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문제 정의
- 이에 본 연구는 실험을 위해 순치 중이던 쥐치가 광범위한 체표 백탁 증상을 보이며 폐사하여 그 원인을 밝히고자 하였다
제안 방법
- RSIV의 PCR 분석을 위해 분리된 DNA 를 template로 사용하였으며, 그 외 VHSV, VNNV, HRV 및 MBV의 PCR 분석을 위해 분리된 RNA에서 합성한 cDNA를 사용하였다. PCR 분석은 ExTaq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따랐으며, 사용된 primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다. 증폭된 산물은 전기 영동으로 확인하였으며 모든 PCR 분석은 양성대조 및 음성대조를 함께 비교하였다.
- 신장, 비장 및 뇌를 사용하였다. PCR을 위한 DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany)를 사용하여 매뉴얼에 따라 분리하였으며, RNA는 매뉴얼에 따라 TRIZOL Reagent (Invitrogen, USA)로 분리한후 SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를합성하였다. RSIV의 PCR 분석을 위해 분리된 DNA 를 template로 사용하였으며, 그 외 VHSV, VNNV, HRV 및 MBV의 PCR 분석을 위해 분리된 RNA에서 합성한 cDNA를 사용하였다.
- PCR을 위한 DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany)를 사용하여 매뉴얼에 따라 분리하였으며, RNA는 매뉴얼에 따라 TRIZOL Reagent (Invitrogen, USA)로 분리한후 SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를합성하였다. RSIV의 PCR 분석을 위해 분리된 DNA 를 template로 사용하였으며, 그 외 VHSV, VNNV, HRV 및 MBV의 PCR 분석을 위해 분리된 RNA에서 합성한 cDNA를 사용하였다. PCR 분석은 ExTaq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따랐으며, 사용된 primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다.
- 0)을 1.5% NaCl。] 첨가된 1% pepton water에 접종하였다 접종액은 온도별로 17℃, 22℃, 27℃, 32℃, 37℃에서 4일간 배양하면서 매일 흡광도 (OD«)o)를 측정하여 발육정도를 측정하였다. 이 실험은 비브리오속 Vibrio anguillarum KCTC2711, Vibrio harveyi ATCC14126 및 Vibrio vulnificus LMG16852와 함께 실시하여 비교하였다.
- 마지막으로 비교적 낮은 수온에서 서식하던 양식쥐치에서 분리된 균주임을 감안하여 SA1에 대한 배양온도에 따른 발육시험을 실시하였다. 그 결과 SA1 은 27℃에서 가장 잘 증식하였으며, 37℃에서 가장낮은 발육을 보였다.
- 5% NaCl 이 첨가된 Muller-Hinton agar (BD, USA) 에 도말하고 그 위에 항균제 디스크 (Becton Dickinson, USA) 를 접종하여 20℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 나타난 발육저지대의 지름을 측정하여 BD ( BBL™ Sensi-Disc㎛)의 항균제 감수성 테스트 디스크사용 설명서 기준으로 내성 (resistant), 중간 내성 (intermediate resistant), 감수성 (susceptible)으로 구분하여 분석하였다 (Table 2).
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(b) 16S rRAN 및 recA 유전자에 대한 염기서열 분석
분리균의 종 동정을 위해 I6S rRNA 및 recA 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 분리균의 genomic DNA 추출과 PCR 분석은 상기와 동일하게 High pure template preparation kit (Roche, Germany)와 ExTaq(Takara, Japan)을 사.
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(a) 생화학적 분석
분리균의 종 분류를 위한 생화학적 분석에는 1.5% NaCl을 첨가한 TSA배지에서 20℃, 24시간 배양된 균주를 사용하였다 먼저 상법에 따라 stain 염색성과 형태를 관찰하고 세균의 운동성을 판정하였다. oxidase test는 cytochrome oxidase 시험지법, catalase test는 3% HQ를 이용한 slide 반응법으로 실시하였다 그 외의 다양한 생화학적 시험은 MacFaddin (2000) 의 방법을 따르고 API 20E kit (bioMerieux, France)를 함께 사용하여 Vibrio anguillarum KCTC2711 을 표준균주로 함께 비교 분석하였다.
- 시험어를 무균적으로 해부하여 신장 비장 간 등의 내부 장기 및 체표 환부를 NaCl 1.5% 첨가 TSA 배지, BHIA 배지 TCBS 배지 SS 배지 등에 접종하여 20℃, 24~48시간 배양하여 균의 성상을 확인하였으며 이를 계대배양하여 이후의 실험에 사용하였다.
- 염기서열의 분석에는 Genetyx Ver. 8.0 (SDC Software Development, Japan)을 사'용흐]였으며, NCBI 에서 제공되는 BLAST program 정보를 이용하여 상동성을 비교하였다.
- , 2010)를 이용하여 581bp의 산물을 얻었다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동으로 band를 확인한 후 Gel SV kit (GeneAU, Koa)로 정제하고 Topo TA cloning (hvitrogen, USA)을 이용하여 cloning하여 염기서열을 확인하였다.
- PCR 분석은 ExTaq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따랐으며, 사용된 primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다. 증폭된 산물은 전기 영동으로 확인하였으며 모든 PCR 분석은 양성대조 및 음성대조를 함께 비교하였다.
- 질병 증상을 보이는 쥐치의 아가미, 체표, 지느러미 및 각 내부 장기를 생검시료로 제작한 후 검경하여조직의 상태 및 기생충 감염 여부를 확인하였다.
- , 2007). 하지만 본 연구에서는 쥐치가 저수온 17℃에서 폐사된 점과 TCBS에서 17~ 18℃에서 균의 발육이 확인된 것을 감안하여 SA1S] 균주의 온도별 발육능에 대해 V. anguillarum (KCTC2711), V. harveyi (ATCC14126), V. vulnificus (LMG16852)와 비교 실험을 하였다 그 결과, 배양 후 72시간 되는 시점에서 SA1。] 다른 비브리오 속보다 17℃에서 현저히 높은 발육능을 보이는 양상을 발견할 수 있었다 Sugita et cd. (2008)는 일본의 내해에서 V.
- 해산어에서 주로 검출되는 바이러스의 감염 유무를 확인하기 위하여 참돔이 리도바이 러스 (red seabream iridovirus, RSIV), 바이 러스성출혈성 패혈증바이 러스 (viral hemorrhagic septicaemia virus, VHSV)를 포함하여 바이 러스성신경괴사증바이 러스 (viral nervous necrosis virus, VNNV), 히라메랩도바이러스 (hirame rhabdovirus, HRV) 및 해산 버나바이러스 (marine bimavirus, MBV) 에 대한 polymerase chain reaction (PCR) 분석을 시행하였다.
대상 데이터
- 230년, 강원도 소재의 양어장에서 분양받아 실험실에서 약 17℃로 순치 중이던 쥐치 (체장 4~6 cm)에서 광범위한 체표 백탁을 보이며 폐사하는 사례가 발생하였다. 폐사어에서 분리된 세균을 TCBS에 접종한 결과 25℃에서 24시간 배양시 균의 증식이 관찰되지 않았으나 실온 (17~ 18℃)에서 24시간 더 배양한 결과 노란색 colony를 확인할 수 있었다.
- 강원도 소재의 쥐치 양어장에서 분양받아 실험실에서 순치 중이던 약 300마리의 쥐치 (체장4~6 cm) 중 약 30%가 광범위한 체표 백탁을 보이며 그 중 10% 정도 폐사하는 사례가 발생하였다 발병 당시의 수온은 약 17℃로 비교적 낮았으며 체표에 백탁을 형성한빈사어 10마리를 시험어로 사용하였다.
- 검사용 시료는 감염어를 무균적으로 해부하여 적출한 신장, 비장 및 뇌를 사용하였다. PCR을 위한 DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany)를 사용하여 매뉴얼에 따라 분리하였으며, RNA는 매뉴얼에 따라 TRIZOL Reagent (Invitrogen, USA)로 분리한후 SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를합성하였다.
- 5% NaCl。] 첨가된 1% pepton water에 접종하였다 접종액은 온도별로 17℃, 22℃, 27℃, 32℃, 37℃에서 4일간 배양하면서 매일 흡광도 (OD«)o)를 측정하여 발육정도를 측정하였다. 이 실험은 비브리오속 Vibrio anguillarum KCTC2711, Vibrio harveyi ATCC14126 및 Vibrio vulnificus LMG16852와 함께 실시하여 비교하였다.
데이터처리
- 却硕ms에 비해 17℃에서 현저히 높은 발육능과 3 7℃에서 매우 낮은 발육능을 보여 적정 생육 온도가비교적 낮은 것으로 추정되었다. Student's t-test를 비교하였다 0<0.05) (Fig. 2).
이론/모형
- 5% NaCl을 첨가한 TSA배지에서 20℃, 24시간 배양된 균주를 사용하였다 먼저 상법에 따라 stain 염색성과 형태를 관찰하고 세균의 운동성을 판정하였다. oxidase test는 cytochrome oxidase 시험지법, catalase test는 3% HQ를 이용한 slide 반응법으로 실시하였다 그 외의 다양한 생화학적 시험은 MacFaddin (2000) 의 방법을 따르고 API 20E kit (bioMerieux, France)를 함께 사용하여 Vibrio anguillarum KCTC2711 을 표준균주로 함께 비교 분석하였다.
성능/효과
- SAI의 16S rRNA유전자 l, 505bp와 recA 유전자 581bp의 염기서열을 분석한 결과 전자는 V. anguillarum AY662304과 100%, 후자는 V. angullarum M80525과 100% 상동성을 나타내었다.
- 따른 발육시험을 실시하였다. 그 결과 SA1 은 27℃에서 가장 잘 증식하였으며, 37℃에서 가장낮은 발육을 보였다. 이 균주는 V.
- , 1988)와 같은 해수어류에 발생하는 비브리오병의 원인체로 많은 보고가 있어왔지만, 복어목인 쥐치는 아직 발생 보고가 없다. 또한 본 연구는 기존의 V. anguillamm의 외견상 특징과는 다르게 병어의 체표에 백탁 증상이 뚜렷이 나타났으며, 비교적 저수온에서 폐사를 일으키는 특징을 가지고 있어 생화학적 성상, 약제감수성시험, 배양온도에 따른 발육시험 등을 종합적으로 실행하여 균을 동정하였다.
- 본 연구에서 SA1에 대하여 12종의 항생제에 대하여 감수성 검사를 실시한바, ofloxacin, nalidixic acid, oxytetracycline 과 oxolinic acid를 포함하는 quinolone 계와 doxycycline을 포함하는 tetracycline계는 감수성이 있는 것으로 나타났다 (Table 2). 그리하여 본 연구에서는 저지대 범위가 가장 넓은 oxolinic acid를 치료에 사용하였다 한편 Mo et al.
- 그 결과 SA1 은 27℃에서 가장 잘 증식하였으며, 37℃에서 가장낮은 발육을 보였다. 이 균주는 V. harveyi 및 V. 却硕ms에 비해 17℃에서 현저히 높은 발육능과 3 7℃에서 매우 낮은 발육능을 보여 적정 생육 온도가비교적 낮은 것으로 추정되었다. Student's t-test를 비교하였다 0<0.
- anguillarume 마찬가지로 arabinose로부터의 산 생성 능이 있는 것으로 나타났다. 이는 표준균주로 사용한 V. anguillarum KCTC2711 및 Bergey's manual의 V. anguillarum과는 차이가 있음을 보여준다 또한 SA1 은 V. anguillarum (KCTC27H)과 비교한 결과 trehalose로부터의 산생성능은 결여된 것으로 나타났으며, SA1과 V. anguillarum (KCTC2711)는 Mo et al. (2001)의 V. anguirum과는 다르게 rafose로부터의 산생성능은 결여된 것으로 나타났다 (Table 3).
- 폐사어에서 분리된 세균을 TCBS에 접종한 결과 25℃에서 24시간 배양시 균의 증식이 관찰되지 않았으나 실온 (17~ 18℃)에서 24시간 더 배양한 결과 노란색 colony를 확인할 수 있었다. 이에 저수온성 비브리오에 속하는 균주로 추정하고 16S rRNA와 recA 유전자를 이용한 유전자 염기분석 결과 SA1 은 K angiarum으로 나타났다. 16S rRNA 유전자는 계통발생학적으로 근연한 종간에는 그 유전적 다양성이 부족하다고 알려져 있으며 (Krawiec and Riley, 1990), recA 유전자는 16S rRNA 유전자에 비해 더 차별적이고 상동 비브리오 (common Vibrios) 에대한 계통발생과 동정의 마커로 이용된다.
- 폐사어에서 분리된 세균을 TCBS에 접종한 결과 25℃에서 24시간 배양시 균의 증식이 관찰되지 않았으나 실온 (17~ 18℃)에서 24시간 더 배양한 결과 노란색 colony를 확인할 수 있었다. 이에 저수온성 비브리오에 속하는 균주로 추정하고 16S rRNA와 recA 유전자를 이용한 유전자 염기분석 결과 SA1 은 K angiarum으로 나타났다.
- (Wang et al, 2010)는 보고가 있다. 하지만 본 연구에서 분리균 동정 결과 recA 유전자와 16S rRNA 유전자를 이용한 동정에는 특별한 차이는 없었다.
- 해산어에서 주로 검출되는 바이러스 5종, 즉 RSIV, VHSV, VNNV, HRV 및 MBV에 대한 PCR 분석을 실시한 결과 모든 병든 쥐치에서 어떠한 바이러스도 검출되지 않았다 (data not shown).
후속연구
- , 2009)를 제외하고는 거의 전무한 실정이다. 그러므로 우리나라에 서식하는 쥐치의 폐사량을 감소시키고양식 효율을 증대하기 위해서는 무엇보다 쥐치에 대한 병원성 연구가 시급히 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과에서는 저수온에서 백탁을 보이며 폐사되어가는 쥐치에서 K anguillarum이 분리 동정 되었고 이에 oxolinic acid 200 ppm을 병어에 1시간 동안 약욕시켰으며 그 결과 2일 경과 후 치사가 중단되고 증상이 호전되었다 향후 이 세균의 병원성 및 독성 시험 그리고 환경 요인과의 상관관계 등에 대하여 더 많은 연구를 진행시켜 쥐치 양식의 활성화 방안을 모색해야 할 것이다.
- jsp) (2009, 2010) 쥐치 양식에 있어서 자치어 시기에 폐사의 심각한 문제를 야기할 수 있을 것이라 생각된다. 이처럼 국내 쥐치 자치어의 양식에 있어서 V. anguillarum1^ 의한 폐사가 유발된다는 점에서 앞으로 국내 쥐치 양식에 주의를 기울여야 하며, 적극적인 대처가 필요할 것으로 예상된다.
- 0℃에서는0~7%만이 검출되었다고 한다. 하지만 본 연구는 SA1 이 17℃에서도 다른 비브리오 속에 비해 높은 발육능을 나타낸 것으로 보아 저수온에서도 어체에 상당한 피해를 줄 수 있다는 점에서 V. anguarum의 발생 수온 범위를 재검토할 필요가 있을 것으로 생각된다. 또한 쥐치 양식은 해상가두리가 전체 양식 방법의 대부분을 차지하고 있어 양식에서의 수온의 변화를 잘 염두 해 두어야 할 것이다 무엇보다 쥐치 양식은 5월에서 7월 사이에 산란이 일어나기 때문에 (해양수산부, 2001), 6~7월의 평균 수온 범위가 14~ 19℃인 점을 감안한다면 (http://portal.
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