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문제 정의
- 병리조직학적 소견을 관찰한 결과, 산양삼을 투여한 생쥐의 간장, 신장, 심장 및 고환은 정산군과 같은 범위의 소견이 관찰되어 조직손상이 없는 것으로 나타났다. 본 산양삼의 반복투여 독성실험은 산양삼의 안정성을 평가하여 임상적 용약의 안전을 확보하기 위한 것으로, 5주간의 산양삼 4.4 g/kg/day 연속투여는 생쥐에 있어 독성을 유발하지 않았다.
- 이에 저자는 CP로 유발된 장기독성 보호효과를 확인하기 위하여, ‘의약품 독성시험 기준’에 의거하여 산양삼에 대한 반복투여 독성실험을 시행하였고, CP를 투여하여 만성독성을 유발시킨 생쥐에 산양삼 추출액을 병용 투여하여 체중과 장기 및 고환을 중심으로 CP의 독성에 미치는 영향을 연구하였다.
- 이에 저자는 기존의 연구를 통하여 보고된 산양삼의 효과가 인체의 正氣를 補益함으로써 저항력 또는 면역력을 증강시켜 邪氣에 대한 방어능력과 질병으로부터의 회복을 촉진할 것으로 예상하고, 항암제 CP의 독성에 미치는 산양삼의 영향을 체중과 장기의 병리조직학적 변화를 중심으로 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 88 g(10뿌리)을 round flask에 넣고, 증류수 450 ㎖을 가하여 3시간 동안 가열 추출하였고, 추출액을 micro syringe filter(0.2 μm)로 여과하여 최종 400 ㎖의 추출액을 만들었다.
- 5 ㎖) six days in a week for five weeks. CP+WG group received CP(100 ㎎/㎏) once in a week and WG(20 ㎖/㎏) six days in a week for five weeks. WG group received WG(20 ㎖/㎏) six days in a week for five weeks.
- CP는 실험시작부터 복강주사하여 1주 간격으로 총 5회 투여되었고, 산양삼 추출액은 실험시작 후 5주가 될때까지 매일 복강 투여 하였다. CP는 혈액학적 결함없는 환자에게 40-50 ㎎/㎏으로 통상 2-5일 동안 분할 투여하는데, 본 실험에서는 100 ㎎/㎏을 1주에 1회씩 총 5회 복강투여하여 약물 독성을 유발시켰다.
- CP는 실험시작부터 복강주사하여 1주 간격으로 총 5회 투여되었고, 산양삼 추출액은 실험시작 후 5주가 될때까지 매일 복강 투여 하였다. CP는 혈액학적 결함없는 환자에게 40-50 ㎎/㎏으로 통상 2-5일 동안 분할 투여하는데, 본 실험에서는 100 ㎎/㎏을 1주에 1회씩 총 5회 복강투여하여 약물 독성을 유발시켰다.
- 5㎖) six days in a week for five weeks. Control group received CP(100 ㎎/㎏) once in a week and normal saline(0.5 ㎖) six days in a week for five weeks. CP+WG group received CP(100 ㎎/㎏) once in a week and WG(20 ㎖/㎏) six days in a week for five weeks.
- Hematoxylin & Eosin 염색된 고환 절편의 단면적을 칼라영상분석기(Media Cybernetics, Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 측정하였다.
- Hematoxylin & Eosin 염색된 고환 조직에서 정세관의 단경 및 장경의 길이가 20% 이상 차이가 나지 않는 비교적 원형에 가까운 정세관 10개를 임의로 선택해서 그 직경을 측정하고 평균치를 구하였다.
- 600배 희석한 Anti-BrdU(Roche, Germany) antibody로4 에서 15시간 반응시키고, biotinlated 2nd antibody(Vector Laboratoris, USA)로 30분간 반응시켰으며, ABC 용액(Vector Laboratoris, USA)에서 30분간 반응시키고 DAB로 10분간 발색시켰다. Hematoxylin 액으로 대조염색을 실시한 BrdU 양성반응의 정도를 관찰하였다.
- 각 실험군은 생쥐 6마리를 한 군으로 하여 정상군(Normal group)은 생리식염수만 복강투여 하였고, 대조군(Control group) 은 cyclophosphamide(CP, Sigma Co.,USA)와 생리식염수를 복강투여 하였으며, 산양삼실험군(CP+WG group)은 CP와 산양삼 추출액을 복강투여 하였고, 산양삼대조군(WG group)은 산양삼 추출액만 복강투여 하였다.
- 실험 종료일에 모든 개체를 부검하여 적출한 간장, 신장, 심장 및 고환을 Bouin's solution에 24시간 고정하였다. 간장은 우 엽의 동일한 부위를, 신장은 횡단면을, 심장은 심실의 횡단면을, 고환은 정중단면 제작하여, 통상적인 처리과정을 거쳐 파라핀 포매하였다. 포매조직을 5 ㎛ 두께로 절편하여 Hematoxylin-Eosin 염색하고 일반적인 병리조직학적 소견을 관찰하였다.
- 본 시험은 실험시작에서부터 1주에 1회씩 총 5회 CP를 복강 투여하여 장기독성을 유발시키고, 실험시작에서부터 5주째까지 매일 산양삼 추출액(WG)을 복강투여 하여, 산양삼이 CP로 유발된 생쥐의 장기독성에 대한 방어효과가 있는지를 확인하였다.
- 생리식염수는 1회 투여량을 0.5 ㎖로 하였고, CP는 증류수에 녹여 1회 투여량을 100 ㎎/㎏의 농도로 투여하였으며, 산양삼 추출액은 1회 투여량을 20 ㎖/㎏의 농도로 투여하였다. 각 실험군에 대한 상세한 투여방법은 Fig.
- 둘째, 화학요법 약물과 병용 투여하였을 때 항암효과를 증가시키고 방사선요법의 민감성을 증강시키는 한약물에 대한 연구는 주로 活血化瘀 약물에서 주로 연구되었다24,25). 셋째, 항암치료에 의하거나 기저질환으로 인해 전신기능이 쇠퇴하고 중요기관의 기능부전이 동반된 경우에는 개체의 면역기능의 제고에 초점을 맞추어 健脾益氣, 溫補養陰 등 扶正固本치법을 활용하였다26,27). 扶正固本의 치법은 특히 세포성 면역기능을 촉진시키고 뇌하수체-부신피질 기능 증강, 세포내 정보전달에 관연하는 cAMP와 cGMP 비율의 조정, cAMP의 상대치 증가, 골수 조혈기능의 증가, 소화기능 개선 및 증가, 장기손상의 억제 등의 효과를 나타내었다8).
- 실험 0주부터 매주 모든 개체의 체중을 측정하였다.
- 실험 5주에 모든 개체를 ether로 가볍게 마취시키고 심장에서 채혈한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심하여 혈청을 분리하였으며, 전자동생화학분석기(Hitachi 7150, Japan)를 이용하여 CPK, AST, ALT, creatinine 및 BUN의 함량을 측정하였다.
- 실험 5주에 모든 개체를 부검하여 심장, 간장, 신장 및 고환을 적출하였으며 장기에 부착된 결합조직을 제거한 후 각 장기의 중량을 측정하였다.
- 실험 종료일에 모든 개체를 부검하여 간장, 신장, 심장 및 고환을 파라핀 포매하여 염색후 병리조직학적 소견을 관찰하였다. CP의 약물 독성에 대한 보고에 따르면, 드물게 간장애와 간염이 보고되었고, 이 약에 의해 유도된 심독성은 심근병증과 심부전에 이르기까지 광범위한 심장효과를 나타내며, 매우 드물게 치명적인 결과를 초래하였다.
- 실험 종료일에 모든 개체를 부검하여 적출한 간장, 신장, 심장 및 고환을 Bouin's solution에 24시간 고정하였다.
- 탈파리핀과정과 함수과정을 거친 고환 조직을 0.05 M PBS(pH 7.4)로 수세한 후 BrdU 면역조직화학 염색을 실시하였다. 조직을 37℃ 2N HCl 용액에 담가 1시간 반응시키고, 0.
- 간장은 우 엽의 동일한 부위를, 신장은 횡단면을, 심장은 심실의 횡단면을, 고환은 정중단면 제작하여, 통상적인 처리과정을 거쳐 파라핀 포매하였다. 포매조직을 5 ㎛ 두께로 절편하여 Hematoxylin-Eosin 염색하고 일반적인 병리조직학적 소견을 관찰하였다.
대상 데이터
- 山養蔘(Wild Ginseng, WG)은 농림수산식품부 지원 소백산 산하산삼(사업자등록번호 512-81-12819)에서 구입하였다. 88 g(10뿌리)을 round flask에 넣고, 증류수 450 ㎖을 가하여 3시간 동안 가열 추출하였고, 추출액을 micro syringe filter(0.
- 체중 25 g 내외의 BALB/c 수컷 생쥐(샘타코, 한국)를 구입하여 온도 23±1℃, 습도 50±5%로 조정된 세명대학교 청정동물사육실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 측정된 항목의 결과에 대한 통계는 SPSS(SPSS 10.1 for Windows, USA)를 이용하여 student's t-test를 실시하여 검증하였다.
성능/효과
- 대조군에서는 양성반응이 관찰되는 정세관이 정상군에 비해서 감소되었으며, 양성반응을 보인 정조 세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었다. CP+WG군에서는 양성반응이 관찰된 정세관은 대조군에서와 유사하게 관찰되었으나, 양성반응을 보인 정조세포는 대조군 보다 치밀하게 관찰되었다. WG군은 정상군과 유사한 정도로 BrdU 양성반응이 확인되었다(Fig.
- 정상군에 비하여 대조군에서는 CPK와 AST가 유의성 있게 증가되었고 ALT, creatinine 및 BUN은 유의한 변화가 없었다. CP+WG군은 대조군에 비하여 CPK, AST 및 BUN은 유의성 있게 감소되었고 ALT와 creatinine은 유의한 변화가 없었다. WG군은 정상군에 비하여 모든 측정치에 유의한 차이가 없었다(Fig.
- 고환 단면적과 정세관의 직경을 측정하고 고환조직에서의 BrdU 발현 양상을 비교해 보았는데, 정상군에 비하여 CP를 투여한 대조군에서 고환의 단면적과 정세관의 직경이 정상군에 비하여 모두 유의성 있게 감소되었고, 산양삼 추출물 병용투여군은 대조군에 비하여 정세관 직경의 감소가 유의성 있게 억제되었다. CP만 투여한 대조군에서 BrdU 양성반응이 관찰되는 정세관이 정상군에 비해 감소되었으며, 양성반응을 보인 정조세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었다. 산양삼 추물물 병용투여군에서는 양성반응이 관찰된 정세관은 대조군과 유사하에 관찰되었으나, 양성반응을 보인 정조세포는 대조군보다 치밀하게 관찰되어, CP가 고환 독성을 유발하였으나 산양삼 추출물 병용투여로 인해 고환 독성을 방어한 것으로 판단된다.
- 장기중량을 측정한 결과 심장의 무게가 정상군에 비하여 유의성 있게 억제되었으나, CPK는 정상군에 비해 유의한 차이 없이 낮게 측정되어 심근손상의 증거는 없었다. 간장, 신장의 무게는 정상군과 유의한 차이가 없었고, AST, ALT, creatinine, BUN은 산양삼 투여군에서 정상군에 비해 오히려 낮게 측정되었으나 유의성은 없었다.
- 본 실험에서는 병리조직학적으로 간장, 신장, 심장에서는 정상군과 큰 차이를 발견하지 못하였고, 고환에서는 CP를 투여한 대조군에서 상피세포의 증식이 감소되고 정세관의 내부 공간이 정상군에 비해서 확장되었으며, 부위에 따라서 정세관 상피세포가 괴사 및 탈락되어 있었다. 고환 단면적과 정세관의 직경을 측정하고 고환조직에서의 BrdU 발현 양상을 비교해 보았는데, 정상군에 비하여 CP를 투여한 대조군에서 고환의 단면적과 정세관의 직경이 정상군에 비하여 모두 유의성 있게 감소되었고, 산양삼 추출물 병용투여군은 대조군에 비하여 정세관 직경의 감소가 유의성 있게 억제되었다. CP만 투여한 대조군에서 BrdU 양성반응이 관찰되는 정세관이 정상군에 비해 감소되었으며, 양성반응을 보인 정조세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었다.
- . 기존 연구에서는 체중 감소와 식이 섭취량이 비례한 것을 체중 감소의 원인으로 파악하였는데, 본 연구에서는 식이 섭취량을 파악하지 않아 정확한 원인은 알수 없으나, 산양삼 추출액을 병용투여한 산양삼군에서는 대조군에 비하여 체중 감소가 유의성 있게 억제되어 산양삼이 CP에 의한 전신독성 혹은 소화기능 억제를 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
- 정상군의 고환조직에서 BrdU 양성반응은 대다수의 정세관에서 발현되었으며, 발현된 정세관의 대부분의 정조세포에서 강한 양성반응이 확인되었다. 대조군에서는 양성반응이 관찰되는 정세관이 정상군에 비해서 감소되었으며, 양성반응을 보인 정조 세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었다. CP+WG군에서는 양성반응이 관찰된 정세관은 대조군에서와 유사하게 관찰되었으나, 양성반응을 보인 정조세포는 대조군 보다 치밀하게 관찰되었다.
- 정상군의 고환조직은 모든 발육 단계의 정세관이 활발한 증식상태에 놓여 있으며, 정세관 상피세포(정조세포, 정모세포, 정자세포)가 치밀하게 증식되어 있었다. 대조군에서는 정세관 상피세포의 증식이 정상군에 비해서 다소 감소되어 정세관의 내부 공간이 정상군에 비해서 넓게 관찰되었으며, 부위에 따라서는 정세관 상피세포가 괴사 및 탈락되어 있었다. CP+WG군에서의 병리 조직학적 소견은 대조군에서와 유사하게 관찰되었다.
- 병리조직학적 관찰에서 대조군은 고환조직에서 정조세포의 BrdU 양성반응이 관찰되는 정세관이 감소되었으며 양성반응을 보인 정조세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었고, CP+WG 군은 양성반응이 관찰된 정세관은 대조군에서와 유사하게 관찰되었으나 양성반응을 보인 정조세포는 대조군 보다 치밀하게 관찰되었다.
- 병리조직학적 소견을 관찰한 결과, 산양삼을 투여한 생쥐의 간장, 신장, 심장 및 고환은 정산군과 같은 범위의 소견이 관찰되어 조직손상이 없는 것으로 나타났다. 본 산양삼의 반복투여 독성실험은 산양삼의 안정성을 평가하여 임상적 용약의 안전을 확보하기 위한 것으로, 5주간의 산양삼 4.
- 본 실험에서는 병리조직학적으로 간장, 신장, 심장에서는 정상군과 큰 차이를 발견하지 못하였고, 고환에서는 CP를 투여한 대조군에서 상피세포의 증식이 감소되고 정세관의 내부 공간이 정상군에 비해서 확장되었으며, 부위에 따라서 정세관 상피세포가 괴사 및 탈락되어 있었다. 고환 단면적과 정세관의 직경을 측정하고 고환조직에서의 BrdU 발현 양상을 비교해 보았는데, 정상군에 비하여 CP를 투여한 대조군에서 고환의 단면적과 정세관의 직경이 정상군에 비하여 모두 유의성 있게 감소되었고, 산양삼 추출물 병용투여군은 대조군에 비하여 정세관 직경의 감소가 유의성 있게 억제되었다.
- 본 연구에서 산양삼이 체중에 미치는 영향을 측정한 결과, CP를 투여한 대조군이 정상군에 비하여 유의한 체중 감소를 나타내어 CP에 의한 독성으로 체중이 감소된다는 보고와 동일한 결과가 관찰되었다31). 기존 연구에서는 체중 감소와 식이 섭취량이 비례한 것을 체중 감소의 원인으로 파악하였는데, 본 연구에서는 식이 섭취량을 파악하지 않아 정확한 원인은 알수 없으나, 산양삼 추출액을 병용투여한 산양삼군에서는 대조군에 비하여 체중 감소가 유의성 있게 억제되어 산양삼이 CP에 의한 전신독성 혹은 소화기능 억제를 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
- 본 연구의 결과를 종합하면 고용량으로 이루어진 반복투여 독성실험에서 산양삼은 장기독성 반응을 나타내지 않았고, CP로 유발된 장기독성 생쥐모델에서 산양삼은 심장, 간장, 고환에 대하여 독성 방어 효과가 있는 것으로 평가되었다. 향후 HPLC 등의 방법으로 산얌삼의 유효성분과 산양삼의 독성 방어 효과의 기전에 대한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 산양삼 병용투여군에서는 CPK와 AST의 증가가 대조군에 비해 유의성 있게 억제되어 산양삼 추출물이 심장과 간장 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 보이며, BUN 수치는 대조군에 비해 유의하게 감소하였으나 정상군과 대조군 사이에 측정치의 차이가 없어서 신장 보호 효과를 판단할수 없었다. 심장의 무게는 산양삼 병용투여군이 대조군보다 더 낮게 측정되었으나, 혈액 내 CPK의 증가가 유의하게 억제된 것으로 보아, 산양삼은 CP에 의한 심근 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 의 무게를 감소시킨다고 보고되었는데, CP만 투여한 대조군이 정상군에 비하여 심장, 신장, 고환의 무게가 유의성 있게 감소되어 CP에 의한 독성이 유발되었음을 알 수 있었다. 산양삼 병용투여군에서는 대조군에 비하여 간장, 신장, 고환의 무게 감소가 억제되었고, 심장의 무게는 대조군에 비하여 증가되었으나 장기 무게의 차이는 모든 항목에서 유의성이 없었다.
- CP만 투여한 대조군에서 BrdU 양성반응이 관찰되는 정세관이 정상군에 비해 감소되었으며, 양성반응을 보인 정조세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었다. 산양삼 추물물 병용투여군에서는 양성반응이 관찰된 정세관은 대조군과 유사하에 관찰되었으나, 양성반응을 보인 정조세포는 대조군보다 치밀하게 관찰되어, CP가 고환 독성을 유발하였으나 산양삼 추출물 병용투여로 인해 고환 독성을 방어한 것으로 판단된다.
- 심장, 간장, 신장의 손상을 확인하기 위해 혈액내 CPK, AST, ALT, creatinine, BUN을 선별적으로 확인하였는데, CP를 투여한 대조군에서는 정상군에 비해 CPK, AST가 유의성 있게 증가하였고, ALT는 정상군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었으며, 신장기능 지표인 creatinine과 BUN은 정상군과 대조군 사이에 차이가 없었다.
- 산양삼 병용투여군에서는 CPK와 AST의 증가가 대조군에 비해 유의성 있게 억제되어 산양삼 추출물이 심장과 간장 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 보이며, BUN 수치는 대조군에 비해 유의하게 감소하였으나 정상군과 대조군 사이에 측정치의 차이가 없어서 신장 보호 효과를 판단할수 없었다. 심장의 무게는 산양삼 병용투여군이 대조군보다 더 낮게 측정되었으나, 혈액 내 CPK의 증가가 유의하게 억제된 것으로 보아, 산양삼은 CP에 의한 심근 손상을 보호하는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 이상의 결과로 보아, 산양삼은 CP로 유발된 생쥐의 장기손상에서 심장, 간장, 고환의 독성에 대한 방어효과가 있는 것으로 사료된다.
- 산양삼의 반복투여 독성실험에서 산양삼이 체중에 미치는 영향을 측정한 바 정상군에 비하여 체중의 변화에 차이가 없었다. 장기중량을 측정한 결과 심장의 무게가 정상군에 비하여 유의성 있게 억제되었으나, CPK는 정상군에 비해 유의한 차이 없이 낮게 측정되어 심근손상의 증거는 없었다. 간장, 신장의 무게는 정상군과 유의한 차이가 없었고, AST, ALT, creatinine, BUN은 산양삼 투여군에서 정상군에 비해 오히려 낮게 측정되었으나 유의성은 없었다.
- 정상군에 비하여 대조군에서는 CPK와 AST가 유의성 있게 증가되었고 ALT, creatinine 및 BUN은 유의한 변화가 없었다. CP+WG군은 대조군에 비하여 CPK, AST 및 BUN은 유의성 있게 감소되었고 ALT와 creatinine은 유의한 변화가 없었다.
- 정상군에 비하여 대조군에서는 고환의 단면적과 정세관의 직경이 모두 감소되었으나, CP+WG군은 대조군에 비하여 정세관 직경의 감소가 억제되었다.
- 정상군에 비하여 대조군에서는 고환의 단면적과 정세관의 직경이 모두 유의성 있게 감소되었으며, CP+WG군은 대조군에 비하여 정세관 직경의 감소가 유의성 있게 억제되었다. WG군에서는 고환의 단면적과 정세관 직경이 정상군과 유사하게 관찰되 었다(Fig.
- 정상군의 고환조직에서 BrdU 양성반응은 대다수의 정세관에서 발현되었으며, 발현된 정세관의 대부분의 정조세포에서 강한 양성반응이 확인되었다. 대조군에서는 양성반응이 관찰되는 정세관이 정상군에 비해서 감소되었으며, 양성반응을 보인 정조 세포도 정상군에 비해서 드물게 관찰되었다.
- 정상군의 장기 무게에 비하여 대조군의 심장, 신장 및 고환 중량이 모두 유의성 있게 감소되었으며, CP+WG군에서는 대조군에 비하여 간장, 신장 및 고환의 무게가 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 없었다. WG군에서는 정상군에 비하여 심장의 무게가 유의성 있게 억제되었으나 나머지 장기의 무게는 유의한 차이가 없었다(Fig.
- 정상군의 체중 증가에 비하여 대조군에서는 실험 2, 3, 4, 5주째에 모두 유의성 있게 체중 증가가 억제되었으며, CP+WG군은 대조군에 비하여 실험 3, 4주째에 유의성 있게 체중이 증가되었다. WG군은 정상군과 유사한 체중의 증가를 나타내었다(Fig.
- 정상군의 체중 증가에 비하여 대조군에서는 실험 2, 3, 4, 5주째에 체중 증가가 억제되었으나, CP+WG군은 대조군에 비하여 실험 3, 4주째에 유의성 있게 체중이 증가되었다. 혈액검사상 정상군에 비하여 대조군에서는 CPK와 AST가 증가되었으나, CP+WG군은 대조군에 비하여 CPK와 AST가 감소되었다.
- 정상군의 체중 증가에 비하여 대조군에서는 실험 2, 3, 4, 5주째에 체중 증가가 억제되었으나, CP+WG군은 대조군에 비하여 실험 3, 4주째에 유의성 있게 체중이 증가되었다. 혈액검사상 정상군에 비하여 대조군에서는 CPK와 AST가 증가되었으나, CP+WG군은 대조군에 비하여 CPK와 AST가 감소되었다.
후속연구
- 본 연구의 결과를 종합하면 고용량으로 이루어진 반복투여 독성실험에서 산양삼은 장기독성 반응을 나타내지 않았고, CP로 유발된 장기독성 생쥐모델에서 산양삼은 심장, 간장, 고환에 대하여 독성 방어 효과가 있는 것으로 평가되었다. 향후 HPLC 등의 방법으로 산얌삼의 유효성분과 산양삼의 독성 방어 효과의 기전에 대한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다.
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