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문제 정의
- 다수의 sT50mg-D을 혼합하여 template로 사용하였을 때 굴에 오염된 바이러스의 검출여부를 알아보고자 하였다. 2-step PCR에서 megalocytivirus 오염 음성 또는 양성으로 확인 된 동일 그룹 내 각각의 굴 3개체 (Fig.
제안 방법
- (Fig. 2(C)의 lane 1c)를 사용하여 패류의 중장선에 축적된 virus의 검출한계를 분석하였다 중장선 50mg에 PBS를 첨가하여 200ul의 homogenate를 조제한 뒤 이를 1/10씩 단계별로 희석한 200μ1의 homogenate 시료를 조제하였다 먼저 분리된 sT50mg-D 1U1 를 template로 사용하여 2-step PCR (35cycles)과 qPCR을 실시하였다. 분리된 sT50mg-D의 viral copy는 1.
- 2-step PCR에서 megalocytivirus 오염 음성 또는 양성으로 확인 된 동일 그룹 내 각각의 굴 3개체 (Fig. 2(D)의 lane a, b, c/d, e, f, g, h, i)의 sT50mg-D 혼합물 lul 또는 다른 T5g-D 조제에 사용된 개체들을 사용하여 조제된 sT50mg-D 3개를 혼합한 시료 1μ1를 template로 하여 2-step PCR (35 cycles)을 실시하였을때 전기 영동 상에서 나타난 band density는 T5g-D template 1 μ1를 template로 사용한 것과 비교하여 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다 (Fig. 3).
- Megalocytivirus 에 감염된 돌돔으로부터 분리된 IVS-1 isolate (Jeong et al., 2003, GenBank accession numbers for ATPase gene : AF487899)의 genomic DNA 를 template로 하여 Jun et al (2009)에 의해 발표된 primer MC1F (5'-GAGGTGCGCATCCACTTC-3‘)과 MCIR (5'-CAAGATGATTGGCATGCG-3‘)을 사용하여 1-step PCR (40cycles)을 실시하였고 생성된 163bp 의 PCR product를 GeneAll® Expin Gel SV kit (GeneAll Biotechnology, Korea)로 agarose gel로부터 분리 및 정제하였다. 정제된 DNA를 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 ligation 후 E.
- PCR 후 증폭 산물은 0.5㎍μl EtBr (Ethidium Bromide) 이 첨가된 2% agarose gel을 이용하고 IxTAE buffer (40mM Tris-acetate, ImM EDTA)를 전기영동을 위한완충액으로 하여 전기영동을 실시하였다. UV 검출기에서 나타나는 band를 관찰하여 그 증폭여부를 확인하였다.
- 5) 40ml을가하여 vortex후 10, 000 * g로 15분간 4℃에서 원심분리 하여 상징액을 전 단계에서 얻어진 상징액과 합쳤다. PEG (polyethylene glycol)을 이용한 바이러스 농축을 위해 상징액에 PEG 8000 용액 (최종농도 10% [wt/vol] PEG 8000, 0.3 M NaCl)을 가한 후 4℃에서 16시간 동안 1차 침전을 실시하였다 PEG 1차 침전물을 10, 000 X g로 15분간 4℃에서 원심분리 후 상징액을 버리고 침전물을 0.2% Tween 80-50mM Tris-HCl 2ml과 1 x PBS 8ml을 가하여 침전물을 현탁 하고 chloroform 10ml을 가하여 vortex로 강하게 혼합하였다 이후 10, 000 X g로 15분간 4°c에서 원심분리 후상징액에 PEG 8000 용액 (최종농도 20% [wt/vol] PEG 8000, 0.3 M NaCl)을 가한 후 4℃에서 3시간 동안방치하여 2차 침전을 실시하였다. 이후 10, 000 X g로 15분간 4℃에서 원심분리 후 상징액을 제거하고 200 U1 의 멸균 증류수로 pellet을 현탁하였다.
- PEG을 사용한 바이러스의 농축 과정을 거치지않고 패류의 중장선 50mg을 직접 사용하여 패류 내오염된 바이러스를 검출 하고자, T5g-D의 제조에 사용한 굴 10개체 (양성 시료용으로 9개체 그리고 음성시료용으로 1개체) 각각으로부터 조제된 sT50mg-D (DNA 평균농도 1㎍㎖) 1μ1를 template로 한 바이러스 분석의 민김도를 비교 조사 하였다 1-step PCR을수행하였을 때, 30cycles에서는 모든 시료에서 음성의 결과를 보여 주었다 (data not shown). 1-step PCR, 35cycles에서는 전기 영동 상에서 양성 시료 중 2개의시료에서는 (총 6개체) 2개체씩 양성의 결과를 보여주었으나 기장 시료에서는 양성 개체가 확인 되지 않았다 그리고 음성 시료 (1개체)의 sT50mg-D lul의 template는 여전히 음성의 결과를 보여 주었다 (Fig.
- T5g-D를 사용하여 2-step PCR에서 양성 결과를보인 3개의 시료에 대해, T5g-D 조제에 사용된 각 9개체에 대한 개체별 분석 (sT50mg-D)을 2-step PCR 을 이용하여 실시하였을 때 통영, 남해 그리고 기장굴에서 각각 2개체씩이 양성의 결과를 보여 주었다 (Fig 2). 즉 얻어진 T5g-D 양성 시료에 사용된 개체별분석에서 최소한 1개체는 2-step 35cycles의 PCR 수행시 양성으로 나타났으며, 1-step 35cycles의 PCR 수행시 3 개체 모두 음성의 결과를 보여 가장 낮은 농도의양성 시료로 추정 되는 기장 굴 시료에서도 동일한결과를 보여 주었다 (Fig.
- 5㎍μl EtBr (Ethidium Bromide) 이 첨가된 2% agarose gel을 이용하고 IxTAE buffer (40mM Tris-acetate, ImM EDTA)를 전기영동을 위한완충액으로 하여 전기영동을 실시하였다. UV 검출기에서 나타나는 band를 관찰하여 그 증폭여부를 확인하였다.
- 각 굴 양식장으로부터 채취한 굴 3개체의 중장 선을 혼합하여 준비한 시료(통영, 남해, 기장에서 채취한 굴 9개체로부터 3개의 시료 조제 및 광안리에서 채취한 1개체로부터 1개의 시료 조제) T5g-D의 평균농도는 12.87㎍㎖ 이었으며, 2-step PCR을 각각 실시하여 3개의 양성 시료 와 1개의 음성 시료를 얻었다. 양성 시료는 1-step PCR (35 cycles)에서도 양성으로 확인 할 수 있었으나 30cycles에서는 음성의 결과를 보였다 2・step PCR (30 - 30 cycles)은 1-step PCR (35 cycles)에 비하여서는 명확한 양성 결과로 나타났으나 (data not shown), 5 cycles을 증가시 킨 2-step PCR (35cycles)에서 가장 높은 band density# 전기 영동 상에서 확인할 수 있었다 (Fig.
- 본 연구에사는 어류 질병 바이러스 중 국내 돔류 양식장에서 매년 발병하여 경제적으로 큰 피해를 주고 있는돌돔 이리도바이러스 질병 원인체인 megalocytivirus의패류 내 분석을 위한 패류 시료양의 표준화를 정립한 후 이를 PEG 침전법에 의한 결과와의 비교를 2-step PCR과 real time PCR을 이용하여 정성 . 정량적 관점에서 실시하였다.
- 그리고 패류의 중장선 5g 및 50mg으로부터 각각 분리된 DNA를 T5g-D 및 sT50mg-D 라고 명명하였다 Viral DNA 분리를 위하여 사용한 Kit 는 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Lorea)을 사용하였으며 제조사의 protocol 에 따라서 DNA를 분리하여 50ul의 TE buffer에 현탁하였다. 분리된 DNA는 분광 광도계 (BioPhotometer, Eppendorf)를 사용하여 흡광도 측정으로 A260/A280nm값을 구하여 DNA양을 측정하였으며 실험 전까지 -20℃에서 보관하였다.
- 정량적 관점에서 실시하였다.
- 정성 . 정량적 분석이 가능하며 신속하고 간편한 방법의 개발을 이루고자 하였다 5g의 굴 중장선 조직을 Glycine buffer 및 PEG 8000 용액을 사용하여 제조한 농축 시료 (T5g-D)와 50mg의 굴 중장선 조직으로부터 직접적으로 제조한 시료 (sT50mg-D)를 대상으로 2-step PCR을 실시하여 검출감도를 비교하였다 동일한 1μ1의 DNA template T5g-D와 sT50mg-D를사용흐였을 때 35cycles의 1-step PCR에서 양성의 결과를 얻을 수 있었다. 인위적으로 sT50mg-D 혼합시료를 사용하여 2-step PCR (35cycles)을 실시하였을 때 T5g-D를 사용한 것과 비교하여 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다.
- , 2003, GenBank accession numbers for ATPase gene : AF487899)의 genomic DNA 를 template로 하여 Jun et al (2009)에 의해 발표된 primer MC1F (5'-GAGGTGCGCATCCACTTC-3‘)과 MCIR (5'-CAAGATGATTGGCATGCG-3‘)을 사용하여 1-step PCR (40cycles)을 실시하였고 생성된 163bp 의 PCR product를 GeneAll® Expin Gel SV kit (GeneAll Biotechnology, Korea)로 agarose gel로부터 분리 및 정제하였다. 정제된 DNA를 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 ligation 후 E. coli DH5a 균주에 transformation 시켰다 Plasmid DNA는 GeneAll® Plasmid SV Mini kit (GeneAll Biotechnology, Korea)를 이용하여 plasmid를 분리하였고 qPCR을 위한 standard로서 사용하였다.
- 준비된 standard DNA를 Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Reagent and Kits (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 안내서에 따라서 무게를 측정하고 이로부터 plasmid copy 값을 결정한 후 각각 10・fbld 씩 단계 희석하여 2x13~2x10 copy의 시료를 제조한 후 표준 검량 곡선을 작성하는데 사용하였다
- 중장선 5g을 사용하여 농축 조제한 시료 200U1 와 패류의 중장선 50mg을 직접 마쇄 하여 조제한 마쇄액 200ul를 시료로 하여 상업화된 Kit를 사용하여 DNA를 분리하였다. 그리고 패류의 중장선 5g 및 50mg으로부터 각각 분리된 DNA를 T5g-D 및 sT50mg-D 라고 명명하였다 Viral DNA 분리를 위하여 사용한 Kit 는 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Lorea)을 사용하였으며 제조사의 protocol 에 따라서 DNA를 분리하여 50ul의 TE buffer에 현탁하였다.
- 패류 내 축적되어 있는 megalocytivirus를 검출하기 위해서 GenBank에 등록된 염기서열을 비교하여모든 subgroup에서 conserved 되어 있는 tnqjor capsid protein (MCP) gene의 부위에서 제작하였다 (Table 1). 1-step PCR amplificatione Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler를 사용하였다.
- 패류에 오염된 바이러스를 농축하기 위한 전처리과정으로 식약청에서 패류로부터의 노로바이러스 농축에 사용하는 표준 시험법을 수정하여 사용하였다.
- 이는 실질적으로 패류의 중장선에는 나타난 qPCR의 결과보다 더욱 많은 양의 virus가 오염되어있다고 여겨진다. 하지만 정량적 측면에서 보면 패류개체 각각은 바이러스의 오염 정도가 다양한 수준일 것이므로 50mg homogenate를 1/10씩 단계별로 희석한 후 각각의 total DNA를 분리하여 정량적으로 분석하여 그 검출 한계치를 분석하였다. 이때 분리된 sT50mg-D를 단계별로 희석하는 것보다는 조직 시료자체를 먼저 각각의 희석비율에 맞게 조제한 후 이들로부터 DNA를 각각 분리함으로써 분리과정에서의 DNA 회수율 감소까지 고려한 결과를 얻고자 하였다그 결과, 2-step PCR과 qPCR에서 중장선 50mg~500 ㎍을 사용하여 DNA (sT50mg-D ~sT5OO0g-D)를 분리하여도 megalocytivire의 검출 및 정량은, 개체 패류에 따라서 악간의 차이는 있을 수 있으나 충분히 가능함을 확인할 수 있었다 (Fig.
대상 데이터
- 1-step PCR amplificatione Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler를 사용하였다. Microtube 에 10 x PCR buffer 2 ill, 200yM의 각각의 dNTP, 1|1M의 sense primer와 1|1M 의 antisense primer, Taq DNA polymerase (Taq DNA polymerase, Cosmogenetech co, Ltd.
- 2007년부터 2010년에 이르기까지 영남권 해안에서 식하고 있는 참굴(Crassostrea gigas) 에 대해 샘플링을 실시하였다 (Fig. 1). 시기적인 측면에서 겨울을 지난 초봄인 3월 근처의 시기 또는 늦가을인 11월 근처를 조사기간으로 설정하였으며 채취한 패류는 중장선을 따로 분리하여 -70℃에 보관 하면서 사용하였다
- 1). 시기적인 측면에서 겨울을 지난 초봄인 3월 근처의 시기 또는 늦가을인 11월 근처를 조사기간으로 설정하였으며 채취한 패류는 중장선을 따로 분리하여 -70℃에 보관 하면서 사용하였다
이론/모형
- 패류 내 축적되어 있는 바이러스의 검출 한계를 분석하기 위해 Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Research, AUS)을 사용하여 qPCR을 실시하였다. qPCR을 실시하기 위한 조건은 10X buffer 2pl, 200nM의 각각의 dNTP, 1|1M의 각각의 primer, Hot start Taq (HS prime Taq DNA polymerase, Genet Bio, Korea) 및 template (시료로부터 추출한 DNA, 10・fbld씩 희석된 plasmid standard)를 0.
성능/효과
- 2(C)의 lane 1c)를 사용하여 패류의 중장선에 축적된 virus의 검출한계를 분석하였다 중장선 50mg에 PBS를 첨가하여 200ul의 homogenate를 조제한 뒤 이를 1/10씩 단계별로 희석한 200μ1의 homogenate 시료를 조제하였다 먼저 분리된 sT50mg-D 1U1 를 template로 사용하여 2-step PCR (35cycles)과 qPCR을 실시하였다. 분리된 sT50mg-D의 viral copy는 1.20E+02 copy/ill 이었으며 1-step PCR (35cycles)으로도 검출이 가능하였다 1/10 희석 시료로부터 조제된 template (sT5mg-D) 에서는 1-step PCR (35cycles) 수행 시 전기영동 상에서 연한 band를 확인할 수 있었으나 1/100희석 (sT500jt/g-D) 및 1/1000 희석 (sT50"g-D) 시료에서는 1-step PCR (35cycles)만으로는 전기영동 상에서 band를 확인할 수 없었다 (Fig. 4). 그리고 1/100희석 시료는 2-step PCR (35cycles) 을 수행하였을 때만 전기영동 상에서 검출이 가능하였다 각각의 희석 시료에 대한 정량적 분석을 실시한 결과 본 분석에 사용한 양성 template DNA 인 sT50mg-D, sT5mg-D 및 sT500㎍D에는 각각 1.
- 결과를 보여 주었다 (data not shown). 1-step PCR, 35cycles에서는 전기 영동 상에서 양성 시료 중 2개의시료에서는 (총 6개체) 2개체씩 양성의 결과를 보여주었으나 기장 시료에서는 양성 개체가 확인 되지 않았다 그리고 음성 시료 (1개체)의 sT50mg-D lul의 template는 여전히 음성의 결과를 보여 주었다 (Fig. 2).
- 14E+00 copies/ul이하의 농도가 있을 때는 qPCR에서 positive의 결과를 얻을 수 없었다. 결론적으로 패류 내 megalocytivirus 의 오염 유무 판단을 위한 2-step PCR 및 qPCR에서 50mg 의 중장선을 사용하는 것은 i) 굴의 조직으로부터 오염된 megalocytivirus의 정성 및 정량을 위한 최소검출 한계에 비하여 충분한 양이었으며 ⅱ) 개체별 분석이 가능하다는 장점이 있었으며 ⅲ) 이를 토대로 국내에서 서식하고 있는 굴에서 megalocythdrus의 오염을 확인할 수 있었다
- 2). 그러므로 굴의 오염 (또는 그 오염 수준)은 모두 동일한 것이라기보다는 오히려 개체 간에 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었으며 그러한 확인은 50mg의 중장선 조직을 사용한 개체별 분석을 통하여서만이 가능하며 PEG를 사용한대량의 혼합시료 사용 시에는 얻을 수 없는 결과라는것을 확인하였다.
- 4). 그리고 1/100희석 시료는 2-step PCR (35cycles) 을 수행하였을 때만 전기영동 상에서 검출이 가능하였다 각각의 희석 시료에 대한 정량적 분석을 실시한 결과 본 분석에 사용한 양성 template DNA 인 sT50mg-D, sT5mg-D 및 sT500㎍D에는 각각 1.20E+02 copy/pl sT50mg-D, 1.21E-W1 copy/]il sT5mg-D 및 6.14E+00 copy/ pl sT500ug-D의 바이러스 particle이 았음을 확인할 수 있었다 그러므로 본 qPCR 에서 positive 결과를 보인 바이러스의 최소 농도는 6.14EHX) copy/ul sT500㎍-D이었으므로 50mg의 굴조직을 사용하여 조제 한 sT50mg-D을 tenplate으로 하여 패류 내 바이러스의 오염을 분석하는 것은 충분히 정확한 결과를 보일 수 있는 양이라고 할 수 있다. (Fig.
- 따라서 본 연구에서는 패류 내 존재하는 megalocyti- virus의 존재를 확인하며, 기존의 검출방법에 비해 신속하고 간편하게 적은 양의 시료를 사용하여 패류 내 축적된 바이러스를 검출하기 위한 방법을 PEG 농축법과 비교 검토하고자 하였다 먼저 megalocyti- virus에 오염된 굴의 중장선 5g을 사용한 PEG 농축 시료로부터 얻은 DNA (T5g-D)와 농축하지 않고 각각 개체의 중장선 50mg을 직접 사용하여 얻은 DNA (sT50mg-D)로부터 바이러스를 검출한 결과, 모두 1-step PCR (35cycles)에서 오염된 바이러스의 검출이 가능하였다.
- 인위적으로 sT50mg-D 혼합시료를 사용하여 2-step PCR (35cycles)을 실시하였을 때 T5g-D를 사용한 것과 비교하여 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. 또한 megalocytivirus에 오염된 양성시료 0.5 ~50mg을 사용하여 조제한 각각 50μ1의 template DNA lul를 사용하여 qPCR을 하였을 때 6.14EHX) ~L2E+O2/U1의 농도를 함유하고 있는 것으로 나타났다. 조제한 template DNA에 6.
- 87㎍㎖ 이었으며, 2-step PCR을 각각 실시하여 3개의 양성 시료 와 1개의 음성 시료를 얻었다. 양성 시료는 1-step PCR (35 cycles)에서도 양성으로 확인 할 수 있었으나 30cycles에서는 음성의 결과를 보였다 2・step PCR (30 - 30 cycles)은 1-step PCR (35 cycles)에 비하여서는 명확한 양성 결과로 나타났으나 (data not shown), 5 cycles을 증가시 킨 2-step PCR (35cycles)에서 가장 높은 band density# 전기 영동 상에서 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
- 하지만 정량적 측면에서 보면 패류개체 각각은 바이러스의 오염 정도가 다양한 수준일 것이므로 50mg homogenate를 1/10씩 단계별로 희석한 후 각각의 total DNA를 분리하여 정량적으로 분석하여 그 검출 한계치를 분석하였다. 이때 분리된 sT50mg-D를 단계별로 희석하는 것보다는 조직 시료자체를 먼저 각각의 희석비율에 맞게 조제한 후 이들로부터 DNA를 각각 분리함으로써 분리과정에서의 DNA 회수율 감소까지 고려한 결과를 얻고자 하였다그 결과, 2-step PCR과 qPCR에서 중장선 50mg~500 ㎍을 사용하여 DNA (sT50mg-D ~sT5OO0g-D)를 분리하여도 megalocytivire의 검출 및 정량은, 개체 패류에 따라서 악간의 차이는 있을 수 있으나 충분히 가능함을 확인할 수 있었다 (Fig. 4, Table 2). 이러한 결과는 비록 패류 중장선에 megalocytivirus 가 저 농도로 오염된 시료라고 흐]더라도 PCR을 위한 template DNA 제조에 50mg의 조직을 사용한다면 정성 및 정량적 검출을 위한 충분한 양이라는 것을 나타낸다 따라서 megalocytivirus의 패류 내 오염 확인을 위하여 sT50mg-D를 2-step PCR 의 template 로 시용하는 것은패류 내 존재하는 어류감염 바이러스의 위험 수준에 비하여 충분한 양을 사용하는 것이라고 추정 할 수 있다.
- 4, Table 2). 이러한 결과는 비록 패류 중장선에 megalocytivirus 가 저 농도로 오염된 시료라고 흐]더라도 PCR을 위한 template DNA 제조에 50mg의 조직을 사용한다면 정성 및 정량적 검출을 위한 충분한 양이라는 것을 나타낸다 따라서 megalocytivirus의 패류 내 오염 확인을 위하여 sT50mg-D를 2-step PCR 의 template 로 시용하는 것은패류 내 존재하는 어류감염 바이러스의 위험 수준에 비하여 충분한 양을 사용하는 것이라고 추정 할 수 있다.
- 이러한 결과는 양성과 음성의 결과를 보이는 sT50mg-D를 혼합하여 template로 사용한 분석에서 양성 sT50mg-D가 한 개체라도 혼합되면 양성으로 나타나는 결과로부터 확인할 수 있었다 (Fig 3).
- 인위적으로 바이러스 배양액을 첨가하여 중장선조직 내 존재하는 inhibitor의 영향을 측정한 결과, 조직 내에 존재하는 inhibitor의 영향으로 인하여 실질적인 바이러스 particle의 수에 비하여 10배가량 낮은 수치를 보인다는 것을 확인할 수 있었다 (data not shown). 이는 실질적으로 패류의 중장선에는 나타난 qPCR의 결과보다 더욱 많은 양의 virus가 오염되어있다고 여겨진다.
- 2). 즉 얻어진 T5g-D 양성 시료에 사용된 개체별분석에서 최소한 1개체는 2-step 35cycles의 PCR 수행시 양성으로 나타났으며, 1-step 35cycles의 PCR 수행시 3 개체 모두 음성의 결과를 보여 가장 낮은 농도의양성 시료로 추정 되는 기장 굴 시료에서도 동일한결과를 보여 주었다 (Fig. 2). 그러므로 굴의 오염 (또는 그 오염 수준)은 모두 동일한 것이라기보다는 오히려 개체 간에 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었으며 그러한 확인은 50mg의 중장선 조직을 사용한 개체별 분석을 통하여서만이 가능하며 PEG를 사용한대량의 혼합시료 사용 시에는 얻을 수 없는 결과라는것을 확인하였다.
후속연구
- 결론적으로 우리나라에서 양식 (또는 서식)하고있는 패류의 중장선 내에서 megalocytivirus의 오염존재를 정성 및 정량적 방법으로 확인할 수 있었으며 오염된 패류의 중장선에 존재하는 바이러스 검출을위한 DNA template 조제 시 5g을 사용한 농축 시료대신에 50mg의 조직을 직접 사용하여도 충분히 megalocytivirus의 오염 검출 한계를 넘는 농도임을확인할 수 있어 향후 패류 내 오염 바이러스 분석을위하여 본 연구의 시료 표준화의 개념이 응용 가능함을 확인할 수 있었다.
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