군 간에 미백 효과를 육안으로 비교한 결과, 양성대조군과 2% 실험군은 시료도포 3주부터 멜라닌 색소침착 부위의 색소침착 정도가 부분적으로 옅어지는 양상이 나타났으며, 실험 5주에는 용매대조군에 비해 양성대조군과 2% 실험군의 색소침착 부위에서 선명한 탈색효과를 나타내었고, 1% 실험군의 색소침착 부위 역시 현저하게 밝아졌다. gp100 단백질 발현정도를 통하여 멜라닌세포 생성정도와 분포형태를 간접적으로 관찰한 결과, 대조군과 용매대조군은 정상군에 비해 멜라닌세포 생성정도가 증가하였으며 이러한 현상은 주로 기저층에 밀착되어 나타났고, gp100 단백질 발현면적을 수치화하여 객관적으로 비교 분석한 결과에서도 정상군에 비해 대조군과 용매대조군은 gp100 단백질 발현면적이 유의하게(p<0.
- 이상의 결과를 종합하면 백지 에탄올추추물을 melan-a 세포에 처치한 시험에서 세포독성은 보이지 않으면서 멜라닌합성 억제효과를 나타냈다. Brown guinea pig을 이용한 동물 실험에서는 백지 에탄올추출물 1%, 2% 모두 멜라닌색소 침착 부위에서 선명한 탈색효과를 나타내었으며, 멜라닌세포 증식 또한 감소되어 현저한 미백효과가 확인되어 미백 화장품 천연소재로 실용 가능성이 있을 것으로 판단된다.
- gp100 단백질 발현정도를 통하여 멜라닌세포 생성정도와 분포형태를 간접적으로 관찰한 결과, 대조군과 용매대조군은 정상군에 비해 멜라닌세포 생성정도가 증가하였으며 이러한 현상은 주로 기저층에 밀착되어 나타났고, gp100 단백질 발현면적을 수치화하여 객관적으로 비교 분석한 결과에서도 정상군에 비해 대조군과 용매대조군은 gp100 단백질 발현면적이 유의하게(p<0.001) 높은 것을 확인하였고 양성대조군과 1%, 2%의 실험군은 대조군과 용매대조군에 비해 유의하게(p<0.001) 낮은 수치를 나타내었다.
- 본 연구에서도 melan-a 세포의 형태 변화를 도립현미경으로 관찰한 결과, 시료를 처치하지 않은 정상군의 세포에서는 수지상돌기 발달과 함께 많은 량의 멜라닌 침전물이 관찰되어 선행연구와 비슷한 양상을 나타내었다. 대조군에 비해 시료 처치 농도 6.25 ㎍/㎖에서는 세포 모양과 수에 있어서 큰 변화가 없는 반면, 양성대조군으로 사용한 arbutin 25 ㎍/㎖ 처치군과 백지 에탄올추출물은 시료처치 농도가 증가할수록 정상군에 비해 세포의 밀도는 감소하였고 합성된 멜라닌과 수지상 돌기가 현저하게 줄어든 것을 관찰할 수 있었다[Fig. 2].
- 멜라노좀에서 발현되는 gp100 단백질의 발현 정도를 측정면적 대비 단백질의 발현면적 비(%)로 수치화 한 결과, 정상군(2.2%)에 비해 대조군 및 용매대조군은 각각 12.2%, 9.1%로 유의하게(p<0.001) 높은 수치를 나타낸 반면, 양성대조군과 1%, 2%의 실험군은 용매대조군에 비해 각각 2.7%, 6.9%, 5.6%로 유의하게(p<0.001) 감소하여 현미경 관찰의 결과와 일치하였다[Table 1].
- S-100은 멜라닌세포와 랑거한스세포 등에 반응하며, HMB-45는 멜라노좀에 특이한 당단백질인 gp100에 반응하여 활동성의 멜라닌세포에 반응을 보인다[23,31]. 멜라닌세포 생성 변화를 간접적으로 관찰한 결과, 정상군에 비해 대조군 및 용매대조군에서 gp100 단백질은 증가현상이 주로 기저층에 집결되어 나타난 반면, 양성대조군과 1%, 2%의 실험군은 대조군과 용매대조군에 비해 gp100 발현 양상이 현저하게 줄어들었음을 확인하였다[Fig. 4]. 멜라노좀에서 발현되는 gp100 단백질의 발현 정도를 측정면적 대비 단백질의 발현면적 비(%)로 수치화 한 결과, 정상군(2.
- 세포독성을 알아보기 위해 수행한 MTT assay 에서 백지 에탄올추출물은 측정 농도 100 ㎍/㎖에서 세포생존율이 68%로 나타나 melan-a 세포에 대한 최대허용농도는 50 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다. 백지 탄올추출물을 농도별로 처치한 melan-a 세포 형태학적 변화를 관찰한 결과, arbutin 25 ㎍/㎖ 처치군과 백지 에탄올추출물 처치군은 대조군에 비해 농도가 증가할수록 수지상돌기 및 멜라닌합성 양상이 확연하게 감소하였음을 확인하였다.
- 자외선에 의해 생성된 색소침착 부위의 색소탈색은 tyrosinase, TRP1, TRP2, peroxidase의 전사 및 활성 조절, ii) 멜라노좀의 각질형성세포로의 이동 및 각질형성세포에서의 분배 조절, iii) 멜라닌과 멜라노좀의 분해와 색소화 된 각질형성세포의 턴오버 조절에 의해 일어난다[10]. 본 연구에서 UVB 조사로 유발된 brown guinea pig의 등 부위의 인공색소반에 백지 에탄올추출물을 1일 2회, 주 5일, 5주간 도포하여 육안으로 비교한 결과, 실험 기간 중 모든 실험군에서 실험물질 도포로 인한 이상 징후는 관찰되지 않았으며, 양성대조군과 2% 실험군은 시료도포 3주부터 멜라닌 색소침착 부위가 밝아지기 시작하여 색소침착 정도가 부분적으로 옅어지는 현상을 관찰할 수 있었다. 실험 5주에는 용매대조군에 비해 양성대조군과 2% 실험군의 색소침착 부위에서 선명한 탈색효과를 나타내었고, 1% 실험군의 색소침착 부위 또한 밝아져 백지 에탄올추출물의 미백효능을 확인하였다[Fig.
- MTT assay법은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포내로 흡수된 후 미토콘드리아(mitochondrion)의 succinate dehydrogenase에 의해 formazan을 형성하는데 이 물질의 세포내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포생장율을 측정하는 대표적인 방법이다. 세포 생장율에 미치는 백지 에탄올추출물의 영향을 측정한 결과, 측정농도 100 ㎍/㎖에서 세포생장률이 68%로 나타나 melan-a 세포에 대한 백지 에탄올추출물의 최대허용농도는 50 ㎍/㎖로 확인되었다[Fig. 1].
- 세포독성을 알아보기 위해 수행한 MTT assay 에서 백지 에탄올추출물은 측정 농도 100 ㎍/㎖에서 세포생존율이 68%로 나타나 melan-a 세포에 대한 최대허용농도는 50 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다. 백지 탄올추출물을 농도별로 처치한 melan-a 세포 형태학적 변화를 관찰한 결과, arbutin 25 ㎍/㎖ 처치군과 백지 에탄올추출물 처치군은 대조군에 비해 농도가 증가할수록 수지상돌기 및 멜라닌합성 양상이 확연하게 감소하였음을 확인하였다.
- 본 연구에서 UVB 조사로 유발된 brown guinea pig의 등 부위의 인공색소반에 백지 에탄올추출물을 1일 2회, 주 5일, 5주간 도포하여 육안으로 비교한 결과, 실험 기간 중 모든 실험군에서 실험물질 도포로 인한 이상 징후는 관찰되지 않았으며, 양성대조군과 2% 실험군은 시료도포 3주부터 멜라닌 색소침착 부위가 밝아지기 시작하여 색소침착 정도가 부분적으로 옅어지는 현상을 관찰할 수 있었다. 실험 5주에는 용매대조군에 비해 양성대조군과 2% 실험군의 색소침착 부위에서 선명한 탈색효과를 나타내었고, 1% 실험군의 색소침착 부위 또한 밝아져 백지 에탄올추출물의 미백효능을 확인하였다[Fig. 3]. 이와 같은 결과는 백지 에탄올추출물이 멜라닌세포 수지상돌기에 의해 각질세포에 전달된 멜라노좀을 분해시키고 색소화 된 각질형성세포의 턴오버 주기를 촉진, 멜라닌 색소탈색을 유도하여 미백효과를 나타낸 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합하면 백지 에탄올추추물을 melan-a 세포에 처치한 시험에서 세포독성은 보이지 않으면서 멜라닌합성 억제효과를 나타냈다. Brown guinea pig을 이용한 동물 실험에서는 백지 에탄올추출물 1%, 2% 모두 멜라닌색소 침착 부위에서 선명한 탈색효과를 나타내었으며, 멜라닌세포 증식 또한 감소되어 현저한 미백효과가 확인되어 미백 화장품 천연소재로 실용 가능성이 있을 것으로 판단된다.
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