마늘 중 고속 액체 크로마토그래피에 의한 알린의 분리 및 정량과 Alliin과 에탄올 추출물의 항균효과에 관한 연구 Isolation of Alliin in Garlic and Its Quantitative Determination by High Performance Liquid Chromatography and Studies on the Antimicrobial Efforts of Alliin and Ethanol Extracts from Korean Garlic(Alliium sativum L.)원문보기
본 연구는 마늘속에 alliin을 크로마토그래피에 의하여 함량을 알고 이들이 에탄올추출물에 향균효과를 알아보기 위하여 연구했다. HPLC를 이용하기 위하여 메탄올로 Alliin을 추출하고 유해세균에 대한 향균활성을 알아보기 위하여 Alliin을 에탄을 추출물 시료를 조제하여 사용하였다. 마늘에는 alliin의 함량은 0.34 ∼0.73% fresh weight를 나타내고 에탄을 추출물의 시료에서 동결건조 시료수율이 가장 높았는데 이는 효소적 분해가 최소화되는 것으로 사료되며 에탄을 추출물의 향균효과는 Table 3에서 각 균주에 대하여 억제효과는 각 균주에서 50∼80% 효과를 보았고, 각종 균에 대한 억제차원에서 향균성을 달리하는 것을 알 수 있었으며 유해세균에 대한 향균작용이 마늘 추출물은 미생물의 발육저지력이 강하고 지속적으로 인체에 무해하므로 보존료 개발이 바람직함을 알았고, 독특한 향미를 주는 황화합물이 많아 산도의 증가와 관계없이 항균력이 강함을 보았고, 각종 균에 대한 항균성을 달리 하는 것을 알 수 있었다. 이로 인해 마늘성분중 선택적인 항균물질의 개발이 요구됨을 알았다.
본 연구는 마늘속에 alliin을 크로마토그래피에 의하여 함량을 알고 이들이 에탄올추출물에 향균효과를 알아보기 위하여 연구했다. HPLC를 이용하기 위하여 메탄올로 Alliin을 추출하고 유해세균에 대한 향균활성을 알아보기 위하여 Alliin을 에탄을 추출물 시료를 조제하여 사용하였다. 마늘에는 alliin의 함량은 0.34 ∼0.73% fresh weight를 나타내고 에탄을 추출물의 시료에서 동결건조 시료수율이 가장 높았는데 이는 효소적 분해가 최소화되는 것으로 사료되며 에탄을 추출물의 향균효과는 Table 3에서 각 균주에 대하여 억제효과는 각 균주에서 50∼80% 효과를 보았고, 각종 균에 대한 억제차원에서 향균성을 달리하는 것을 알 수 있었으며 유해세균에 대한 향균작용이 마늘 추출물은 미생물의 발육저지력이 강하고 지속적으로 인체에 무해하므로 보존료 개발이 바람직함을 알았고, 독특한 향미를 주는 황화합물이 많아 산도의 증가와 관계없이 항균력이 강함을 보았고, 각종 균에 대한 항균성을 달리 하는 것을 알 수 있었다. 이로 인해 마늘성분중 선택적인 항균물질의 개발이 요구됨을 알았다.
First. the purification and analysis of alliin in garlic from different origins by alliin-HPLC determination method were studied. Allinase in garlic was inactivated by heating in boiling water followed by extraction of alliin in garlic with 80% methanol. To remove free amino acids and alliin homolog...
First. the purification and analysis of alliin in garlic from different origins by alliin-HPLC determination method were studied. Allinase in garlic was inactivated by heating in boiling water followed by extraction of alliin in garlic with 80% methanol. To remove free amino acids and alliin homologs in garlic, garlic extract was separated by cation exchange column which was packed with amberlite CG-120 resin using 40L d-water as eluent. Alliin in garlic extract was crystallized in a mixture of acetone (50$^{\circ}C$)：H$_2$O：acetic acid=70:29:1 and then recrystallized in a mixture of acetone (50$^{\circ}C$)：H$_2$O：acetic acid=75:24:1. Obtained alliin was identified by melting point. TLC, microscope observation and mass spectrometry. High performance liquid chromatography (HPLC) following pre-column derivatization of cystein derivatives with o-phthaldialdehyde/2-mercaptoethanol has succeessfully been applied to the analysis of various garlics. Each alliic of standard solution and garlic extract was derivatized to isoindole derivative by o-phthaldialdehyde /2-mercaptoethanol and then analyzed by HPLC. Six point calibration was done by using alliin peak area. Lineality was observed at 0 ∼ 1.0mg/ml of alliin concentration. Weighted regression line function was Y=6254X - 256077. By this function, alliin contents in various garlics were 0.34 ∼ 0.73% fresh weight. Second study was designed to evaluate the effects of garlic extracts of various concentrations on the growth of various pathogenes (Eubacterium limonsum, Bacteroides fragilis, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Kiebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pserdomonas aeruginosa, Escherichia coli). For antimicrobial effects against microorganism, totally minimal inhibition concentrations (MIC) of alliin were from 5,000 to 20,000ppm. MIC of ethanol extract were 1,250 to 10,000ppm.
First. the purification and analysis of alliin in garlic from different origins by alliin-HPLC determination method were studied. Allinase in garlic was inactivated by heating in boiling water followed by extraction of alliin in garlic with 80% methanol. To remove free amino acids and alliin homologs in garlic, garlic extract was separated by cation exchange column which was packed with amberlite CG-120 resin using 40L d-water as eluent. Alliin in garlic extract was crystallized in a mixture of acetone (50$^{\circ}C$)：H$_2$O：acetic acid=70:29:1 and then recrystallized in a mixture of acetone (50$^{\circ}C$)：H$_2$O：acetic acid=75:24:1. Obtained alliin was identified by melting point. TLC, microscope observation and mass spectrometry. High performance liquid chromatography (HPLC) following pre-column derivatization of cystein derivatives with o-phthaldialdehyde/2-mercaptoethanol has succeessfully been applied to the analysis of various garlics. Each alliic of standard solution and garlic extract was derivatized to isoindole derivative by o-phthaldialdehyde /2-mercaptoethanol and then analyzed by HPLC. Six point calibration was done by using alliin peak area. Lineality was observed at 0 ∼ 1.0mg/ml of alliin concentration. Weighted regression line function was Y=6254X - 256077. By this function, alliin contents in various garlics were 0.34 ∼ 0.73% fresh weight. Second study was designed to evaluate the effects of garlic extracts of various concentrations on the growth of various pathogenes (Eubacterium limonsum, Bacteroides fragilis, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Kiebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pserdomonas aeruginosa, Escherichia coli). For antimicrobial effects against microorganism, totally minimal inhibition concentrations (MIC) of alliin were from 5,000 to 20,000ppm. MIC of ethanol extract were 1,250 to 10,000ppm.
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문제 정의
본 연구는 마늘속에 alliin을 크로마토그래피에 의하여 함량을 알고 이들이 에탄올추출물에 향균효과를알아보기 위하여 연구했다.
위와 같이 여러 연구 발표에서 마늘의 효과가 입증되었지만, 주요 성분인 alliin 단일성분과 유효 용매 분획에 대한 항균성에 대한 구체적인 연구는 거의 없는 실정이므로 본 연구에서는 우선 마늘중에 alliin의 함량을 알아보고, 마늘의 항균활성물질의 탐색하기 위해서, 식용 및 의약용으로 그 수요가 증가될 것으로 예상되는 한국산 마늘의 주요 성분인 alliin을 분리 정제하여 효소적인 반응을 통한 검색과 아울러 유효성분으로 예측되는 물질의 미생물의 생육에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
. TLC 전개 용매 : Butanol-acetic acid - prophy alcohol - 증류수 혼합용매 발색제, 이온교환수지 컬럼, Mass spectrometiy, High performance liquid chromatograph(HPLC)를 사용하였다.
Alliin의 추출은 Stoll 등의 방법19)을 개량하여 각 정제 단계별로 alliin의 추출에 따른 작용기에 대한 정성분석을 실시하였다.
HPLC를 이용하기 위하여 메탄올로 Alliin을 추출하고 유해세균에 대한 향균활성을 알아보기 위하여 Alliin을 에탄올 추출물 시료를 조제하여 사용하였다. 마늘에는 alliin의 함량은 0.
결정을 ionizing energy 70eV, source temperature 100℃ 에서 mass spectrometry로 분석하였다.
결정을 slide glass에 올려놓고 광학 현미경으로 관찰하였다.
1ml 되게 조정하여 배지에 균등하게 되도록 접종하여 48시간 키운 후 1 colony를 다시 10ml의 각 broth에 접종하여 37℃에서 48시간 배양하였으며, 12시간 마다 각 broth에서 2회 이상 계대 배양한 후, 배수 희석법으로 실시한 시료가 제 1시험관으로부터 40,000 ppm 되게 1ml을 가한 후 2배수 계단희석하여 고압 증기 멸균한 시료 용액을 첨가하여 균주를 1% 죄게 조절하여 배지에 균등하게 되도록 접종한 후 37℃에서 배양하고, agar plate 배양에서는 각 시험관의 균 발육 여부를 확인하기 위하여 nutrient agar plate에 획선도말하여 37℃ 배양기 내에서 24시간 배양하여 균 배양성적을 판정하여 최소발육저지 농도를 측정하였다. 경시적으로 620nm에서의 흡광도 측정은 broth system에 적용하여 매 3시간 간격의 측정으로부터 확인하였다.
세균을 배양하기 위하여 nutrient 배지를 사용하였으며, 균접종은 냉동건조된 세균들을 10ml의 nutrient broth 및 modified EG 배지 에 넣어 37℃에서 24시간 배양한 후 0.1ml을 취해 멸균한 생리식염수 (0.85% NaCl) 10ml에 희석하고 nutrient agar 배지에 0.1ml 되게 조정하여 배지에 균등하게 되도록 접종하여 48시간 키운 후 1 colony를 다시 10ml의 각 broth에 접종하여 37℃에서 48시간 배양하였으며, 12시간 마다 각 broth에서 2회 이상 계대 배양한 후, 배수 희석법으로 실시한 시료가 제 1시험관으로부터 40,000 ppm 되게 1ml을 가한 후 2배수 계단희석하여 고압 증기 멸균한 시료 용액을 첨가하여 균주를 1% 죄게 조절하여 배지에 균등하게 되도록 접종한 후 37℃에서 배양하고, agar plate 배양에서는 각 시험관의 균 발육 여부를 확인하기 위하여 nutrient agar plate에 획선도말하여 37℃ 배양기 내에서 24시간 배양하여 균 배양성적을 판정하여 최소발육저지 농도를 측정하였다. 경시적으로 620nm에서의 흡광도 측정은 broth system에 적용하여 매 3시간 간격의 측정으로부터 확인하였다.
암모니아를 제거하고 얻어진 고형분을 증류수에 완전히 녹이고 acetic acid와 aceton을 첨가하여 밀봉하여 2일간 방치하였다. 결정이 어느 정도 생성되면 4C에서 24시간 방치하여 결정을 성장시켰다.
얻어진 결정중에서 소량을 증류수에 녹이고 TLC plate에 도부한 후 전개시킨 다음 발색시켜 분리 반점을 관찰하였다.
이용하여 농축하였다. 얻어진 추출액을 이온교환수지 column에 서서히 주입하고 아미노 화합물을 검출하기 위하여 ninhydrin test를 실시하였다. 발색 정도에 따라 분류하여 TLC에 전개한 후 유효 분획분을 다시 농축하였다.
감압농축시켰다. 지질 성분과 불순물을 분리하기 위해 ether를 사용하여 분획하고, 잔존하는 당류를 ethanol 침전하여 제거하였다. 상층액을 원심분리한 후 감압농축하고 미리 냉각시킨 ethanol을 가하여 백색의 침전을 얻었으며, 황산데시케이터 내에서 감압 건조하고, 탈이온수를 사용하여 녹인 후, acetone 을 사용하여 3회 이상 재결정하여 alliin을 얻었다.
추출물을 n-hexane과 섞고 흔들어 지질을 제거한 후 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 얻어진 추출액을 이온교환수지 column에 서서히 주입하고 아미노 화합물을 검출하기 위하여 ninhydrin test를 실시하였다.
이 농축액을 separating fUnnel에 옮기고 500ml의 ethyl ether로 2회 추출하여 지방성분과 불순물을 제거하였고, 수층을 50℃ 이하에서 rotary vacum evaporator 감압농축하여 완전히 건조하여 담황색의 분말을 얻었다. 탄수화물을 제거하기 위해 분말을 200ml의 증류수에 녹이고 1.5L의 ethanol을 가하여 진탕시킨 다음 실온에서 24시간 정치하였다가 원심분리하여 상층액을 버리고 syrup 상의 잔사를 감압건조하여 미황색의 분말을 얻었다. 다시 이 분말을 400ml의 cold-ethanol을 넣고 진탕 시킨 후 정치 decantation에 의하여 상층액을 버리고 잔사를 250ml의 무수 ethanol로 2회 세척한 다음 잔사를 황산 desicator에서 건조하여 crude alliin을 얻었다.
표준용액을 이용하여 검량곡선을 작성하고 HPLC 로 분석하였다.
대상 데이터
Table 2는 각 용매분획에 대한 항균활성을 검색한 것이며, 유효성이 나타난 에탄올 추출물을 alliin과 더불어 본 실험에 사용하였다.
기기로는 rotary vacum evaporator(Eyela, Japan), DU-64 UV/VIS spectrophotometer(Bechman Co., Germany) 및 Novaspec Ⅱ spectophotometer (Pharmacia LBK Co., U.K.)를 사용하였다.
미생물 실험에 필요한 배지로는 Difco 제품을 사용하였고, L-cysteine, 1,1 -diphenyl-2-piciylhydrazyl(DPPH) 등은 일급 시약을 사용하였다.
본 실험에서 사용한 마늘 (Allium sativum L.)은 한지형의 충남 서산종으로 산지에서 구입 정선하여 시료로 사용하였다.
사용하였다. 본 연구에서는 마늘의 주요 성분인 allicin과 용매분획물에서 항균성적이 검색된 에탄올 추출물이 미생물 생육에 미치는 영향을 연구하기 위하여 gram(양성세균) 균인 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus와 gram(음성세균) 균인 Eubacterium limonsum, Bacteroides fragilis, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli를 사용하였다.
사용한 균주는 한국식 품위 생 연구원으로부터 분양받아 사용하였다. 본 연구에서는 마늘의 주요 성분인 allicin과 용매분획물에서 항균성적이 검색된 에탄올 추출물이 미생물 생육에 미치는 영향을 연구하기 위하여 gram(양성세균) 균인 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus와 gram(음성세균) 균인 Eubacterium limonsum, Bacteroides fragilis, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli를 사용하였다.
상층액을 원심분리한 후 감압농축하고 미리 냉각시킨 ethanol을 가하여 백색의 침전을 얻었으며, 황산데시케이터 내에서 감압 건조하고, 탈이온수를 사용하여 녹인 후, acetone 을 사용하여 3회 이상 재결정하여 alliin을 얻었다. 생마늘에 대하여는 박피, 수세, 건조시킨 시료 1kg을 120C의 autoclave에서 15분간 증숙하여 마쇄한 후 3L 의 ethanol로 추출, 여과하였다. 다시 잔사를 80% ethanol로 추출, 여과하여 두 여액을 합하여 50℃ 이하에서 rotary vacum evaporator 감압농축하였다.
실험에 사용된 시약 methanol, ethanol, n-hexane, ethyl acetate, ether 및 acetone 등은 1 급 이상의 시약을 사용하였다.
성능/효과
Tabel 1과 같이 마늘에서 alliin의 분리했을 때 동결건조 시료의 수율이 82%, 신선한 시료가 74%, 건조된 시료가 69%로 동결건조시료의 수율이 가장 높았으며, 이는 효소 반응계에 있어 효소적인 분해를 최소화하였기 때문인 것으로 사료된다.
Table 3에서 보는 바와 같이 alliin 첨가량이 20, 000 ppm인 경우에는 균주 S. aureus, E. limonsum, B. fragilis, S. typhimurium, S. sonnei, E. coli 등에서 80~100%의 억제효과를 보였으며, 균주 B. subtilis, S. typhi, E. cloacae, P. aeruginosa 에 있어서는 50~80%의 억제를, 그리고 K. pneumoniae는 50% 미만의 억제효과를 보였다. 이는 이 등25)의 에탄올 추출물의 농도별 항균효과 측정연구의 쑥에 대한 l,000ppm에서 증식이 완전히 억제된 결과와는 낮은 효과로 비교되어지나, 균주에 따라 다양한 항균효과가 있는 것으로 보아 특정 성분을 검색, 분리, 정제할 경우 상당한 효과가 기대된다.
에탄올 추출물 시료를 조제하여 사용하였다. 마늘에는 alliin의 함량은 0.34~0.73% fresh weight를 나타내고 에탄올 추출물의 시료에서 동결건조 시료 수율이 가장 높았는데 이는 효소적 분해가 최소화 되는 것으로 사료되며 에탄올 추출물의 향균효과는 Table 3 에서 각 균주에 대하여 억제효과는 각 균주에서 50~ 80% 효과를 보았고, 각종 균에 대한 억제차원에서 향균성을 달리하는 것을 알 수 있었으며 유해세균에 대한 향균작용이 마늘 추출물은 미생물의 발육저지력이 강하고 지속적으로 인체에 무해하므로 보존료 개발이 바람직함을 알았고, 독특한 향미를 주는 황화합물이 많아 산도의 증가와 관계없이 항균력이 강함을 보았고, 각종 균에 대한 항균성을 달리 하는 것을 알 수 있었다. 이로 인해 마늘성분중 선택적인 항균물질의 개발이 요구됨을 알았다.
위의 결과를 통해서 마늘의 alliin의 함량은 0.34 ~ 0.73% fresh weight로 나타났다.
위의 실험결과들로부터 마늘성분의 각종 균에 대한 생육억제 차원에서의 항균성을 고찰한 결과, 각종 균에 대하여 항균성을 달리하는 것을 알 수 있었으며, 이것은 그 성분이 각종 균에 대하여 특이적으로 반응한 결과라고 사료된다. 따라서 균에 대한 특이적인 억제물질로서의 마늘 성분 중 선택적인 항균물질의 개발이 요구된다.
이는 기질이며 전구체인 alliin에 대한 고찰은 이전의 실험에서 고려의 대상으로 삼지는 않았으나 본 연구결과에 나타난 바와 같이 함황아미노산으로서 alliin과 에탄올 추출물이 항균작용에 관여한다고 볼 수 있겠다. 특히 식중독 및 화농증을 야기하는 원인균으로 알려져 있는 포도상 구균인 S. aureus에 대하여 에탄올 추출물이 alliin 보다 효과가 있었다.
후속연구
따라서 균에 대한 특이적인 억제물질로서의 마늘 성분 중 선택적인 항균물질의 개발이 요구된다. 또한 유해세균에 대한 항균작용의 특성은 마늘 추출물이 장내 유산균에 대한 증식인자가 된다는 보고27)와 견주어 볼 때 항균성 이상의 가치를 제고해 볼 수 있을 것으로 생각되며, 마늘 추출물은 미생물의 발육저지력이 강하고 확실하며, 지속적이며, 인체에 무해하고 장기적으로 사용하여도 해가 없으므로 보존료로 개발하는 것도 바람직할 것으로 보인다.
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