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문제 정의
- 천연물 유래 활성성분의 효과적인 탐색과 효과적인 추출·분리를 위해서는 추출시간, 추출제의 종류, 추출 용매비 등 추출조건에 따른 추출특성에 대한 검토가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 야생초의 하나인 소리쟁이 뿌리의 일련의 기능성 연구의 일환으로 증류수와 에탄올 및 메탄올 등 몇 가지 용매를 단독 혹은 혼합사용하여 소리쟁이 추출물의 가용성 고형분(soluble solid)의 추출실험을 행하여 실험 조건에 따른 추출속도 및 추출함량을 측정함으로써 추출특성을 검토하였다.
제안 방법
- 본 연구에서도 60 분 이후에도 추출량의 작은 증가추세를 보이고는 있지만 그 변화가 그다지 크지는 않았다. 따라서 이후의 실험에서 경시변화 고찰이 아닌 경우에는 추출시간을 1시간으로 하여 실험하였다.
- 또한 각 추출 여액을 진공증발하여 얻은 고형분 시료 30 mg을 취하여 6 N HCl 10 mL를 가하고 110℃에서 24 시간 가수분해한 다음 GF/C를 이용하여 감압여과하고, 여액을 농축한 뒤 pH 2.2의 citrate phosphate 완충용액을 이용하여 10 mL로 정용한 후 일정량을 취하여 아미노산 자동분석기(S433 Sykam, Germany)를 이용하여 추출액 중의 유리 아미노산의 함량을 측정하였다(Jeong, 2011). 유리아미노산 분석 조건은 Table 1에 나타내었다.
- 몇 가지 용매에 의한 소리쟁이 뿌리의 가용성 고형분의 용매추출에 있어 추출물의 탁도와 아미노산 함량 및 추출조건에 따른 추출속도 등을 고찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 추출된 각 시료 여액의 탁도를 자외선 분광광도계(V-570, Jasco)로 파장 650 nm에서 측정하여 비교하였으며, 여액 일정량을 시계접시에 취하여 105℃에서 1시간 동안 항온건조 및 30 분간 데시케이터 방냉 조작을 반복하여 항량이 될 때까지 무게를 측정하여 여액 중의 가용성 고형분의 함량을 결정하였으며, 추출조건에 따른 고형분 함량의 경시변화를 측정하여 추출속도로 하였다(Jeong, 2011). 별도로 pH 3~10으로 조절된 완충용액을 추출 용매로 사용하여 pH에 따른 추출속도를 비교하였다.
- 추출된 각 시료 여액의 탁도를 자외선 분광광도계(V-570, Jasco)로 파장 650 nm에서 측정하여 비교하였으며, 여액 일정량을 시계접시에 취하여 105℃에서 1시간 동안 항온건조 및 30 분간 데시케이터 방냉 조작을 반복하여 항량이 될 때까지 무게를 측정하여 여액 중의 가용성 고형분의 함량을 결정하였으며, 추출조건에 따른 고형분 함량의 경시변화를 측정하여 추출속도로 하였다(Jeong, 2011). 별도로 pH 3~10으로 조절된 완충용액을 추출 용매로 사용하여 pH에 따른 추출속도를 비교하였다.
- 추출물 조제와는 별도로 소리쟁이 뿌리의 일반성분을 측정하였다. AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법에 준하여 수분은 105℃에서 상압가열건조법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 micro-Kjeldahl법, 회분은 550℃에서 직접회화법으로 각각 분석하였고, 그 결과 Table 2와 같이 조지방함량이 2.
대상 데이터
- 실험에서의 생체재료는 경남 밀양과 부산 기장지역의 하천가에 자생하는 소리쟁이를 전초로 채취하여 세척 후 뿌리를 선별해서 1 cm 크기로 세절하여 3개월간 음건한 것을 추출용 건체시료로 사용하였다.
- 추출용매로는 증류수와 99% 에탄올 및 메탄올 등을 단독 또는 일정 비율로 혼합하여 사용하였으며, 삼각플라스크에 일정량의 건조 시료를 칭량하고, 시료량에 대한 용매의 비를 10~50 배의 범위로 가한 후 항온 플라스크 진탕기(KMC-1205, Vision Science)에서 환류추출하였다(Jeong, 2011). 온도 25~70℃, 추출시간 1~5 시간, 용매의 조성변화 등 몇 가지 조건하에서 소리쟁이 뿌리 건체시료를 추출하여 추출액을 얻었고, 이를 GF/C로 흡인여과하여 시료 여액을 얻었다(Jeong, 2011).
성능/효과
- 25℃에서 3시간 동안 증류수 만의 용매에 의한 추출의 경우 185 mg/g의 고형분 함량을 보였으나 증류수와 메탄올이 50%씩 조성된 혼합용매의 경우에는 133.5 mg/g의 값으로 감소하였고, 75%의 메탄올을 함유한 혼합용매에 의해서는 118 mg/g으로 감소하였다. 더욱이 증류수에 에탄올을 혼합하였을 때는 메탄올을 혼합한 경우보다 고형분 추출함량이 더욱 낮아 50% 에탄올 혼합조성의 경우 116.
- 한편 몇 가지 조건에서의 추출물 시료 여액 중의 유리 아미노산 함량을 아미노산 분석기로 분석하고 그 결과를 Table 4에 나타내었다. 25℃에서 에탄올과 메탄올 및 에탄올-메탄올 혼합용매로 1시간과 3시간 동안 추출한 경우[E25-1, M25-1 및 ME25-3]에는 추출물로 유리되는 아미노산의 종류는 모두 15종으로 검출되었으며, 그 농도는 에탄올 용매의 경우 3.61 mg/L, 메탄올 용매의 경우 10.15 mg/L, 그리고 메탄올-에탄올 혼합용매의 경우 6.24 mg/L로 검출되었다. 아미노산의 함량은 용매의 종류에 따라 다소간의 차이는 있으나 glutamic acid>proline>aminobutyric acid>alanine 등의 순서로 나타났다.
- 90%의 순으로서 알코올 용매의 경우와 유사하게 glutamic acid의 함량이 가장 높았다. 25℃와 50℃에서의 유리 아미노산 총농도는 추출온도가 높을수록 높게 나타나 각각 70.84 mg/L 및 79.79 mg/L으로 분석되었으며, 이들 값은 알코올 용매의 경우보다 약 7~22 배에 해당하는 함량이었다.
- 추출물 조제와는 별도로 소리쟁이 뿌리의 일반성분을 측정하였다. AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법에 준하여 수분은 105℃에서 상압가열건조법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 micro-Kjeldahl법, 회분은 550℃에서 직접회화법으로 각각 분석하였고, 그 결과 Table 2와 같이 조지방함량이 2.58%로서 가장 낮았으며, 수분, 조단백질 및 조회분의 함량이 각각 6.13, 5.59 및 7.39%이었고, 나머지는 식이 및 비식이 섬유로 간주하였다.
- pH 3에서는 296.5 mg/g의 함량으로 가장 높은 추출량을 보였으나 pH가 증가함에 따라 추출량이 감소하여 pH 7에서는 263.5 mg/g을, pH 10에서는 162.5 mg/g으로 감소하였다. 앞서 동일한 조건에서 pH 조정이 없는 증류수를 사용한 경우 추출함량이 180 mg/g으로서 증류수 추출액의 pH는 7~10의 범위로 예상되었다.
- 그러나 Table 4에서 W25-1 및 W50-1로 표시된 증류수 용매의 경우에는 검출된 아미노산의 종류는 histidine과 lysine이 추가로 검출되어 모두 18종으로서 알코올을 용매로 한 경우보다 더 많은 종이 추출되었으며, 그 함량은 25℃에서 추출한 경우 glutamic acid 55.62%>proline 19.32%>alanine 4.31%> aminobutyric acid 3.90%의 순으로서 알코올 용매의 경우와 유사하게 glutamic acid의 함량이 가장 높았다.
- 시료량에 대한 추출용매의 비가 10~50 배의 범위에서 가용성 고형분의 추출함량은 용매비가 증가함에 따라 메탄올과 에탄올 용매의 경우 그다지 큰 변화는 없었으나 증류수 용매의 경우 용매비 증가에 따라 감소하였으며, 일정한 용매비에서 증류수에 대한 에탄올 혼합조성보다 메탄올 혼합조성에서 고형분 함량이 더 많이 추출되었다. 그리고 메탄올과 에탄올 용매의 경우 온도 증가에 따라 가용성 고형분의 추출함량 변화가 거의 일정하였으나 증류수 용매의 경우에는 온도 증가에 따라 추출속도가 증가하였으며, 용매의 pH 증가에 따라 추출함량은 반비례하였다.
- 그리고 소리쟁이 뿌리 분말 시료의 Hunter 색도를 색차계(CR-300, Minolta)로 측정한 결과 Table 2에 표시된 것과 같이 L=97.21, a=0.23, b=1.73인 표준판에 대하여 명도값은 다소 어두운 60.8이었으며, 적색도는 4.99, 황색도는 28.92로서 황갈색의 경향이 강하였다.
- 그리고 에탄올과 메탄올 용매의 경우 가용성 고형분의 함량이 건조 시료 1 g당 19~25 mg과 68.5~70 mg으로 상당히 낮고 또한 용매비에 따른 추출속도의 변화는 아주 작게 나타났다.
- 세 종류의 용매를 사용하여 추출시료에 대한 용매의 비를 10 배에서 50 배 범위로 변화시켜 추출액의 탁도를 측정한 결과(Table 3) 용매비가 증가할수록 탁도는 감소하였으나, 동일한 용매비에 대하여 증류수 추출물의 탁도가 가장 컸으며, 증류수>메탄올>에탄올의 순이었다. 그리고 추출온도에 따른 탁도변화는 메탄올과 에탄올의 경우에는 거의 변화가 없었으나 증류수 용매의 경우에는 추출온도가 증가할수록 탁도가 증가하였다.
- Yi 등(1996)의 구기자 추출에서 에탄올 용매가 증류수 용매보다 낮은 고형물 함량을 얻은 결과나 증류수에 대한 에탄올 농도가 높아질수록 추출되는 고형분함량이 현저히 낮아진다는 결과와 일치하는 결과를 보였다. 또한 에탄올과 메탄올 혼합조성의 용매 경우 메탄올의 조성이 증가할수록 고형분 추출함량은 완만한 증가경향을 보였으나 증류수 용매가 혼합된 경우에 비해서는 현저히 낮은 함량으로 나타났다.
- 4 mg/g, 60분에는 180 mg/g의 값을 보였다. 메탄올 용매와 에탄올 용매의 경우에는 초기 10 분까지 급격한 추출량을 보이고 그 이후 거의 일정하게 유지되었으며, 60 분에서의 추출 함량은 각각 69 mg/g과 21 mg/g의 함량으로 나타났다. 이러한 경시변화는 증류수, 증류수와 에탄올의 혼합 용매로 구기자의 가용성 고형분 함량에 대한 추출속도를 고찰한 연구(Kim 등, 2004b)에서 초기 추출량이 급격히 증가하였다가 약 100 분이 경과하여 거의 일정하게 유지되고, 증류수 용매의 경우가 가장 높은 추출량을 보인다는 결과와 거의 일치하는 결과였다.
- 25℃와 50℃ 및 75℃의 온도에서 용매별 추출속도는 증류수 180~215 mg/g>메탄올 69~76 mg/g>에탄올 21~30 mg/g의 순으로 나타났다. 메탄올과 에탄올 용매의 경우 온도 증가에 따라 가용성 고형분의 추출함량 변화가 거의 일정한 경향이었으나 증류수 용매의 경우에는 상온에서도 추출함량이 에탄올의 9배, 메탄올의 2.6배의 높은 추출량을 보였을 뿐 아니라 온도 증가에 따라 추출속도도 증가하였다. 이들 결과와 앞서 3.
- 먼저 Table 3에서 메탄올과 에탄올의 경우에는 추출시간이 경과하여도 추출액의 탁도가 거의 변화가 없었으나 증류수로 추출한 경우에는 메탄올과 에탄올 추출액보다 탁도가 훨씬 높았을 뿐 아니라 시간 증가에 따른 탁도의 증가도 상당히 큰 것으로 나타났다. 메탄올이나 에탄올의 경우 이들 용매에 가용성인 성분이 추출 초기에 충분히 추출되어 더 이상 추출시간이 경과하여도 추출량의 증가가 없어 탁도 증가가 없는 것으로 생각되었으나 증류수 용매에서는 추출온도가 상온이라 하더라도 추출시간이 증가함에 따라 더 많은 종류의 성분 혹은 더 많은 양의 물질이 추출되어 탁도가 증가하는 것으로 생각된다. 그러나 탁도의 변화가 추출량의 대소에 의해서만 결정되는 것은 아니고, 탁도가 낮아도 유용성분의 함량은 많을 수 있을 것이므로 이러한 사실의 규명에는 추가적으로 정성·정량적 분석이 수행되어야 할 것이다.
- 세 종류의 용매를 사용하여 추출시료에 대한 용매의 비를 10 배에서 50 배 범위로 변화시켜 추출액의 탁도를 측정한 결과(Table 3) 용매비가 증가할수록 탁도는 감소하였으나, 동일한 용매비에 대하여 증류수 추출물의 탁도가 가장 컸으며, 증류수>메탄올>에탄올의 순이었다.
- 소리쟁이 뿌리의 일반성분으로 수분 6.13%, 조지방 2.58%, 조단백질 5.59%, 조회분 7.39%, 나머지는 탄수화물이었으며, 추출물로 유리되는 아미노산은 메탄올과 에탄올을 용매로 하였을 때는 glutamic acid>proline>alanine>aminobutyric acid 순의 함량을 가진 15종이었고, 증류수로 추출한 경우는 이 외에 3종을 더하여 18종이 검출되었다.
- 시료량에 대한 추출용매의 비가 10~50 배의 범위에서 가용성 고형분의 추출함량은 용매비가 증가함에 따라 메탄올과 에탄올 용매의 경우 그다지 큰 변화는 없었으나 증류수 용매의 경우 용매비 증가에 따라 감소하였으며, 일정한 용매비에서 증류수에 대한 에탄올 혼합조성보다 메탄올 혼합조성에서 고형분 함량이 더 많이 추출되었다. 그리고 메탄올과 에탄올 용매의 경우 온도 증가에 따라 가용성 고형분의 추출함량 변화가 거의 일정하였으나 증류수 용매의 경우에는 온도 증가에 따라 추출속도가 증가하였으며, 용매의 pH 증가에 따라 추출함량은 반비례하였다.
- 실험 용매비 전체의 범위에서 소리쟁이 추출액 중의 가용성 고형분 추출량은 증류수>메탄올>에탄올 용매의 순서로 나타났다.
- 온도 25℃에서 건체 시료에 대한 용매비 20 배에서 추출물의 탁도는 용매에 따라 증류수>메탄올>에탄올의 순서를 보였으며, 메탄올과 에탄올 용매의 경우에는 추출 온도 증가에 따른 탁도변화는 큰 차이가 없었으나 증류수 용매의 경우 온도에 비례하여 증가하였으며, 증류수와 메탄올을 각각 50%로 혼합한 용매의 탁도가 가장 높게 나타났다.
- 6배의 높은 추출량을 보였을 뿐 아니라 온도 증가에 따라 추출속도도 증가하였다. 이들 결과와 앞서 3.2에서 고찰한 추출시간을 고려하면 추출시간은 약 1시간, 추출온도는 고온의 열수 추출물일수록 추출되는 가용성고형분의 함량이 높음을 알 수 있다. 그러나 가용성 고형분의 함량이 높다고 하여 소리쟁이 뿌리 추출물의 생리활성이 높다고 할 수는 없으므로 추출 조건에 따른 활성의 검토가 추가적으로 연구되어야 할 것으로 생각된다.
- 2에 도시한 용매의 조성에 따른 추출액의 탁도 변화를 보면 메탄올과 에탄올 용매는 Table 3에 나타낸 것처럼 각각을 단일 용매로 하여 추출한 경우에도 낮은 탁도를 보였으며, 이들을 혼합한 혼합용매의 경우에도 낮은 탁도를 보였다. 이들 두 용매를 각각 증류수와 혼합하여 혼합용매로 추출하고 그 추출액의 탁도를 비교하면 증류수에 에탄올을 혼합한 경우에는 각각을 단일 용매로 추출한 추출액 탁도의 사이값을 가졌으나, 증류수와 메탄올을 혼합하였을 때는 탁도가 큰 것으로 나타났다. 특히 증류수와 메탄올의 혼합비가 1:1인 경우 각각을 단일 용매로 사용한 경우보다 훨씬 높은 탁도가 얻어졌다.
- 5~70 mg으로 상당히 낮고 또한 용매비에 따른 추출속도의 변화는 아주 작게 나타났다. 즉 용매비 10 배의 조건에서 메탄올과 에탄올 용매에 의한 추출물 중 고형분의 함량은 각각 70 mg/g과 25 mg/g으로서 증류수 용매에 비해 38.9%와 13.9% 의 값이었다. 따라서 소리쟁이 뿌리의 추출은 메탄올이나 에탄올 용매보다 증류수 용매를 사용하면 더 많은 고형분을 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- 추출시간에 따른 고형분 함량의 변화로서 나타낸 추출속도는 시간 변화에 따라 증류수>메탄올>에탄올 용매의 순으로 나타났으며, 증류수 용매의 경우 초기 약 10 분까지 급격히 증가하다가 30 분 이후에는 완만한 증가를 보였으며, 건조 시료량에 대한 고형분의 추출함량이 30 분에는 172.4 mg/g, 60분에는 180 mg/g의 값을 보였다.
후속연구
- 2에서 고찰한 추출시간을 고려하면 추출시간은 약 1시간, 추출온도는 고온의 열수 추출물일수록 추출되는 가용성고형분의 함량이 높음을 알 수 있다. 그러나 가용성 고형분의 함량이 높다고 하여 소리쟁이 뿌리 추출물의 생리활성이 높다고 할 수는 없으므로 추출 조건에 따른 활성의 검토가 추가적으로 연구되어야 할 것으로 생각된다.
- 그러나 탁도의 변화가 추출량의 대소에 의해서만 결정되는 것은 아니고, 탁도가 낮아도 유용성분의 함량은 많을 수 있을 것이므로 이러한 사실의 규명에는 추가적으로 정성·정량적 분석이 수행되어야 할 것이다.
- 9% 의 값이었다. 따라서 소리쟁이 뿌리의 추출은 메탄올이나 에탄올 용매보다 증류수 용매를 사용하면 더 많은 고형분을 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- 식물의 뿌리나 줄기, 잎, 꽃 및 열매 등에서 만들어지는 각종 화학물질인 피토케미컬은 제 6의 영양소라 불리면서 항균작용(Park 등, 2001a), 항암작용(김과 박, 2003) 및 항산화작용(Kim 등, 2004b) 등의 각종 작용을 통하여 질병과 노화를 막아주는 등 다양한 효능을 보이고 있어 여러 약용식물(Kim 등, 2004a)이나 채소(Eum 등, 1999), 과일의 껍질이나 과피(Yoo 등, 2004) 및 해조류(Park, 2005) 등의 기능성이나 생리활성 및 이화학적 특성에 많은 연구(Jeong, 2011; Park 등, 2001b; Shon 등, 2008)가 시행되어 오고 있다. 이러한 식용 또는 약용 생물들은 갖가지 고유의 피토케미컬을 함유하고 있으므로 자원으로의 활용 가능성이 무한하지만 그 다양성 만큼 아직도 밝혀지지 않은 여러 야생 동식물로부터 유용한 물질들의 추출, 분리정제, 농축 및 활용에 대한 많은 연구가 필요하다.
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