고창 복분자의 기능성원료 표준화를 위한 지표성분으로서 Ellagic Acid의 분석법 개발 Method Development of Ellagic Acid as Marker Compound for Standardization of Gochang Bokbunja (Rubus coreanus Miquel) as Functional Ingredient원문보기
고창복분자의 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발하기 위하여 지표성분 표준화를 위한 ellagic acid의 분석법 설정과 분석법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 1% formic acid가 첨가된 water와 acetonitrile을 이동상으로 하고 Symmetry$^{(R)}$ (C18, $4.6{\times}250mm$, $5.0{\mu}m$) 칼럼을 사용하여 기울기용리(gradient elution) 방법으로 분석하였다. 본 연구에서는 분석법을 확립하고 분석법에 대하여 특이성, 직선성, 정확성과 정밀성 그리고 회수율에 대하여 확인하였다. Ellagic acid의 검량선은 $R^2=0.9996$으로 좋은 선형성을 보였으며 LLOQ와 LOD는 각각 $1{\mu}g/mL$와 $0.3{\mu}g/mL$였다. 일내와 일간 분석에서 상대표준편차(RSD)는 각각 2.28%와 2.84%미만으로 나왔다. 회수율 측정결과에서는 89.17~97.92%로 나왔고, RSD는 0.05~0.14%였다. 그러므로 HPLC를 이용한 ellagic acid의 분석법이 고창 복분자 추출물의 기능성원료 표준화를 위한 지표성분 분석을 위한 적합한 시험법임이 검증되었다. 본 시험법에 따라 분석한 고창 미숙과 복분자 추출물 내의 ellagic acid의 함량은 세 lot를 3번씩 분석하였을 때 약 $1.92{\mu}g/mg$(0.192%)이 나왔으며 RSD값은 2.36% 이하였다. 따라서 본 연구를 통하여 확립된 ellagic acid의 분석법이 고창 복분자의 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 본다.
고창 복분자의 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발하기 위하여 지표성분 표준화를 위한 ellagic acid의 분석법 설정과 분석법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 1% formic acid가 첨가된 water와 acetonitrile을 이동상으로 하고 Symmetry$^{(R)}$ (C18, $4.6{\times}250mm$, $5.0{\mu}m$) 칼럼을 사용하여 기울기용리(gradient elution) 방법으로 분석하였다. 본 연구에서는 분석법을 확립하고 분석법에 대하여 특이성, 직선성, 정확성과 정밀성 그리고 회수율에 대하여 확인하였다. Ellagic acid의 검량선은 $R^2=0.9996$으로 좋은 선형성을 보였으며 LLOQ와 LOD는 각각 $1{\mu}g/mL$와 $0.3{\mu}g/mL$였다. 일내와 일간 분석에서 상대표준편차(RSD)는 각각 2.28%와 2.84%미만으로 나왔다. 회수율 측정결과에서는 89.17~97.92%로 나왔고, RSD는 0.05~0.14%였다. 그러므로 HPLC를 이용한 ellagic acid의 분석법이 고창 복분자 추출물의 기능성원료 표준화를 위한 지표성분 분석을 위한 적합한 시험법임이 검증되었다. 본 시험법에 따라 분석한 고창 미숙과 복분자 추출물 내의 ellagic acid의 함량은 세 lot를 3번씩 분석하였을 때 약 $1.92{\mu}g/mg$(0.192%)이 나왔으며 RSD값은 2.36% 이하였다. 따라서 본 연구를 통하여 확립된 ellagic acid의 분석법이 고창 복분자의 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 본다.
Method development and validation of ellagic acid for the standardization of Gochang Bokbunja as a functional ingredient and health food were accomplished. A Symmetry$^{(R)}$ (C18, $4.6{\times}250mm$, $5.0{\mu}m$) column was used with a gradient elution system of 1% ...
Method development and validation of ellagic acid for the standardization of Gochang Bokbunja as a functional ingredient and health food were accomplished. A Symmetry$^{(R)}$ (C18, $4.6{\times}250mm$, $5.0{\mu}m$) column was used with a gradient elution system of 1% formic acid in water and acetonitrile. This method was validated according to specificity, linearity, accuracy, precision test, and recovery test. Specificity was confirmed with identical retention time, and calibration curves of ellagic acid showed good linear regression ($R^2$ >0.9996). Relative standard deviations (RSD) of data from the intra- and inter-day experiments were less than 2.28% and 2.84%, except in the low limit of quality control (LLOQ, $1{\mu}g/mL$) sample. The results of the recovery test were from 89.17% to 97.92% with RSD values from 0.05 to 0.14%. Therefore, we performed analysis of ellagic acid as a marker compound in Gochang Bokbunja extracts. The amount of ellagic acid in Gochang Bukbunja was about $1.918{\mu}g/mg$ (0.192%) in the three times analysis, and RSD was less than 2.36% by the validated method. These results suggest that the developed HPLC method is simple, efficient, and could contribute to the quality control of Gochang Bokbunja extract as a functional ingredient.
Method development and validation of ellagic acid for the standardization of Gochang Bokbunja as a functional ingredient and health food were accomplished. A Symmetry$^{(R)}$ (C18, $4.6{\times}250mm$, $5.0{\mu}m$) column was used with a gradient elution system of 1% formic acid in water and acetonitrile. This method was validated according to specificity, linearity, accuracy, precision test, and recovery test. Specificity was confirmed with identical retention time, and calibration curves of ellagic acid showed good linear regression ($R^2$ >0.9996). Relative standard deviations (RSD) of data from the intra- and inter-day experiments were less than 2.28% and 2.84%, except in the low limit of quality control (LLOQ, $1{\mu}g/mL$) sample. The results of the recovery test were from 89.17% to 97.92% with RSD values from 0.05 to 0.14%. Therefore, we performed analysis of ellagic acid as a marker compound in Gochang Bokbunja extracts. The amount of ellagic acid in Gochang Bukbunja was about $1.918{\mu}g/mg$ (0.192%) in the three times analysis, and RSD was less than 2.36% by the validated method. These results suggest that the developed HPLC method is simple, efficient, and could contribute to the quality control of Gochang Bokbunja extract as a functional ingredient.
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문제 정의
최근의 ellagic acid 분석법에는 DAD(diode array detector)를 이용하거나 질량분석기(mass spectrometry)를 이용한 방법들이 있으며, 국내에서 복분자내의 지표성분으로서 ellagic acid의 표준화를 위해서는 가장 범용적인 장비를 이용한 분석법을 확립해야한다(10). 따라서본 연구에서는 ellagic acid의 품질관리 표준화할 수 있도록 HPLC를 이용한 분석법을 확립하고자 하였다.
본 연구에서는 건강기능식품으로서 고창복분자의 개별인 정형 원료 표준화를 위하여 복분자 미숙과 추출물 속에 존재하는 ellagic acid를 지표성분으로 선정하였고, HPLC를 이용한 분석법 설정과 확립된 분석법에 대한 밸리데이션을 실시하고자 하였다. 최근의 ellagic acid 분석법에는 DAD(diode array detector)를 이용하거나 질량분석기(mass spectrometry)를 이용한 방법들이 있으며, 국내에서 복분자내의 지표성분으로서 ellagic acid의 표준화를 위해서는 가장 범용적인 장비를 이용한 분석법을 확립해야한다(10).
특이성 실험은 여러 가지 다른 성분들이 혼합되어 있는 복분자 분말 중에 ellagic acid만을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는지를 확인하기 위해 실시하였다. HPLC를 이용하여 표준용액에서의 ellagic acid와 추출물에서의 크로마토 그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 확인하였는데 농도별로 같은 머무름 시간에 분석되었다.
제안 방법
1% formic acid가 첨가된 water와 acetonitrile을 이동상으로 하고 Symmetry® (C18, 4.6 × 250 mm, 5.0 μm) 칼럼을 사용하여 기울기용리(gradient elution) 방법으로 분석하였다.
HPLC를 이용하여 표준용액에서의 ellagic acid와 추출물에서의 크로마토 그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 확인하였는데 농도별로 같은 머무름 시간에 분석되었다. Ellagic acid 표준용액과 고창복분자 시료 전처리 시험용액의 sepctrum이 동일하고, 크로마토그램상의 머무름 시간이 Fig. 1과 같이 22.2분대로 동일하여 특이성을 확인하였다. 이 결과는 Dhooghe 등(11)이 HPLC를 이용하여 P hyllanthus amarus 추출물에 서의 ellagic acid를 분석하였을 때 머무름 시간이 27분대였던 것에 비하여 비교적 빠른 분석시간이었다.
검량선 작성을 위해 10 μg/mL의 표준용액을 methanol을 이용하여 순차적으로 희석하여 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 8 μg/mL로 조제하였다. Ellagic acid의 함량을 구하기 위하여 표준용 액의 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 농도별 면적에 대하여 검량선을 작성하였다.
HPLC 분석에서 칼럼은 Symmetry®(C18, 4.6 × 250 mm, 5.0 μm, Waters, Milford, MA, USA) 를 사용하였고, UV/VIS 검출기를 가진 Gilson GX-281 Preparative HPLC System(Middleton, WI, USA)을 사용하 였다.
회수율(recovery): 알고 있는 농도(1, 2, 4, 8, 10 μg/mL) 의 ellagic acid 표준물질을 시료에 넣은 후 분석에 의해 회수 되는 회수율을 측정하였다. HPLC로 세 농도의 세 반복 실험을 통하여 회수되는 정도를 확인하였고, 회수율은 백분율로 계산하였다.
특이성 실험은 여러 가지 다른 성분들이 혼합되어 있는 복분자 분말 중에 ellagic acid만을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는지를 확인하기 위해 실시하였다. HPLC를 이용하여 표준용액에서의 ellagic acid와 추출물에서의 크로마토 그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 확인하였는데 농도별로 같은 머무름 시간에 분석되었다. Ellagic acid 표준용액과 고창복분자 시료 전처리 시험용액의 sepctrum이 동일하고, 크로마토그램상의 머무름 시간이 Fig.
정확성은 기지량의 분석물질을 함유한 intra-day 와 inter-day 시료를 반복 측정하여 결과값이 참값에 근접한정도를 백분율로 나타내었다. Intra-day의 정밀성은 하루 동안 일정농도의 표준용액을 HPLC로 5회 분석하여 그 변이성을 측정하였으며, inter-day의 정밀성은 intra-day의 과정을 5일 동안 반복하여 그 변이성을 측정하였다. 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 표준편차를 평균으로나누어 백분율로 계산하였다.
45 μm syringe filter로 여과하여 2배 희석하여 시험용액으로 사용하였다. 각 시료는 세 번씩 반복 분석하였다. 표준용액의 크로마토그램의 피크 면적을 통하여 작성된 검량선에 의해 복분자 추출물 시료 중 ellagic acid의 농도를 산출하였다.
검량선 작성을 위해 10 μg/mL의 표준용액을 methanol을 이용하여 순차적으로 희석하여 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 8 μg/mL로 조제하였다.
검체 중 일정 농도 범위에 있는 ellagic acid의 양에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는지 실험한 시험으로 ellagic acid 표준원액을 단계적으로 희석하여 직선성을 확인하 였다. 표준검량선은 Fig.
고창 복분자의 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발하기 위하여 지표성분 표준화를 위한 ellagic acid의 분석법 설정과 분석법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 1% formic acid가 첨가된 water와 acetonitrile을 이동상으로 하고 Symmetry® (C18, 4.
균일한 시료로부터 여러 번 채취하여 시험했을 때 시험결과 간의 근접성을 확인하였다. 일내 반복성은 하루에 표준용 액을 5번 분석하여 측정하였고, 5일 동안 반복 분석하여 일간 반복성을 시험하여 RSD로 나타내었다(Table 2).
0 μm) 칼럼을 사용하여 기울기용리(gradient elution) 방법으로 분석하였다. 본 연구에서는 분석법을 확립하고 분석법에 대하여 특이성, 직선성, 정확성과 정밀성 그리고 회수율에 대하여 확인하였다. Ellagic acid의 검량선은 R2 =0.
이동상 A에는 1% formic acid(Fisher Scientific Korea)가 첨가된 water(Fisher Scientific Korea)를, 이동상 B 에는 acetonitrile(Fisher Scientific Korea)를 이용하였다. 분석시간은 0분에서 7분까지 이동상 A를 90%로 용리하였고, 7분에서 28분까지 이동상 B가 55%가 되도록 한 다음, 28분에서 32분까지 이동상 B를 70%로 유지하고, 32분에서 40분까지 이동상 B를 10%를 유지하면서 0.5 mL/min의 유속으로 분석을 실시하였다. UV는 254 nm 파장에서 측정하였으며 시료 주입량은 10 μL를 사용하였다.
실험결과가 참값이나 표준값이 근접한 정도를 측정하였다. 정확성 결과는 Table 2와 같이 intra-day 분석에서 98.
균일한 시료로부터 여러 번 채취하여 시험했을 때 시험결과 간의 근접성을 확인하였다. 일내 반복성은 하루에 표준용 액을 5번 분석하여 측정하였고, 5일 동안 반복 분석하여 일간 반복성을 시험하여 RSD로 나타내었다(Table 2). Ellagic acid 표준물질에 대하여 일내와 일간 모두 RSD≤5%로 HPLC 분석의 재현성을 확인하였다.
각 시료는 세 번씩 반복 분석하였다. 표준용액의 크로마토그램의 피크 면적을 통하여 작성된 검량선에 의해 복분자 추출물 시료 중 ellagic acid의 농도를 산출하였다.
회수율(recovery): 알고 있는 농도(1, 2, 4, 8, 10 μg/mL) 의 ellagic acid 표준물질을 시료에 넣은 후 분석에 의해 회수 되는 회수율을 측정하였다.
33%로 참값에서 15%를 벗어나지 않는 정확성을 보였다. 회수율은 이미 알고 있는 농도의 ellagic acid 표준용액을 검체에 넣은 후분석에 의해 회수되는 양을 백분율로 계산하였다. Ellagic acid 성분의 회수율은 89.
대상 데이터
UV는 254 nm 파장에서 측정하였으며 시료 주입량은 10 μL를 사용하였다.
고창 복분자연구소로부터 분양받은 세 lot의 고창 복분자 미숙과 분말 0.5 g씩을 water 100 mL로 100℃에서 환류추출하였고, 0.45 μm syringe filter로 여과하여 2배 희석하여 시험용액으로 사용하였다.
본 실험에 사용한 복분자 열매는 전라북도 고창군에서 재배된 미성숙한 과실로서 6월에 채취하여 열수추출 동결건조 분말화를 하여 -20℃에서 냉동 보관한 것을 고창 복분자연 구소로부터 분양받아 사용하였다. 복분자 추출물 분말은 동일한 제조공정에 따라 생산된 것으로 3개의 lot를 분양받았다.
본 실험에 사용한 복분자 열매는 전라북도 고창군에서 재배된 미성숙한 과실로서 6월에 채취하여 열수추출 동결건조 분말화를 하여 -20℃에서 냉동 보관한 것을 고창 복분자연 구소로부터 분양받아 사용하였다. 복분자 추출물 분말은 동일한 제조공정에 따라 생산된 것으로 3개의 lot를 분양받았다.
본 실험에서 ellagic acid(purity 99%) 표준품과 ellagic acid를 녹이기 위해 사용한 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 표준품 ellagic acid를 DMSO로 녹여 1 mg/mL가 되도록 표준원액을 제조한 후 methanol(Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)로 희석하여 10 μg/mL의 표준용액을 제조하였다.
0 μm, Waters, Milford, MA, USA) 를 사용하였고, UV/VIS 검출기를 가진 Gilson GX-281 Preparative HPLC System(Middleton, WI, USA)을 사용하 였다. 이동상 A에는 1% formic acid(Fisher Scientific Korea)가 첨가된 water(Fisher Scientific Korea)를, 이동상 B 에는 acetonitrile(Fisher Scientific Korea)를 이용하였다. 분석시간은 0분에서 7분까지 이동상 A를 90%로 용리하였고, 7분에서 28분까지 이동상 B가 55%가 되도록 한 다음, 28분에서 32분까지 이동상 B를 70%로 유지하고, 32분에서 40분까지 이동상 B를 10%를 유지하면서 0.
데이터처리
Intra-day의 정밀성은 하루 동안 일정농도의 표준용액을 HPLC로 5회 분석하여 그 변이성을 측정하였으며, inter-day의 정밀성은 intra-day의 과정을 5일 동안 반복하여 그 변이성을 측정하였다. 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 표준편차를 평균으로나누어 백분율로 계산하였다.
성능/효과
Ellagic acid 표준물질에 대하여 일내와 일간 모두 RSD≤5%로 HPLC 분석의 재현성을 확인하였다.
본 시험법의 검증과정을 통하여 ellagic acid에 대한 상기 HPLC 분석법이 기능성 원료 인증을 받기 위한 고창복분자 내의 ellagic acid의 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다. 검증된 분석법으로 고창 복분자연구소로부터 분양받은 세 lot의 미숙과 건조분말의 함량을 측정한 결과 분말 중 ellagic acid 함량의 평균은 0.192%, 기준값은 0.192%의 80～120%로 기준 규격을 설정하였을 때(13), 함량은 0.15～0.23%였다 (Table 4).
본 시험법에 따라 분석한 고창 미숙과 복분자 추출물 내의 ellagic acid의 함량은 세 lot를 3번씩 분석하였을때 약 1.92 μg/mg(0.192%)이 나왔으며 RSD값은 2.36% 이하였다.
본 시험법의 검증과정을 통하여 ellagic acid에 대한 상기 HPLC 분석법이 기능성 원료 인증을 받기 위한 고창복분자 내의 ellagic acid의 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다. 검증된 분석법으로 고창 복분자연구소로부터 분양받은 세 lot의 미숙과 건조분말의 함량을 측정한 결과 분말 중 ellagic acid 함량의 평균은 0.
후속연구
36% 이하였다. 따라서 본 연구를 통하여 확립된 ellagic acid의 분석 법이 고창 복분자의 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 본다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
복분자 열매의 각종 생리활성 물질과 기능성의 예는?
이러한 복분자의 효능에 대한 관심이 증대됨에 따라 복분자 열매의 각종 생리활성 물질과 기능성에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 복분자 열매에 존재하는 생리활성 물질의 종류로는 sanguiin H-4, gallic acid, quercetin, ellagic acid 및 다양한 페놀산 등이 있다(4). 특히, ellagic acid는 raspberry나 strawberry 등과 같은 다양한 과일과 채소에 있는 폴리페놀화합물로서 항암작용과 항산화작용, 항섬유화작용을 나타내는 것으로 과거 연구 결과 알려졌으며, ellagic acid 의 항암작용은 일부 암을 대상으로 연구한 결과 전립선암세포, 자궁경부암세포, 대장암세포, 구강암과 백혈병 세포에서 항암효과와 세포자살을 방지하는 효과(anti-apoptotic effect)를 나타내는 것으로 알려져 있다(5-7).
복분자란?
복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과(Rosaceae)의낙엽활엽 덩굴성 식물로 중국이 원산지로 알려져 있으며, 한국, 중국, 일본 등지에서 자생하고 전 세계 약 700종이 분포하고 있다(1). 우리나라에서는 중남부지역이 주요산지로, 특히 전북 고창군은 전국 생산량의 51.
전북 고창군의 복분자 생산량 비중은?
복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과(Rosaceae)의낙엽활엽 덩굴성 식물로 중국이 원산지로 알려져 있으며, 한국, 중국, 일본 등지에서 자생하고 전 세계 약 700종이 분포하고 있다(1). 우리나라에서는 중남부지역이 주요산지로, 특히 전북 고창군은 전국 생산량의 51.2%를 차지할 정도로 전국 최대의 복분자 생산지이다. 복분자는 주로 초여름에 검붉은 열매를 수확하여 식용하고 있으나, 예로부터 한방에 서는 복분자의 미성숙 과실을 사용하였다(2).
참고문헌 (13)
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Bae GH. 2000. The medicinal plant of Korea. Kyohasa Publishing Co., Ltd, Seoul, Korea. p 231.
Jeong JS, Sin MK. 1996. Encyclopedia of oriental medical. Young Rim Republ., Seoul, Korea. p 461.
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Seeram NP, Adams LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG, Heber D. 2005. In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegrante juice. J Nutr Biochem 16: 360-367.
Saleem A, Husheem M, Harkonen P, Pihlaja K. 2002. Inhibition of cancer cell growth by crude extract and the phenolics of Terminalia chebuta retz. fruit. J Ethnopharmacol 81: 327-336.
Mertens-Talcott SU, Percival SS. 2005. Ellagic acid and quercetin interact synergistically with resveratrol in the induction of apoptosis and cause transient cell cycle arrest in huamn leukemia cells. Cancer Lett 218: 141-151.
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KFDA. 2004. Analytical method guideline about validation of drugs and etc. Korea Food & Drug Administration. p 1-18.
Mertz C, Cheynier V, Gunata Z, Brat P. 2007. Analysis of phenolic compounds in two blackberry species (Rubus glaucus and Rubus adenotrichus) by high-performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ion trap mass spectrometry. J Agric Food Chem 55: 8616-8624.
Panichayupakarananta P, Issuriya A, Sirikatitham A, Wang W. 2010. Antioxidant assay-guided purification and LC determination of ellagic acid in pomegranate peel. J Chromatogr Sci 48: 456-459.
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