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문제 정의
- 본 연구에서는 오이 작물의 내냉성 유전 연구를 위한 기초 작업으로 내냉성의 ‘NC76’ 계통과 감수성의 ‘GY14’ 계통 간 DNA 다형성을 기존에 개발된 995개의 오이 SSR 마커[8]를 이용하여 분석하였다.
- 오이의 냉해 저항성 연관 마커 개발을 위한 선행연구로서 ‘NC76’과 ‘GY14’ 계통 간 다형성 SSR마커를 개발하였다.
제안 방법
- ‘NC-76’와 ‘Gy14’ 간 다형성을 보이는 20개 SSR 마커를 이용하여 F2 mapping 집단 92개체의 마커 유전자형을 조사하였다.
- ‘NC76’, ‘GY14’, 그리고 두 계통 간 이형 접합체의 유전자 형을 a, b, 그리고 h기호로 각각 표시하고 Joinmap4 software (Plant Research international, Wageningen, The Netherlands)를 이용하여 마커 연관분석과 유전지도 작성을 수행하였다.
- 20개의 SSR 마커를 대상으로 92개체로 구성된 F2 집단의 분리양상을 조사하여 연관 지도를 작성 하였다. 20개 중 13개의 마커가 연관군을 구성하였으며(Fig.
- CTAB 방법을 이용하여 얻은 ‘NC76’와 ‘GY14’ DNA를 995 개 SSR 프라이머[8]를 이용하여 PCR 증폭을 하였다.
- HRM분석은 PCR 산물을 75℃에서→90℃로 천천히 heating 시키면서 매 0.3℃ 상승시점 시 형광발광 정도를 측정하여 DNA 샘플 간 melting 온도 차이에 대한 변이곡선을 통해 분석하였다.
- Seoul, South Korea)을 사용하여 HRM분석하였다. 각 SSR 마커의 PCR 수행 시 fluorescent dye의 일종인 Evagreen (Solgent, Seoul, South Korea)을 첨가하여 PCR 증폭산물을 형광표식하였다. HRM분석은 PCR 산물을 75℃에서→90℃로 천천히 heating 시키면서 매 0.
- 오이의 냉해 저항성 연관 마커 개발을 위한 선행연구로서 ‘NC76’과 ‘GY14’ 계통 간 다형성 SSR마커를 개발하였다. 기존 agarose gel 전기영동방법으로 총 145개의 다형성 마커를 개발할 수 있었고, HRM 기술을 이용하여 다형성 마커 30개를 부가적으로 확인하였다. 개발된 총 175개의 다형성 SSR 마커들은 실질적으로 오이 육종재료 및 유전자원 분석과 품종 판별용 마커로 활용될 수 있으며 오이 냉해 저항성 유전자지도 작성 및 연관마커 개발에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 하지만 최근에 개발된 high resolution melting analysis 기술은 단 한 개의 염기 서열 차이에 의하여 달라지는 melting 온도를 구분해 줌으로써 염기서열 분석 없이 SSR 증폭 DNA 조각의 염기서열 차이를 보여줄 수 있다[11]. 따라서 이번 조사에서 2% agarose gel에서 크기 차이가 보여지지 않는 SSR 마커(Fig. 1)들을 대상으로 HRM 분석을 수행하였다. Fig.
- 본 연구에서는 오이 작물의 내냉성 유전 연구를 위한 기초 작업으로 내냉성의 ‘NC76’ 계통과 감수성의 ‘GY14’ 계통 간 DNA 다형성을 기존에 개발된 995개의 오이 SSR 마커[8]를 이용하여 분석하였다. 또한 agarose gel 전기연동에서 길이 다형성이 확인되지 못한 SSR 마커들에 대해서는 HRM 기술을 적용하여 다형성 존재를 재확인하였다. 오이의 고밀도 유전자 지도 작성을 위한 선행연구로서 20개 다형성 SSR 마커를 선발 하여 이들의 유전적 연관성(genetic linkage)을 분석하였다.
- 또한 agarose gel 전기연동에서 길이 다형성이 확인되지 못한 SSR 마커들에 대해서는 HRM 기술을 적용하여 다형성 존재를 재확인하였다. 오이의 고밀도 유전자 지도 작성을 위한 선행연구로서 20개 다형성 SSR 마커를 선발 하여 이들의 유전적 연관성(genetic linkage)을 분석하였다.
- 집단을 형성하였다. 오이의 어린 잎을 수확하여 -70℃ 냉동고에 보관한 후 CTAB 방법을 이용하여 total genomic DNA를 추출 하였다 [6,10]. 곱게 분쇄된 시료에 CTAB buffer를 750 μl을 가하고 30초 vortexing 한 후 60℃에서 1시간 배양하였다.
- 전기영동 상에서 ‘NC-76’와 ‘Gy14’ PCR 증폭산물의 크기가 동일한 SSR 마커를 대상으로 Rotor-Gene Q6000 (QIAGEN Co. Seoul, South Korea)을 사용하여 HRM분석하였다.
- PCR은 93℃에서 3분 후 93℃에서 30초, 50℃에서 1분, 68℃에서 1분 과정을 40회 반복하고, 72℃ 7분 후 종료 또는 5℃에서 보관되었다. 증폭된 DNA는 2% agarose gel에서 전기영동 후 EtBr로 염색하여 UV광과 디지털 카메라를 통해 확인하였다.
- 본 실험에는 2%의 agarose gel을 사용한 전기영동을 수행하였는데 이는 PCR 증폭된 DNA 조각의 1 또는 2 염기 크기 차이를 구분하기에는 적당하지 않은 DNA 분리 방법이다. 하지만 3염기 크기 차이 구분은 충분히 가능하므로 polyacrylamid gel에 비해 비교적 이용이 쉽고 가격이 저렴한 agarosel gel분석으로 SSR 마커의 크기 다형성을 구분하였다.
- 확인된 다형성 SSR 마커가 추 후 ‘NC76’와 ‘GY14’ 교배 집단에서 유전자 지도 작성용 마커로 사용이 가능한지 알아보기 위하여 각 145개 다형성 마커의 7개 오이 연관 그룹[8] 상에서의 분포를 조사해 보았다.
대상 데이터
- 내냉성 오이 계통 ‘NC76’와 냉해 감수성인 ‘GY14’ 계통 간 DNA 다형성을 총 995개 SSR 마커[8]를 이용하여 스크리닝하였다.
- 미국 위스콘신 주립대학교에서 분양 받은 오이 ‘NC76’와 ‘GY14’ 계통의 종자를 온실에서 발아시켜 키운 후 교배하여 F1 종자를 수확하고 다시 자가수분하여 F2 집단을 형성하였다.
- 이와 같은 방법으로 총 145개의 ‘NC76’ 과 ‘GY14’ 간 다형성 SSR 마커를 개발 할 수 있었다(Table 1). 본 연구에 사용한 995개 SSR 마커들이 C. s. var hardwickii (R.
- 1B)는 두 DNA 샘플 간 melting curve에 있어 차이를 보여줌으로써 다형성 마커로 사용될 수 있음을 보여준다. 이와 같은 방법으로 총 30개의 다형성 SSR 마커를 HRM 기술을 이용하여 개발 할 수 있었다(Table 2). Ren 등[8]이 보고한 유전자 지도상에 이들 마커들의 위치를 파악한 결과, 이들 마커 역시 다양한 연관그룹에 고루 분포함을 확인할 수 있었다.
데이터처리
- ‘NC76’, ‘GY14’, 그리고 두 계통 간 이형 접합체의 유전자 형을 a, b, 그리고 h기호로 각각 표시하고 Joinmap4 software (Plant Research international, Wageningen, The Netherlands)를 이용하여 마커 연관분석과 유전지도 작성을 수행하였다. 마커의 분리 비를 확인하기 위하여 X2 (chi-square) goodness-of-fit test를 수행하였다. 연관군 분석(grouping)은 independence LOD를 2.
이론/모형
- 마커의 분리 비를 확인하기 위하여 X2 (chi-square) goodness-of-fit test를 수행하였다. 연관군 분석(grouping)은 independence LOD를 2.0에서 10범위에서 1 스텝 조건으로 수행되었고 mapping algorithm은 Maximum Likelihood mapping function을 사용하였다.
성능/효과
- 20개 중 13개의 마커가 연관군을 구성하였으며(Fig. 2), 또한 Ren 등[8]의 유전지도에서 동일한 연관군에 속했던 마커들이 본 연관 분석에서도 같은 군에 연관되어 있음을 확인할 수 있었다.
- DNA 샘플로서 왼쪽에 ‘NC76’ 그리고 오른 쪽에 ‘GY14’ DNA가 위치하며 1부터 12번 까지는 총 12개 SSR 마커의 PCR 증폭 후 전기영동 결과이다.
- 마커 1번, 8, 9, 10, 그리고 11번에서 증폭된 DNA 크기 차이를 관찰할 수 있으므로 이들 마커를 ‘NC76’와 ‘GY14’ 간 공우성 마커로 사용이 가능함을 알 수 있다.
- 연관그룹 1번에 15개, 2번에 15개, 3번에 27개, 4번에 21개, 5번에 26개, 6번에 27개, 7번에 13개의 SSR 마커가 위치하고 있었고 이는 본 연구에서 개발된 145개의 다형성 SSR 마커가 ‘NC76’와 ‘GY14’ 오이 교배 집단 게놈에서 위치적으로 고루 분포하고 있음을 확인할 수 있으므로 이들 마커가 현재 확보된 교배집단의 유전자 지도를 작성하는 데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
- 이와 같은 방법으로 총 145개의 ‘NC76’ 과 ‘GY14’ 간 다형성 SSR 마커를 개발 할 수 있었다(Table 1).
후속연구
- 기존 agarose gel 전기영동방법으로 총 145개의 다형성 마커를 개발할 수 있었고, HRM 기술을 이용하여 다형성 마커 30개를 부가적으로 확인하였다. 개발된 총 175개의 다형성 SSR 마커들은 실질적으로 오이 육종재료 및 유전자원 분석과 품종 판별용 마커로 활용될 수 있으며 오이 냉해 저항성 유전자지도 작성 및 연관마커 개발에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 2) 이는 마커 간 유전 거리가 너무 멀어서 충분히 신뢰할 만한 연관성을 보이지 못하였거나 마커 사이를 연결해 줄 수 있는 마커의 부재에 인한 것으로 생각된다. 따라서 차 후 더 많은 다형성 마커들을 본 F2 mapping 집단에 적용함으로써 통계적으로 신뢰가 가능한 연관성이 이들 마커들 간에 회복 될 수 있을 것으로 판단된다.
- 0~12℃ 정도에는 병해에도 약하기 때문에 세균성, 곰팡이성 전염에 의해 피해를 입을 수 있으므로 오이의 내냉성 유전자가 관심의 대상이 되고 있다[2,4,5]. 이러한 냉해 저항성 유전자는 작물의 생산성을 증가시키고 작물의 재배 가능 지역을 확장하는데 도움을 줄 수 있으므로 내냉성 육종을 위한 유전자 탐색 및 연관 마커 개발 연구가 필요하다고 판단된다.
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