선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 논문에서는 마늘의 항균작용, 건강증진작용 및 변색작용의 연구에 활용하기 위해 마늘에 특이적으로 들어있는 유기물질들의 분리 정제를 수행하였다.
제안 방법
- )을 사용하였다. 100% 물을 이동상으로 3 mL/min의 유속으로 4개의 구간으로 분획 받았으며, 매 회마다 마늘즙 시료 20 mL를 주입하였다.
- 1구간은 Polar-RP column(250×21.2 mm, Phenomenex Corp., Torrance, CA, USA)과 Luna 10U C-8 column(250×21.2 mm, Phenomenex Corp.)을 연속적으로 사용하였다.
- 1차 분획받은 4개의 구간을 재순환하여 순수 정제하였으며, 각 구간을 정제할 때 정제효율이 높일 수 있도록 해당 목적에 맞는 적절한 컬럼을 사용하였다. 1구간은 Polar-RP column(250×21.
- 3구간과 4구간은 gel permeation chromatography(GPC) column(Jaigel W-252 column, 500×20.0 mm i.d., Japan Analytical Industry Corp.)으로 정제 하였으며, 이동상은 10% methanol/water로 하여 3 mL/min의 유속으로 실시하였다.
- W-252 column을 장착한 분취 HPLC를 사용하여 마늘추출물을 1차로 4구간으로 분획하였고(Fig. 2) 각 구간의 획분을 다시 재순환 분취 HPLC를 이용하여 각 구간마다 주요 피크들을 순수 정제하였다. 제 3, 4구간은 각각 tyrosine과 phenylalanine으로, 그리고 제 5구간은 tryptophan으로 확인되어 마늘 특이 성분이 아니 었으므로 분리정제에 포함시키지 않았다.
- 3)등 3가지 펩타이드를 포함하고 있었다. 각각의 펩타이드를 포함하고 있는 3개의 주요 구간의 획분을 받아 C-8 컬럼을 이용하여 재순환하여 순수 정제되었다.
- 1(85% orthophosphoric acid로 pH 조정))와 B용매(A용매:acetonitrile=50:50)를 사용하였다. 구배용리법을 이용하였으며, 이동상의 비율은 A/B가 93:7로 시작하였으며 50분이 될 때 50:50의 비율이 되도록 일정한 속도로 증가시켰다. 50:50의 비율을 55분까지 유지한 후 60분에 93:7이 되도록 조정한 후 이를 80분까지 일정하게 유지시켰다.
- 기타 마늘 특유의 함황유기화합물로서 γ-glutamyl peptide류가 있으며 함량이 충분하여 분리 정제를 수행한 것으로는 γ-glutamyl-S-allylcysteine, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamylphenylalanine 등 3가지였다. 기타 마늘 특유의 성분은 아니지만 UV 208 nm에서 흡광도를 크게 나타내는 것으로 arginine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan과 같은 일반적인 아미노산류가 있었지만, 본 연구에서는 마늘 특유의 아미노산과 펩타이드만을 정제하였다. 마늘 특이 아미노산과 펩타이드의 분리정제는 재순환 분취 HPLC를 이용하여 순수하게 정제하였으며, 생마늘 6 kg으로부터 알린, 이소알린, γ-glutamyl-S-allylcysteine, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamylphenylalanine이 각각 7.
- 정제한 물질들의 동정방법은 HPLC 머무름 시간의 비교 및 LC/MS를 이용한 분자량 측정이었다. 동일한 분자량을 가지는 알린과 이소알린을 분별하기 위해 1 H-NMR를 그리고 γ-glutamyl-S-allylcysteine과 γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine을구별하기 위해 1H-NMR과 13C-NMR분석을 수행하였다.
- 마늘 성분 분석용 HPLC의 용매와 조건은 Arnault 등(22)의 방법을 변경하여 사용하였다. 재순환 분취 HPLC를 이용하여 분취한 각 구간은 역상컬럼인 Luna 3U C18(4.
- 마늘에서 분리 정제한 마늘 특이 물질들은 HPLC 분석에 의해 Fig. 5와 같이 머무름 시간을 비교함으로서 동정하였고(22) 추가로 LC/MS와 1 H-NMR과 13 C-NMR 구조분석을 실시하여 확인하 였다(Table 2).
- 마늘의 고유성분으로 확인된 알린, 이소알린, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamyl-S-allylcysteine, γ-glutamylphenylalanine만을 최종 정제하였다.
- 순수정제한 물질을 중수(D2O)에 용해시킨 뒤 1 H-NMR와 13 CNMR (Ultrashield, Avance 500 MHz, Bruker, Rheinstetten, Germany)분석을 실시하였다(23). 발진기의 주파수는 1 H-NMR은 500 MHz,13C-NMR은 125 MHz에서 실시하였으며, chemical shift(δ unit)는 ppm으로 표시하였다.
- 재순환 분취 HPLC를 이용하여 분취한 각 구간은 역상컬럼인 Luna 3U C18(4.6 mm×150 mm×3 µm, Phenomenex Inc.)이 장착된 P680 HPLC(Dionex Corp., Hessen, Germany)를 사용하여 분석하였고, 용매는 A용매(20 mM sodium phosphate monobasic dihydrate+10 mM sodium 1-heptane-sulfonic acid, pH 2.1(85% orthophosphoric acid로 pH 조정))와 B용매(A용매:acetonitrile=50:50)를 사용하였다.
- 전처리를 마친 마늘즙을 재순환 분취(recycling preparative) HPLC(JAI-LC 908, Japan Analytical Industry Corp., Tokyo, Japan)와 JAI UV 3702 검출기를 사용하여 1차 분획하였다. 1차분획시에는 gel permeation chromatography(GPC) column (Jaigel W-252 column, 500×20.
- 1). 정제를 진행하면서 동시에 Fig. 1에 나타난 성분들과 비교하여 해당 성분의 동정을 수행하였다.
- 8%이었다. 정제한 물질들의 동정방법은 HPLC 머무름 시간의 비교 및 LC/MS를 이용한 분자량 측정이었다. 동일한 분자량을 가지는 알린과 이소알린을 분별하기 위해 1 H-NMR를 그리고 γ-glutamyl-S-allylcysteine과 γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine을구별하기 위해 1H-NMR과 13C-NMR분석을 수행하였다.
- 제 1구간을 polar RP 컬럼을 이용해 20분과 30분 사이의 머무름 시간(retention time)을 가지는 획분을 1회 재순환하여 Fig. 3의 A와 같이 네 개의 구간으로 나누었다. 이들 각각을 HPLC 분석 하였을 때 가장 앞에 나오는 것은 제 2구간에서 혼입되어 들어온 알린과 이소알린의 혼합물이었고 그 뒤로 연속해서 나오는 3 개의 피크들이 각각 γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine(fraction A-2, Fig.
- 착즙액을 17,600×g에서 30분간 원심분리(HMR-2001V, Hanil Industrial Co., Inchon, Korea)하여 불용성 침전물을 제거하였고 상층액에 최종농도가 70%가 되도록 에탄올을 첨가하여 당, 단백질 등을 침전을 시켜 제거한 후 상층액의 부피가 50%가 되도록 진공농축(rotary vacuum evaporator, N-H Series, Eyela, Tokyo, Japan)하였다.
대상 데이터
- (St. Paul, MN, USA)에서 구입하였고, 물, 메탄올 및 dichloromethane 등의 용매는 Burdick & Jackson(Ulsan, Korea)에서 구입하였다.
- 농축마늘즙은 여과(0.2 µm nylon membrane filter, Whatman International LTD, Kent, UK)하여 마늘 특이성분 분리용 원료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 마늘은 인터넷을 통하여 전국 각 지역에서 구입하였다. L(+)Alliin은 LKT Laboratories, Inc.
- 순수분리한 물질을 질량분석기(Mass spectrometer; MS; Thermo Finnigan LCQ DECA XP, West Palm Beach, FL, USA)를 사용 하여 분자량을 측정하였으며 이온화는 전자분무이온화(electrospray ionization)방식을 사용하였고, positive polarity로 하였다. 분석타입은 Ion trap analyzer, 스캔범위는 50-1000 m/z이였다.
데이터처리
- 이상과 같은 방법으로 마늘 6 kg을 처리하여 얻은 마늘즙으로부터 정제한 물질들을 동결건조한 뒤 수득율을 계산한 결과는 Table 1과 같다. 수득율은 마늘에 함유된 화합물의 평균함량을 기준으로 마늘 6 kg에서 정제해 얻은 물질의 비율로 계산하였다. 마늘의 고유성분으로 확인된 알린, 이소알린, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamyl-S-allylcysteine, γ-glutamylphenylalanine만을 최종 정제하였다.
이론/모형
- 마늘즙 제조는 이전에 보고된 방법(21)을 사용하였다. 마늘을 박피한 후 80°C에서 15분간 데쳐 alliinase를 불활성화시킨 후 수돗물로 냉각시켰으며, 동량의 증류수를 넣어 분쇄 후 착즙하였다.
- 순수분리한 물질을 질량분석기(Mass spectrometer; MS; Thermo Finnigan LCQ DECA XP, West Palm Beach, FL, USA)를 사용 하여 분자량을 측정하였으며 이온화는 전자분무이온화(electrospray ionization)방식을 사용하였고, positive polarity로 하였다. 분석타입은 Ion trap analyzer, 스캔범위는 50-1000 m/z이였다.
성능/효과
- 7번 피크(분자량 294)의 물질은 NMR 분석결과와 LC/MS의 결과를 종합하여 분석한 결과 γ-glutamylphenylalanine으로 판단되었다.
- 7번 피크는 분자량 294인 물질이었고 마늘에는 분자량 294인 물질이 γ-glutamylphenylalanine가 유일한 것이었기 때문에 성분의 추정이 용이하였다. LC/MS 분석을 통하여 알린과 이소알린으로 추정된 분자량 177의 물질 두 개는 1H-NMR로 분석한 결과(23) 두 개의 물질은 다른 것으로 확인되었다. 분자량 177을 가지는 물질 중 분석용 HPLC로 분석하였을 때 Fig.
- 마늘의 고유성분으로 확인된 알린, 이소알린, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamyl-S-allylcysteine, γ-glutamylphenylalanine만을 최종 정제하였다. 대당 정제 효율은 높지 않아 대개 5% 범위에 속하였으며, 단지 이소알린만은 정제수율이 40%를 초과하였다. 알린과 이소알린을 분리정제한 재순환 분취 HPLC의 크로마토그램을 보면, 이소알린이 많은 알린의 일부로 혼합되어 있다가 이소 알린이 최종적으로 알린으로부터 정제되기 때문에 손실이 적었던 것으로 추정되었다.
- 마늘 특유물질 중에서 이소알린의 수득율이 비교적 가장 높았 으며, 알린의 수득율은 그에 미치지는 못하였으나 12%를 초과하는 비교적 높은 %를 나타내었다. 마늘에는 γ-glutamyl 펩타이드 류의 함량이 매우 낮아서(6) 작은 손실이라고 하더라도 수득률에큰 영향을 미치기 때문에 수득률이 5% 또는 그 이하로 낮게 나타났다.
- 마늘 특이 아미노산과 펩타이드의 분리정제는 재순환 분취 HPLC를 이용하여 순수하게 정제하였으며, 생마늘 6 kg으로부터 알린, 이소알린, γ-glutamyl-S-allylcysteine, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamylphenylalanine이 각각 7.32, 1.53, 0.38, 0.42, 0.23 g을 얻었으며 이를 마늘 함유량 대비 수율로 계산하면 각각 12.2, 42.5, 1.6, 1.2, 4.8%이었다.
- 알린은 전체 sulfoxides의 85% 정도를 차지하고 메틴은 10%, 이소알린은 5% 이내의 비율이라고 알려져 있다(6). 마늘은 재배된 기후 조건에 따라서 sulfoxide 성분함량의 차이를 보이는데, 기후가 추운 지역에서 재배된 마늘이 따뜻한 기후에서 재배된 마늘보다 알린 함량이 높고 메틴 함량이 낮으며(7), 품종별, 재배 산지별로 마늘의 알린 함량은 0.6-1.7%로 다양한 범위를 나타내었다(8-10).
- 마늘의 천연 성분을 분석하였을 때 8개의 주요 성분이 나타났으며, 가장 크게 나타난 피크는 알린이었고 실제로 함량도 가장 높게 나타났다. 이소알린은 알린의 뒤를 이어 큰 피크를 나타내 었고 함량도 알린에 이어 많은 양이 얻어졌다.
- 본 연구에서 최종적으로 정제대상이 된 마늘 특유의 물질들은 알린, 이소알린, γ-glutamyl-S-1-propenylcysteine, γ-glutamyl-S-allylcysteine 등과 같이 황을 함유하는 아미노산이나 펩타이드류와, 황을 함유하지 않는 일종의 다이펩타이드인 γ-glutamylphenylalanine 이었다.
- 대당 정제 효율은 높지 않아 대개 5% 범위에 속하였으며, 단지 이소알린만은 정제수율이 40%를 초과하였다. 알린과 이소알린을 분리정제한 재순환 분취 HPLC의 크로마토그램을 보면, 이소알린이 많은 알린의 일부로 혼합되어 있다가 이소 알린이 최종적으로 알린으로부터 정제되기 때문에 손실이 적었던 것으로 추정되었다.
- 전처리한 마늘로부터 얻은 마늘즙 시료를 HPLC로 분석한 결과, 8개의 대표적인 성분이 나타났다(Fig. 1). 정제를 진행하면서 동시에 Fig.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.